Nghiên cứu khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế ở Yên Bái

Luận văn đánh giá khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế tại Yên Bái, nghiên cứu tiềm năng ứng dụng trong y học và nông nghiệp.

• Tác giả: Hoàng Thị Tròn
• Người hướng dẫn: TS. Phí Quyết Tiến
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Đánh Giá Khả Năng Sinh Kháng Sinh Của Xạ Khuẩn Nội Cộng Sinh Trên Cây Quế Tại Yên Bái
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp đại học
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.2. Ý nghĩa của đề tài
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Xạ khuẩn nội cộng sinh trên thực vật
• 2.2. Xạ khuẩn nội cộng sinh và mối tương tác giữa xạ khuẩn với cây chủ
• 2.3. Đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn
• 2.3.1. Đặc điểm hình thái tế bào, bào tử
• 2.3.2. Đặc điểm sinh lý – sinh hóa
• 2.3.3. Phân loại xạ khuẩn bằng phân tích trình tự gen 16S rDNA
• 2.4. Tiềm năng ứng dụng của xạ khuẩn nội cộng sinh
• 2.4.1. Kháng ung thư và kháng viêm
• 2.4.2. Kích thích sinh trưởng
• 3. PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
• 3.1. Vật liệu nghiên cứu
• 3.2. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
• 3.3. Môi trường nuôi cấy
• 3.4. Địa điểm và thời gian tiến hành
• 3.5. Nội dung nghiên cứu
• 3.6. Phương pháp nghiên cứu
• 3.6.1. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật
• 3.6.2. Xác định khả năng sinh anthracyline
• 3.6.3. Khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS của xạ khuẩn
• 3.6.4. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một chủng xạ khuẩn
• 3.6.5. Phân loại chủng xạ khuẩn YBQ75 dựa trên phân tích trình tự gen 16S rDNA
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật
• 4.2. Xác định gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS tham gia sinh tổng hợp kháng sinh
• 4.3. Sàng lọc xạ khuẩn sinh kháng sinh thuộc nhóm anthraycycline
• 4.4. Đặc điểm sinh học và phân loại của chủng xạ khuẩn YBQ75
• 4.5. Đặc điểm hình thái và bề mặt chuỗi bào tử của xạ khuẩn YBQ75
• 4.6. Đặc điểm sinh hóa của xạ khuẩn YBQ75
• 4.7. Khuếch đại và phân tích trình tự gen 16S rDNA của xạ khuẩn YBQ75
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC 1

Tóm tắt

I. Giới thiệu

Nghiên cứu về khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế tại Yên Bái đã trở thành một chủ đề quan trọng trong lĩnh vực vi sinh vật học. Việc tìm kiếm các nguồn kháng sinh mới từ tự nhiên là cần thiết, đặc biệt trong bối cảnh vi khuẩn kháng thuốc ngày càng gia tăng. Cây quế, với đặc tính sinh học phong phú, là môi trường lý tưởng cho sự phát triển của vi sinh vật nội cộng sinh. Nghiên cứu này không chỉ nhằm đánh giá khả năng kháng vi sinh vật của các chủng xạ khuẩn mà còn xác định sự hiện diện của các gen liên quan đến tổng hợp kháng sinh, như PKS-I, PKS-II và NRPS.

1.1. Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chính của nghiên cứu là đánh giá khả năng kháng vi sinh vật của các chủng xạ khuẩn nội cộng sinh thu thập từ cây quế tại Yên Bái. Nghiên cứu sẽ tập trung vào việc xác định các gen mã hóa cho khả năng sinh kháng sinh, từ đó mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các loại kháng sinh tự nhiên. Việc này không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn có giá trị thực tiễn trong việc tìm kiếm các hợp chất kháng sinh mới từ nguồn tài nguyên thiên nhiên.

II. Tổng quan tài liệu

Tổng quan về xạ khuẩn nội cộng sinh cho thấy sự đa dạng và tiềm năng ứng dụng của chúng trong việc sản xuất các hợp chất kháng sinh. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng xạ khuẩn có khả năng sinh ra nhiều loại kháng sinh khác nhau, bao gồm cả nhóm anthracycline. Sự tương tác giữa xạ khuẩn và cây chủ không chỉ giúp cây phát triển mà còn tạo ra các sản phẩm có hoạt tính sinh học. Việc nghiên cứu về kháng sinh tự nhiên từ xạ khuẩn trên cây quế có thể mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các loại thuốc kháng sinh hiệu quả.

