Nghiên cứu khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế ở Yên Bái

Luận văn đánh giá khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế tại Yên Bái, nghiên cứu tiềm năng ứng dụng trong y học và nông nghiệp.

• Tác giả: Hoàng Thị Tròn
• Người hướng dẫn: TS. Phí Quyết Tiến
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Đánh Giá Khả Năng Sinh Kháng Sinh Của Xạ Khuẩn Nội Cộng Sinh Trên Cây Quế Tại Yên Bái
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp đại học
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.2. Ý nghĩa của đề tài
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Xạ khuẩn nội cộng sinh trên thực vật
• 2.2. Xạ khuẩn nội cộng sinh và mối tương tác giữa xạ khuẩn với cây chủ
• 2.3. Đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn
• 2.3.1. Đặc điểm hình thái tế bào, bào tử
• 2.3.2. Đặc điểm sinh lý – sinh hóa
• 2.3.3. Phân loại xạ khuẩn bằng phân tích trình tự gen 16S rDNA
• 2.4. Tiềm năng ứng dụng của xạ khuẩn nội cộng sinh
• 2.4.1. Kháng ung thư và kháng viêm
• 2.4.2. Kích thích sinh trưởng
• 3. PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
• 3.1. Vật liệu nghiên cứu
• 3.2. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
• 3.3. Môi trường nuôi cấy
• 3.4. Địa điểm và thời gian tiến hành
• 3.5. Nội dung nghiên cứu
• 3.6. Phương pháp nghiên cứu
• 3.6.1. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật
• 3.6.2. Xác định khả năng sinh anthracyline
• 3.6.3. Khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS của xạ khuẩn
• 3.6.4. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một chủng xạ khuẩn
• 3.6.5. Phân loại chủng xạ khuẩn YBQ75 dựa trên phân tích trình tự gen 16S rDNA
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật
• 4.2. Xác định gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS tham gia sinh tổng hợp kháng sinh
• 4.3. Sàng lọc xạ khuẩn sinh kháng sinh thuộc nhóm anthraycycline
• 4.4. Đặc điểm sinh học và phân loại của chủng xạ khuẩn YBQ75
• 4.5. Đặc điểm hình thái và bề mặt chuỗi bào tử của xạ khuẩn YBQ75
• 4.6. Đặc điểm sinh hóa của xạ khuẩn YBQ75
• 4.7. Khuếch đại và phân tích trình tự gen 16S rDNA của xạ khuẩn YBQ75
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC 1

Tóm tắt

I. Giới thiệu

Nghiên cứu về khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế tại Yên Bái đã trở thành một chủ đề quan trọng trong lĩnh vực vi sinh vật học. Việc tìm kiếm các nguồn kháng sinh mới từ tự nhiên là cần thiết, đặc biệt trong bối cảnh vi khuẩn kháng thuốc ngày càng gia tăng. Cây quế, với đặc tính sinh học phong phú, là môi trường lý tưởng cho sự phát triển của vi sinh vật nội cộng sinh. Nghiên cứu này không chỉ nhằm đánh giá khả năng kháng vi sinh vật của các chủng xạ khuẩn mà còn xác định sự hiện diện của các gen liên quan đến tổng hợp kháng sinh, như PKS-I, PKS-II và NRPS.

1.1. Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chính của nghiên cứu là đánh giá khả năng kháng vi sinh vật của các chủng xạ khuẩn nội cộng sinh thu thập từ cây quế tại Yên Bái. Nghiên cứu sẽ tập trung vào việc xác định các gen mã hóa cho khả năng sinh kháng sinh, từ đó mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các loại kháng sinh tự nhiên. Việc này không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn có giá trị thực tiễn trong việc tìm kiếm các hợp chất kháng sinh mới từ nguồn tài nguyên thiên nhiên.