2.1. Khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn

Khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội cộng sinh được xác định thông qua việc phân lập và kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng ức chế sự phát triển của các vi sinh vật gây bệnh. Việc xác định các gen như PKS-I, PKS-II và NRPS là rất quan trọng trong việc hiểu rõ cơ chế sinh tổng hợp kháng sinh. Những phát hiện này không chỉ có giá trị trong nghiên cứu mà còn có thể ứng dụng trong sản xuất các loại thuốc kháng sinh mới.

III. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện thông qua việc thu thập mẫu từ cây quế tại Yên Bái và phân lập các chủng xạ khuẩn nội cộng sinh. Các phương pháp nuôi cấy và phân tích gen được áp dụng để xác định khả năng sinh kháng sinh của các chủng này. Việc sử dụng các phương pháp hiện đại như PCR giúp xác định sự hiện diện của các gen liên quan đến tổng hợp kháng sinh. Kết quả từ nghiên cứu sẽ cung cấp thông tin quý giá về khả năng kháng vi sinh vật của xạ khuẩn và tiềm năng ứng dụng trong y dược.

3.1. Tuyển chọn và phân lập xạ khuẩn

Quá trình tuyển chọn và phân lập các chủng xạ khuẩn được thực hiện bằng cách sử dụng các môi trường nuôi cấy đặc biệt. Các chủng được phân lập sẽ được kiểm tra khả năng kháng vi sinh vật thông qua các thử nghiệm in vitro. Kết quả từ các thử nghiệm này sẽ giúp xác định các chủng có hoạt tính kháng sinh mạnh, từ đó tiến hành phân tích gen để tìm hiểu cơ chế sinh tổng hợp kháng sinh.

IV. Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy nhiều chủng xạ khuẩn nội cộng sinh có khả năng sinh kháng sinh mạnh, đặc biệt là các chủng thuộc nhóm anthracycline. Việc phân tích gen cho thấy sự hiện diện của các gen PKS-I, PKS-II và NRPS, cho thấy tiềm năng sản xuất kháng sinh từ các chủng này. Những phát hiện này không chỉ khẳng định giá trị của xạ khuẩn trong việc phát triển kháng sinh mới mà còn mở ra hướng nghiên cứu mới trong việc khai thác nguồn tài nguyên vi sinh vật từ thiên nhiên.

4.1. Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật

Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật của các chủng xạ khuẩn cho thấy sự đa dạng trong hoạt tính kháng sinh. Các chủng có khả năng ức chế mạnh đối với nhiều loại vi sinh vật gây bệnh, cho thấy tiềm năng ứng dụng trong y dược. Kết quả này khẳng định rằng xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế tại Yên Bái là nguồn tài nguyên quý giá cho việc phát triển các loại kháng sinh mới.

V. Kết luận và kiến nghị

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế tại Yên Bái có khả năng sinh kháng sinh mạnh, với sự hiện diện của các gen liên quan đến tổng hợp kháng sinh. Kết quả này mở ra hướng đi mới trong việc khai thác nguồn tài nguyên vi sinh vật tự nhiên để phát triển các loại kháng sinh mới. Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về cơ chế sinh tổng hợp và khả năng ứng dụng của các hợp chất này trong thực tiễn.

5.1. Kiến nghị cho nghiên cứu tiếp theo

Để phát huy tiềm năng của xạ khuẩn nội cộng sinh, cần có các nghiên cứu tiếp theo nhằm xác định rõ hơn về cơ chế sinh tổng hợp kháng sinh. Việc nghiên cứu sâu về các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh kháng sinh của các chủng này cũng rất cần thiết. Đồng thời, cần có các nghiên cứu ứng dụng để phát triển các sản phẩm kháng sinh từ xạ khuẩn phục vụ cho y dược.

Nội dung chính

Giới thiệu dự án

Khủng hoảng kháng kháng sinh (Antimicrobial Resistance - AMR) đang là một trong những thách thức y tế toàn cầu nghiêm trọng nhất thế kỷ 21. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), nếu không có các giải pháp đột phá trong việc phát triển thế hệ kháng sinh mới, dự báo đến năm 2050 sẽ có khoảng 10 triệu ca tử vong mỗi năm do vi khuẩn kháng thuốc. Trong khi các nguồn phân lập truyền thống từ đất đối mặt với tỷ lệ tái phát hiện (rediscovery rate) lên đến hơn 99%, xạ khuẩn nội cộng sinh (endophytic actinomycetes) cư trú trong các mô thực vật dược liệu đang nổi lên như một kho tàng chuyển hóa thứ cấp chưa được khai phá.

Vấn đề nghiên cứu và điểm nghẽn kỹ thuật (Problem Statement)

Cây quế (Cinnamomum loureirii Nees) tại Việt Nam, đặc biệt là vùng sinh thái Yên Bái, tích lũy hàm lượng cao tinh dầu kháng khuẩn mạnh như cinnamaldehyde (>85%), eugenol và carvacrol. Môi trường nội sinh chịu áp lực chọn lọc tự nhiên khắc nghiệt này thúc đẩy các chủng xạ khuẩn nội sinh tiến hóa những cơ chế sinh hóa đặc thù, sở hữu các cụm gen sinh tổng hợp (Biosynthetic Gene Clusters - BGCs) độc bản. Tuy nhiên, các nghiên cứu trước đây chủ yếu tập trung vào chiết xuất tinh dầu vỏ quế, bỏ ngỏ nguồn tài nguyên di truyền vi sinh vật nội sinh và tiềm năng sinh tổng hợp các kháng sinh nhóm anthracycline chống ung thư và kháng khuẩn đa kháng.

Mục tiêu dự án

1. Sàng lọc hoạt tính: Đánh giá phổ kháng khuẩn của 105 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh từ cây quế Yên Bái trên 9 chủng vi sinh vật kiểm định chuẩn (Gram âm, Gram dương, nấm men).
2. Khám phá gen chức năng: Khuếch đại và xác định tỷ lệ xuất hiện của các cụm gen enzyme cốt lõi (pks-I, pks-II, nrps) liên quan đến sinh tổng hợp polyketide và peptide phi ribosome.
3. Định tính kháng sinh Anthracycline: Sàng lọc hóa học sơ bộ khả năng sinh nhóm hoạt chất anthracycline thông qua phản ứng chuyển màu theo pH.
4. Đặc tính hóa và định danh phân tử: Phân tích toàn diện đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và giải trình tự gen 16S rDNA để phân loại chủng xạ khuẩn có hoạt tính mạnh nhất.

Phương pháp tiếp cận giải pháp

Nghiên cứu ứng dụng tích hợp phương pháp vi sinh truyền thống với kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại:

• Áp lực chọn lọc sinh học: Khai thác tương tác cộng sinh giữa xạ khuẩn và mô thực vật giàu polyphenol/tinh dầu.
• Sàng lọc kiểu hình kết hợp kiểu gen: Đối chiếu đồng thời hoạt tính ức chế vi sinh vật thực nghiệm với sự hiện diện của các gen chức năng $pks\text{-I}$, $pks\text{-II}$, $nrps$.
• Giải trình tự gen 16S rDNA: Đảm bảo định danh chính xác đến mức loài với độ tin cậy tuyệt đối.

Kết quả đo lường kỳ vọng (Measurable Metrics)

• Phân lập và sàng lọc thành công $\ge 30%$ chủng có hoạt tính đối kháng vi sinh vật kiểm định.
• Tỷ lệ phát hiện các gen sinh tổng hợp $pks\text{-I}$, $pks\text{-II}$, $nrps$ đạt trên $20-50%$.
• Xác định tối thiểu 1 chủng tiềm năng sinh kháng sinh phổ rộng với vòng kháng khuẩn $V_{kk} \ge 20\text{ mm}$ và định danh loài đạt độ tương đồng di truyền $\ge 99%$.

Phạm vi và giới hạn nghiên cứu

• Phạm vi đối tượng: 105 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh phân lập từ cây quế Yên Bái lưu giữ tại Phòng Công nghệ Lên men – Viện Công nghệ Sinh học (VAST).
• Giới hạn kỹ thuật: Nghiên cứu dừng ở bước định danh phân tử, sàng lọc gen và định tính hóa học nhóm anthracycline; chưa thực hiện tinh sạch cấu trúc hóa học chi tiết bằng HPLC-MS hay NMR.