II. Tổng quan tài liệu

Tổng quan về xạ khuẩn nội cộng sinh cho thấy sự đa dạng và tiềm năng ứng dụng của chúng trong việc sản xuất các hợp chất kháng sinh. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng xạ khuẩn có khả năng sinh ra nhiều loại kháng sinh khác nhau, bao gồm cả nhóm anthracycline. Sự tương tác giữa xạ khuẩn và cây chủ không chỉ giúp cây phát triển mà còn tạo ra các sản phẩm có hoạt tính sinh học. Việc nghiên cứu về kháng sinh tự nhiên từ xạ khuẩn trên cây quế có thể mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các loại thuốc kháng sinh hiệu quả.

2.1. Khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn

Khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội cộng sinh được xác định thông qua việc phân lập và kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng ức chế sự phát triển của các vi sinh vật gây bệnh. Việc xác định các gen như PKS-I, PKS-II và NRPS là rất quan trọng trong việc hiểu rõ cơ chế sinh tổng hợp kháng sinh. Những phát hiện này không chỉ có giá trị trong nghiên cứu mà còn có thể ứng dụng trong sản xuất các loại thuốc kháng sinh mới.

III. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện thông qua việc thu thập mẫu từ cây quế tại Yên Bái và phân lập các chủng xạ khuẩn nội cộng sinh. Các phương pháp nuôi cấy và phân tích gen được áp dụng để xác định khả năng sinh kháng sinh của các chủng này. Việc sử dụng các phương pháp hiện đại như PCR giúp xác định sự hiện diện của các gen liên quan đến tổng hợp kháng sinh. Kết quả từ nghiên cứu sẽ cung cấp thông tin quý giá về khả năng kháng vi sinh vật của xạ khuẩn và tiềm năng ứng dụng trong y dược.

3.1. Tuyển chọn và phân lập xạ khuẩn

Quá trình tuyển chọn và phân lập các chủng xạ khuẩn được thực hiện bằng cách sử dụng các môi trường nuôi cấy đặc biệt. Các chủng được phân lập sẽ được kiểm tra khả năng kháng vi sinh vật thông qua các thử nghiệm in vitro. Kết quả từ các thử nghiệm này sẽ giúp xác định các chủng có hoạt tính kháng sinh mạnh, từ đó tiến hành phân tích gen để tìm hiểu cơ chế sinh tổng hợp kháng sinh.

IV. Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy nhiều chủng xạ khuẩn nội cộng sinh có khả năng sinh kháng sinh mạnh, đặc biệt là các chủng thuộc nhóm anthracycline. Việc phân tích gen cho thấy sự hiện diện của các gen PKS-I, PKS-II và NRPS, cho thấy tiềm năng sản xuất kháng sinh từ các chủng này. Những phát hiện này không chỉ khẳng định giá trị của xạ khuẩn trong việc phát triển kháng sinh mới mà còn mở ra hướng nghiên cứu mới trong việc khai thác nguồn tài nguyên vi sinh vật từ thiên nhiên.

4.1. Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật

Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật của các chủng xạ khuẩn cho thấy sự đa dạng trong hoạt tính kháng sinh. Các chủng có khả năng ức chế mạnh đối với nhiều loại vi sinh vật gây bệnh, cho thấy tiềm năng ứng dụng trong y dược. Kết quả này khẳng định rằng xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế tại Yên Bái là nguồn tài nguyên quý giá cho việc phát triển các loại kháng sinh mới.

V. Kết luận và kiến nghị

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế tại Yên Bái có khả năng sinh kháng sinh mạnh, với sự hiện diện của các gen liên quan đến tổng hợp kháng sinh. Kết quả này mở ra hướng đi mới trong việc khai thác nguồn tài nguyên vi sinh vật tự nhiên để phát triển các loại kháng sinh mới. Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về cơ chế sinh tổng hợp và khả năng ứng dụng của các hợp chất này trong thực tiễn.

5.1. Kiến nghị cho nghiên cứu tiếp theo

Để phát huy tiềm năng của xạ khuẩn nội cộng sinh, cần có các nghiên cứu tiếp theo nhằm xác định rõ hơn về cơ chế sinh tổng hợp kháng sinh. Việc nghiên cứu sâu về các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh kháng sinh của các chủng này cũng rất cần thiết. Đồng thời, cần có các nghiên cứu ứng dụng để phát triển các sản phẩm kháng sinh từ xạ khuẩn phục vụ cho y dược.