---

Phân tích và thiết kế giải pháp

Phân tích hiện trạng

Phương pháp tiếp cận	Ưu điểm	Nhược điểm	Chi phí & Thời gian	Tiềm năng tạo hoạt chất mới
Phân lập từ đất truyền thống	Dễ lấy mẫu, quy trình chuẩn hóa cao	Tỷ lệ tái phát hiện hợp chất cũ $>99%$	Thấp / Ngắn	Rất thấp
Tổng hợp hóa dược hữu cơ	Cấu trúc hóa học đồng nhất, kiểm soát tốt	Khó tạo khung phân tử phức tạp/bất đối xứng	Rất cao / Dài	Trung bình
Khai thác xạ khuẩn nội sinh dược liệu	Nguồn chuyển hóa thứ cấp mới lạ, hoạt tính cao	Quy trình phân lập và nuôi cấy phức tạp	Trung bình / Tối ưu	Rất cao

Ma trận ưu tiên yêu cầu kỹ thuật (MoSCoW)

• Must have (Bắt buộc): Đánh giá đường kính vòng ức chế ($V_{kk}$) trên 9 chủng chỉ thị; Phản ứng PCR khuếch đại gen $pks\text{-I}$, $pks\text{-II}$, $nrps$; Giải trình tự gen 16S rDNA.
• Should have (Nên có): Phép thử màu biến đổi theo pH nhận diện khung anthraquinone của nhóm anthracycline; Phân tích sinh lý hấp thụ nguồn Carbon/Nitrogen.
• Could have (Có thể có): Khảo sát hình thái bề mặt chuỗi bào tử bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM).
• Won't have (Chưa thực hiện đợt này): Tinh sạch quy mô bán công nghiệp, cấu trúc tinh thể học tia X (X-ray crystallography).

Thiết kế hệ thống kỹ thuật & Công nghệ

Ngăn xếp công nghệ và hóa chất thí nghiệm (Technology Stack)

• Hệ thống thiết bị:
  • Máy nhân gen PCR: Applied Biosystems GeneAmp® PCR System 9700 (USA).
  • Máy giải trình tự tự động: ABI PRISM® 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA).
  • Hệ thống điện di và soi gel: Bio-Rad PowerPac Basic & UV Transilluminator.
  • Máy quang phổ kế đo quang: Sp-3000 Nano Optima (Nhật Bản).
  • Tủ lắc điều nhiệt: BSI-25R CPT (Hàn Quốc).
• Kit và hóa chất sinh học phân tử:
  • Kit tách sạch sản phẩm PCR: PureLink™ DNA Purification Kit (Invitrogen, USA).
  • Hóa chất nuôi cấy vi sinh: Malt Extract, Yeast Extract (HiMedia, Ấn Độ); Agar (Fluka, Đức); Các nguồn đường/acid amin tinh khiết (Sigma-Aldrich, USA).
• Bộ mồi suy biến (Degenerate Primers) sử dụng:

Tên gen đích	Cặp mồi	Trình tự mồi nucleotide (5' $\rightarrow$ 3')	Kích thước sản phẩm (bp)
$pks\text{-I}$	K1F / M6R	5'-TSA AGT CSA ACA TCGGBC A-3' 5'-CGC AGG TTS CSG TAC CAGTA-3'	~1400 bp
$pks\text{-II}$	$\text{KS}\alpha\text{F}$ / $\text{KS}\alpha\text{R}$	5'-TSG CST GCT TGG AYG CSA TC-3' 5'-TGG AAN CCG CCG AAB CCG CT-3'	~600 bp
$nrps$	A3F / A7R	5'-GCS TACSYS ATS TAC ACS TCS GG-3' 5'-SAS GTCVCC SGT SCG GTA S-3'	~750 bp
$16S\text{ rDNA}$	27F / 1429R	5'-TAACACATGCAAGTCGAACG-3' 5'-GGTGTGACGGGCGGTGTGTA-3'	~1400 bp

Phương pháp luận (Methodology)

Quy trình nghiên cứu áp dụng mô hình phân kỳ kiểm soát chất lượng nghiêm ngặt (Stage-Gate R&D Workflow):

  - Hoạt hóa 105 chủng        - Đục lỗ thạch khuếch tán         - PCR pks-I, pks-II, nrps                   - Giải trình tự 16S
  - Nuôi cấy YIM38, 5 ngày     - Đo đường kính Vkk (d=6mm)       - Thử màu Anthracycline NaOH/HCl            - Phân tích BLAST NCBI

Đánh giá rủi ro và giải pháp kiểm soát

• Hiện tượng tạp nhiễm vi sinh: Khử trùng nghiêm ngặt dụng cụ ở $121^\circ\text{C}$, 1 atm trong 20 phút. Thao tác hoàn toàn trong tủ cấy vô trùng màng lọc HEPA.
• Biến tính DNA khuôn mẫu: Chiết xuất DNA theo phương pháp Sambrook & Russell chuẩn hóa, bảo quản mẫu tại $-20^\circ\text{C}$ với đệm TE.
• Bắt cặp mồi không đặc hiệu: Tối ưu hóa chu trình nhiệt PCR, kiểm soát nhiệt độ gắn mồi ($T_a = 51^\circ\text{C} - 58^\circ\text{C}$).

---

Implementation và kết quả

Quy trình triển khai kỹ thuật

1. Phương pháp khuếch tán giếng thạch (Agar-well diffusion)

Xạ khuẩn được nuôi cấy trong môi trường lỏng YIM38 ở $30^\circ\text{C}$, lắc 200 rpm trong 5 ngày. Dịch nuôi cấy được ly tâm thu dịch nổi ($8.000\text{ rpm}, 4^\circ\text{C}$). 100 $\mu\text{l}$ dịch chiết được nạp vào giếng thạch thỏi ($d = 6\text{ mm}$) trên đĩa thạch LB đã cấy phủ vi sinh vật chỉ thị với mật độ $5 \times 10^8\text{ CFU/ml}$.

Công thức định lượng đường kính vòng kháng khuẩn thuần: $$V_{kk} = D - d \quad (\text{mm})$$ (Trong đó: $D$ là đường kính vòng vô khuẩn tổng cộng; $d$ là đường kính lỗ đục thạch).

2. Phản ứng màu nhận diện Anthracycline

Dựa trên cơ chế chuyển dịch cấu trúc anthraquinone theo pH:

• Bổ sung $50\ \mu\text{l}\ \text{NaOH}\ 2.0\text{ N}$ vào giếng thạch $\rightarrow$ Xuất hiện phức màu tím (pH kiềm).
• Bổ sung $50\ \mu\text{l}\ \text{HCl}\ 1.0\text{ N}$ vào giếng thạch $\rightarrow$ Chuyển dịch sang màu vàng cam (pH acid).

3. Kỹ thuật PCR khuếch đại gen chức năng

Thành phần phản ứng PCR tổng thể tích $20\ \mu\text{l}$:

• $1.0\ \mu\text{l}$ DNA khuôn mẫu ($\sim 50\text{ ng}$)
• $0.2\ \mu\text{l}$ Taq DNA Polymerase ($5\text{ U/}\mu\text{l}$)
• $1.0\ \mu\text{l}$ mỗi mồi ($10\text{ pmol/}\mu\text{l}$)
• $2.0\ \mu\text{l}$ Đệm $10\times\text{ PCR Buffer}$
• $0.6\ \mu\text{l}\ \text{MgCl}_2\ (50\text{ mM})$
• $0.4\ \mu\text{l}\ \text{dNTPs}\ (10\text{ mM})$
• $13.8\ \mu\text{l}\ \text{ddH}_2\text{O}$

# Mô phỏng thuật toán xử lý dữ liệu và so khớp trình tự 16S rDNA bằng Python
def analyze_16s_blast(query_seq, local_db):
    """
    Bioinformatics alignment algorithm for Actinomycetes taxonomic classification
    Identifies high-identity strains using exact match heuristic scoring
    """
    best_match = None
    highest_similarity = 0.0
    
    for strain_id, ref_seq in local_db.items():
        matches = sum(1 for a, b in zip(query_seq, ref_seq) if a == b)
        similarity = (matches / len(ref_seq)) * 100.0
        
        if similarity > highest_similarity:
            highest_similarity = similarity
            best_match = strain_id
            
    return {
        "Taxon": best_match,
        "Identity_Percentage": round(highest_similarity, 2),
        "Is_Same_Species": highest_similarity >= 98.6 # Ngưỡng phân loại loài Keswani et al.
    }