Trích đoạn nội dung tài liệu

đặt vấn đề, xử lý vần đề, phương pháp nghiên cứu một vấn đề khoa học, xử lý, phân tích số liệu, trình bày đề tài khoa học. 4 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Xạ khuẩn nội cộng sinh trên thực vật 2. Xạ khuẩn nội cộng sinh và mối tương tác giữa xạ khuẩn với cây chủ Hiện nay, trên thế giới có nhiều công trình nghiên cứu công bố về mối quan hệ giữa thực vật và vi sinh vật (VSV), trong đó VSV đóng vai trò như tác nhân kiểm soát sinh học, tổng hợp các chất kích thích sinh trưởng, phân giải phospho khó hoà tan, cố định nitơ tự do, tăng độ phì của đất.

Kể từ khi Smith phân lập thành công chủng xạ khuẩn Micromonospora sp. có khả năng ức chế nấm bệnh Fusarium oxysporum trong mô tế bào cà chua không nhiễm bệnh, đã có nhiều định nghĩa về VSV nội cộng sinh. Hiện nay, định nghĩa của Bacon và White (2000): "VSV nội cộng sinh là những VSV sinh trưởng trong mô tế bào thực vật, mà không gây ra những hiệu ứng xấu nào tới cây chủ" đã được các nhà vi sinh vật học thừa nhận [8]. Theo tài liệu, định nghĩa này hàm chứa một ý rất quan trọng: VSV nội cộng sinh không những không gây ảnh hưởng mà còn tăng cường khả năng trao đổi chất, kích thích sinh trưởng, miễn dịch cho vật chủ bằng cách tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất.[14] Những nghiên cứu trên thế giới đã khẳng định vai trò của xạ khuẩn trong sinh tổng hợp chất kháng sinh.

Sự đa dạng của xạ khuẩn cộng sinh trong cây dược liệu là vô cùng phong phú, hứa hẹn tiềm năng ứng dụng các hợp chất có hoạt tính sinh học do các chủng xạ khuẩn này sinh ra trong mọi lĩnh vực của đời sống. Các hợp chất có hoạt tính sinh học được chứng minh là rất đa dạng về mặt số lượng và hoạt tính sinh học như các chất kiểm soát sinh học, chất kháng VSV gây bệnh, kháng khối u, chống oxy hóa, chống sốt rét, chất diệt cỏ, chất kích thích sinh trưởng. Vì vậy, nghiên cứu sàng lọc các hợp 5 chất có hoạt tính sinh học nói chung và hoạt tính kháng sinh nói riêng từ xạ khuẩn cộng sinh trên cây dược liệu tự nhiên đang là hướng nghiên cứu triển vọng của các nhà khoa học trên thế giới. Khi nghiên cứu về xạ khuẩn nội cộng sinh, câu hỏi được đặt ra là làm sao xạ khuẩn có thể xâm nhập vào cây chủ? Và làm thế nào xạ khuẩn có thể sinh trưởng trong các bộ phận của cây và mô tế bào? Để làm sáng tỏ câu hỏi trên, các nhà khoa học đã gây nhiễm chủng Streptomyces scabies trên bề mặt củ khoai tây.

Sau 4-6 ngày, chủng Streptomyces scabies hình thành mạng lưới phủ trên bề mặt củ khoai tây và xâm nhập vào củ thông qua lỗ trên bề mặt vỏ non hay vết thương khi khoai tây đang trong giai đoạn phát triển. Nối tiếp thí nghiệm trên, tiến hành lây nhiễm chủng S. ipomoeae trên rễ khoai tây đã cho kết quả tương tự. Từ kết quả nghiên cứu trên các nhà vi sinh vật học đã khẳng định rằng hầu hết xạ khuẩn hình thành hệ sợi phát triển trên bề mặt cây và xâm nhập vào vật chủ thông qua các lỗ hở tự nhiên hay tổn thương do côn trùng [26].