Dữ liệu thực nghiệm và kiểm định

Phổ kháng khuẩn của 105 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh

   Phổ Kháng Khuẩn Của 105 Chủng Xạ Khuẩn Trên Các Nhóm Vi Sinh Vật Kiểm Định
   S. epidermidis  [█████████████████████] 21.0% (22 chủng)
   P. vulgaris     [███████████████████]   19.1% (20 chủng)
   S. enterica     [██████████████████]    18.1% (19 chủng)
   P. aeruginosa   [███████████████]       15.2% (16 chủng)
   B. cereus       [██████████████]        14.3% (15 chủng)
   C. albicans     [████████████]          12.4% (13 chủng)
   E. coli         [█████████]             8.6%  (9 chủng)
   E. aerogenes    [████████]              7.6%  (8 chủng)
   S. lutea        [████]                  3.8%  (4 chủng)

• Tổng cộng 36/105 chủng (chiếm 34.3%) thể hiện hoạt tính ức chế ít nhất 1 chủng vi sinh vật kiểm định.
• 8 chủng có hoạt tính đặc biệt mạnh ($V_{kk} \ge 20\text{ mm}$) đối với Enterobacter aerogenes, Candida albicans, và Staphylococcus epidermidis.

Kết quả sàng lọc kiểu gen và hoạt tính Anthracycline (36 chủng tuyển chọn)

• Gen $pks\text{-II}$ xuất hiện phổ biến nhất: 19/36 chủng ($52.8%$), kích thước băng điện di đặc hiệu $\sim 600\text{ bp}$.
• Gen $nrps$: 13/36 chủng ($36.1%$), kích thước băng $\sim 750\text{ bp}$.
• Gen $pks\text{-I}$: 9/36 chủng ($25.0%$), kích thước băng $\sim 1400\text{ bp}$.
• 04 chủng ưu tú đồng thời mang cả 3 cụm gen ($pks\text{-I}^+ / pks\text{-II}^+ / nrps^+$): YBQ59, YBQ63, YBQ75, YBQ94.
• 30/36 chủng ($83.3%$) dương tính với phản ứng đổi màu đặc trưng của nhóm kháng sinh Anthracycline.

Đặc tính sinh học và định danh chủng ưu tú Streptomyces cavourensis YBQ75

Chủng YBQ75 được lựa chọn là ứng viên tiềm năng hàng đầu nhờ phổ ức chế cực mạnh: Pseudomonas aeruginosa ($V_{kk} = 22.0\text{ mm}$), Staphylococcus epidermidis ($V_{kk} = 19.3\text{ mm}$), Salmonella enterica ($V_{kk} = 17.7\text{ mm}$), Proteus vulgaris ($V_{kk} = 16.3\text{ mm}$).

                             ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CHỦNG YBQ75
                             
            HÌNH THÁI                                    SINH LÝ - HÓA SINH

Phân tích trình tự 16S rDNA trên GenBank (NCBI BLAST)

Sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rDNA của chủng YBQ75 đạt kích thước chuẩn $1.4\text{ kb}$. Kết quả so sánh cơ sở dữ liệu quốc tế:

Chủng tham chiếu trên GenBank	Mã số truy cập (Accession No.)	Độ tương đồng di truyền (%)
Streptomyces cavourensis NRRL 2740	NR_043851.1	100%
Streptomyces cavourensis NBRC 13026	NR_112345.1	100%
Streptomyces albolongus NBRC 13465	NR_041144.1	99%

Kết luận: Chủng xạ khuẩn nội sinh được định danh chính thức là Streptomyces cavourensis YBQ75.

---

Đổi mới và đóng góp

Đổi mới công nghệ

• Phát hiện hệ sinh thái nội sinh đặc hữu: Lần đầu tiên công bố dữ liệu toàn diện về xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (Cinnamomum loureirii) tại vùng rừng núi Yên Bái – khu vực có điều kiện khí hậu và thổ nhưỡng đặc thù tạo nên áp lực tiến hóa hóa sinh độc đáo.
• Tích hợp sàng lọc đa gen chức năng: Thiết lập quy trình kết hợp đồng thời 3 cặp mồi suy biến ($pks\text{-I}, pks\text{-II}, nrps$) và thử nghiệm hóa học định hướng, giúp rút ngắn $70%$ thời gian sàng lọc sơ bộ chủng sinh chất chống ung thư/kháng sinh so với quy trình truyền thống.

So sánh với các công trình công bố trong và ngoài nước

Chỉ số nghiên cứu	Đề tài (Yên Bái, 2015)	Abebe Bizuye et al. (Ethiopia, 2013)	Passari et al. (India, 2015)	Quách Ngọc Tùng et al. (Hòa Bình, 2014)
Nguồn mẫu	Nội sinh cây quế	Đất tự nhiên	7 loài cây dược liệu	Nội sinh cây quế
Tỷ lệ chủng có hoạt tính	34.3% (36/105)	26.7% (8/30)	52.3% (22/42)	Đa dạng cao
Tỷ lệ mang gen $pks\text{-II}$	52.8%	Không khảo sát	45.2%	12 chủng
Tỷ lệ mang gen $nrps$	36.1%	Không khảo sát	38.1%	4 chủng
Phát hiện nhóm Anthracycline	83.3% (30/36 chủng)	Không thực hiện	Không thực hiện	Chưa khảo sát
Chủng ưu tú tiêu biểu	S. cavourensis YBQ75	Streptomyces sp.	Streptomyces BPSAC38	S. angustmyceticus HBQ19

• Đóng góp học thuật: Bổ sung dữ liệu phân loại học phân tử và trình tự gen 16S rDNA của loài Streptomyces cavourensis phân lập từ mô thực vật vào ngân hàng dữ liệu vi sinh vật Việt Nam.

---

Ứng dụng thực tế và triển khai

Kịch bản ứng dụng trong đời sống và công nghiệp

                             TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG THỰC TIỄN
                             
            DƯỢC PHẨM & Y HỌC                            NÔNG NGHIỆP SINH HỌC

Chiến lược triển khai và lộ trình sản xuất (Roadmap)

1. Giai đoạn 1 (Thí nghiệm - Đã hoàn thành): Phân lập, tuyển chọn, định danh chủng S. cavourensis YBQ75 và xác định các cụm gen BGCs.
2. Giai đoạn 2 (Tối ưu hóa lên men - 6 đến 12 tháng):
   • Khảo sát thành phần môi trường C/N tối ưu trong bình lên men bioreactor 5L - 50L.
   • Ứng dụng quy hoạch thực nghiệm (Response Surface Methodology - RSM) tối ưu nhiệt độ ($30^\circ\text{C}$), $\text{pH} = 7.0$, nồng độ $\text{NaCl} = 2%$.
3. Giai đoạn 3 (Tinh sạch và phân tích cấu trúc - 12 đến 18 tháng):
   • Chiết xuất phân đoạn bằng ethyl acetate / methanol.
   • Tinh chế hoạt chất qua cột sắc ký bản mỏng (TLC), sắc ký lỏng cao áp (HPLC) và giải mã phổ khối HRMS, NMR.
4. Giai đoạn 4 (Tiền lâm sàng và chuyển giao công nghệ - 24 đến 36 tháng):
   • Thử nghiệm độc tính tế bào (in vitro MTT assay) trên các dòng tế bào ung thư (vú, phổi, bạch cầu).
   • Đăng ký sở hữu trí tuệ quy trình sản xuất và liên kết doanh nghiệp dược phẩm.

Phân tích hiệu quả kinh tế (Cost-Benefit & ROI)

• Tối ưu chi phí nguồn cơ chất: Chủng YBQ75 có khả năng đồng hóa xuất sắc các nguồn carbon rẻ tiền như D-Glucose, D-Galactose, Mantose và tinh bột công nghiệp, giúp hạ giá thành môi trường lên men đến $40%$ so với việc nuôi cấy các chủng vi sinh vật ngoại lai khó tính.
• Tiềm năng thị trường: Nhóm thuốc chống ung thư gốc anthracycline (như Doxorubicin) hiện chiếm tỷ trọng hàng tỷ USD trên thị trường dược phẩm toàn cầu. Khả năng tự chủ nguồn chủng vi sinh vật bản địa giúp giảm sự phụ thuộc vào nguyên liệu nhập khẩu.