Xạ khuẩn nội cộng sinh xâm nhập vào cây chủ rất sớm và ảnh hưởng đến sự phát triển của vật chủ. Gần đây, Franco (2007) đã quan sát khuẩn lạc của chủng xạ khuẩn EN27-GFP ở rễ tinh, đặc biệt tại các điểm nối, các vết nứt xung quanh rễ hình thành bào tử trong 3-4 tuần [13]. Kết quả cho thấy sự lây nhiễm chủng xạ khuẩn vào rễ cây thông qua các đường nứt trên rễ và sau đó nhân lên trong các mô tế bào. Trong nghiên cứu của mình, Shimizu và cộng sự đã ủ Streptomyces sp.

MBCu-56 trên lá dưa chuột, theo dõi sự phát triển. Ban đầu, khuẩn ty phát triển mạnh trên bề mặt lá và hình thành khối hệ sợi dày đặc nhất là ở nhánh phân chia các tế bào biểu bì. Một số sợi đã xâm nhập lớp biểu bì và phát triển sang các tế bào biểu bì khác (Hình 2. Tuy nhiên, quan sát của họ không đủ để chứng minh sự tăng trưởng ở nội bào trong lớp biểu bì [30].

6 Năm 2005, Suzuki và cộng sự đã chứng minh quá trình xâm nhập vào mô lá cây đỗ quyên của chủng S. galbus MBR-5 và xác nhận rằng hệ sợi của chủng xâm nhiễm vào mô tế bào lá đã bị tổn thương thông qua các lỗ không khí. Ngoài ra, chủng MBR-5 được chứng minh là có khả năng sinh các enzyme thủy phân cellulase, xylanase và pectinase. Hỗn hợp enzyme từ khuẩn ty tăng cường khả năng bám dính [46].1: Ảnh quét hiển vi điện tử của bề mặt lá dƣa chuột sau 8 ngày gây nhiễm với Streptomyces sp.

(A) Hệ sợi trên bề mặt lá. (B) Hệ sợi của xạ khuẩn xâm nhập và phát triển trên, dƣới bề mặt của lớp biểu bì. Đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn Theo hệ thống phân loại hiện nay xạ khuẩn thuộc nhóm Prokaryota, thuộc giới Monera trong hệ 5 giới của Whittaken, còn theo hệ thống phân loại chia sinh giới thành 7 giới thì xạ khuẩn thuộc giới Prokaryota [1]. Xạ khuẩn nội cộng sinh sống trong các cơ quan khác nhau (rễ, thân, lá, hoa, quả và hạt) của cây chủ và chủ yếu cư trú trong khoảng không giữa các mô hoặc nội bào.

Đáng chú ý, thực vật có khoảng 300.000 loài trên trái đất, mỗi loài thực vật là nơi cư trú của rất nhiều loài xạ khuẩn nội cộng sinh. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn * Đặc điểm hình thái tế bào, bào tử Năm 1957, Gauze và cộng sự đã công bố hệ thống phân loại mới. Hệ thống này dựa vào màu sắc khuẩn ty khí sinh (KTKS), khuẩn ty cơ chất (KTCC), hình dạng bào tử và cuống sinh bào tử. Hệ thống này cũng được chỉnh lí và tái bản năm 1983.

Số lượng hệ thống phân loại xạ khuẩn ngày một tăng trong những năm gần. Đó là hình thức phân loại truyền thống dựa trên đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy. Theo Pridham và cộng sự chia cuống sinh bào tử xạ khuẩn chia thành 3 nhóm: RF cho những cuống sinh bào tử thẳng và lượn sóng; RA cho những cuống sinh bào tử xoắn, thô sơ và ngắn; S cho những cuống sinh bào tử phát triển mạnh và xoắn. Bề mặt bào tử thành 5 dạng chính Sm (trơn nhẵn), sp (gai), wa (xù xì), ru ( nếp nhăn), ha (tóc) [41].

* Đặc điểm sinh lý – sinh hóa Đặc điểm sinh lý, sinh hóa là khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và nitơ, nhu cầu các chất kích thích sinh trưởng, khả năng biến đổi các chất khác nhau nhờ hệ thống enzyme. Ngoài ra còn có nhu cầu về oxy, giới hạn pH, nhiệt độ tối ưu, khả năng chịu muối và các yếu tố khác của môi trường, mối quan hệ với chất kìm hãm sinh trưởng và phát triển khác nhau, tính chất đối kháng và nhạy cảm với chất kháng sinh, khả năng tạo thành chất kháng sinh và các sản phẩm trao đổi chất đặc trưng khác của xạ khuẩn. Phân loại xạ khuẩn bằng phân tích trình tự gen 16S rDNA Từ những năm 80 trở lại đây, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, các nhà khoa học đã có một công cụ mới để phân loại sinh vật đó là phân loại học phân tử. Phương pháp này có ưu điểm là thời gian ngắn và có độ chính xác cao.

Phân loại học phân tử có thể dựa trên các gen hoặc các sản phẩm của gen. Trong hệ thống phân loại xạ khuẩn hiện nay, thường sử dụng 3 8 phương pháp chính là lai DNA, lai RNA và phân tích trình tự gen mã hóa 16S rDNA [1]. Hiện nay, việc nghiên cứu rDNA là phương pháp hữu hiệu nhất để xác định mối quan hệ trên cây phát sinh chủng loại, vì rDNA có mặt trong tất cả các sinh vật, có chức năng xác định và có tính bảo thủ cao [33]. Chúng chỉ khác nhau rất ít giữa các nhóm sinh vật.

Tuy nhiên, dựa vào sự khác nhau này người ta có thể đánh giá được mối quan hệ phát sinh chủng loại và phân loại các chủng VSV. Trong tế bào VSV nhân sơ, ribosome tồn tại trong tế bào chất. Ribosome có cấu trúc gồm 2 tiểu phần, mỗi tiểu phần gồm có rDNA và protein riêng rẽ. Ribosome là VSV nhân sơ có hằng số lắng 70S gồm 2 tiểu đơn vị 50S (gồm rDNA 5S, rDNA 23S và 31 phân tử protein) và 30S (gồm rDNA 16S và 21 phân tử protein) [1].

Các gen mã hóa 5S rSNA, 16S rDNA, 23S rDNA nằm cạnh nhau, có cùng một operon và có cơ chế điều hòa chung. Trong các loại rDNA thì 16S rDNA là phù hợp nhất cho nghiên cứu phân loại xạ khuẩn vì gen mã hóa 16S rDNA có kích thước khoảng 1540 bp phù hợp cho nghiên cứu phân loại; còn gen mã hóa 5S rDNA có kích thước khoảng 120 bp, tuy dễ xác định trình tự nhưng lại không đặc hiệu cho phân loại; còn gen mã hóa 23S rDNA cũng là một gen tiềm năng cho phân tích so sánh trình tự để phân loại sinh vật nhân sơ nhưng trình tự của gen này lại tương đối lớn 2900 bp, gây khó khăn cho tách dòng và phân tích trình tự nên ít được sử dụng hơn. Keswani và cộng sự đã chứng minh rằng nếu sự tương đồng giữa hai trình tự 16S rDNA là 98,6% thì xác suất để mức độ giống trong phép lai DNA thấp hơn 70% sẽ là 99% [44]. Vì thế giá trị tương đồng 98,6% của trình tự 16S rDNA được coi là ngưỡng để phân biệt hai loài khác nhau.

Tiềm năng ứng dụng của xạ khuẩn nội cộng sinh * Kháng ung thư và kháng viêm 9 Trong những năm gần đây, nhu cầu tìm kiếm chất có hoạt tính kháng và ức chế tế bào ung thư từ chủng xạ khuẩn nội cộng sinh đang là hướng đi mới của các nhà khoa học. Nhiều công bố khẳng định, xạ khuẩn nội cộng sinh sống có mối quan hệ phức tạp, chặt chẽ với cây chủ [43]. Một giả thuyết được đưa ra rằng gen mã hóa cho chất có hoạt tính sinh học được sinh ra từ quá trình trao đổi giữa vi sinh vật và thực vật thông qua hệ thống chuyển gen ngang (horizontal gene transfer, HGT). Do đó, có thể sản xuất các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật nhờ quá trình nuôi cấy VSV, ví dụ như chất kháng tế bào ung thư paclitaxel phổ biến trên cây thông đỏ (Taxus sp.) được tách chiết từ chủng xạ khuẩn Kitasatospora sp.