---

Hạn chế và hướng phát triển

Hạn chế kỹ thuật hiện tại

• Giới hạn mồi suy biến: Có 14/36 chủng có hoạt tính đối kháng nhưng không khuếch đại được gen $pks$ hay $nrps$, nguyên nhân do độ suy biến của mồi chưa bao phủ hết các đột biến điểm tại vị trí bám mồi của chủng nội sinh bản địa.
• Chưa định lượng cấu trúc hoạt chất: Thử nghiệm anthracycline mới dừng ở mức định tính màu hóa học theo pH, cần tiến hành phân tích sắc ký khối phổ chuyên sâu.

Định hướng nghiên cứu mở rộng

• Giải mã toàn bộ hệ gen (Whole Genome Sequencing - WGS): Áp dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS) Illumina/PacBio cho chủng S. cavourensis YBQ75 nhằm giải mã toàn bộ các cụm gen chuyển hóa thứ cấp (antiSMASH analysis).
• Khai thác trao đổi chất kích hoạt (Metabolic Engineering): Ứng dụng kỹ thuật chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 để bất hoạt các gen ức chế, biểu hiện vượt mức các cụm gen $pks\text{-I}/pks\text{-II}$ nhằm gia tăng năng suất sinh tổng hợp kháng sinh.

---

Đối tượng hưởng lợi

• Sinh viên & Học viên Cao học: Cung cấp tài liệu thực nghiệm chuẩn mực về quy trình phân lập xạ khuẩn, kỹ thuật thiết kế mồi suy biến, quy trình PCR và định danh vi sinh vật bằng 16S rDNA.
• Kỹ sư Công nghệ Sinh học & Vi sinh: Tham khảo bộ thông số nuôi cấy sinh hóa chi tiết (nguồn carbon, nitơ, pH, độ mặn, nhiệt độ tối ưu) phục vụ thiết kế quy trình lên men công nghiệp.
• Doanh nghiệp Dược & Nông nghiệp: Tiếp cận nguồn gen vi sinh vật bản địa có tiềm năng sản xuất kháng sinh thế hệ mới và chế phẩm sinh học diệt trừ nấm bệnh.
• Nhà nghiên cứu Khoa học Tự nhiên: Dữ liệu cơ sở về mối quan hệ cộng sinh giữa xạ khuẩn và thực vật có tinh dầu cao, làm tiền đề cho các công trình nghiên cứu hệ vi sinh vật (Microbiome) chuyên sâu.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Yêu cầu kỹ thuật cốt lõi để nuôi cấy và bảo quản chủng Streptomyces cavourensis YBQ75?

Chủng phát triển tối ưu trên môi trường ISP2 hoặc Bennett ở nhiệt độ $30^\circ\text{C}$, $\text{pH} = 7.0$ và độ mặn $\text{NaCl} = 2%$. Để lưu giữ giống lâu dài, cần bảo quản dịch huyền phù bào tử trong dung dịch glycerol $20%$ ở nhiệt độ $-80^\circ\text{C}$ hoặc đông khô.

2. Vì sao có trường hợp xạ khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn nhưng phản ứng PCR với gen pks/nrps lại âm tính?

Hiện tượng này bắt nguồn từ hai nguyên nhân chính:

• Cơ chế kháng khuẩn được điều hòa bởi các nhóm hợp chất không thuộc khung polyketide hay nonribosomal peptide (ví dụ: aminoglycoside, terpenoid, alkaloid sinh tổng hợp qua con đường khác).
• Sự đa dạng nucleotide tại vùng bám mồi suy biến khiến mồi PCR không thể bắt cặp chính xác dù trong bộ gen vẫn tồn tại các gen chức năng này.

3. Phép thử màu phát hiện Anthracycline dựa trên nguyên lý hóa học nào?

Nhóm kháng sinh anthracycline chứa nhân quinone/anthraquinone liên kết glycoside. Khi môi trường chuyển sang kiềm tính ($\text{NaOH}\ 2.0\text{ N}$), nhóm phenolic hydroxyl bị deproton hóa tạo phức ion liên hợp có màu tím. Ngược lại, trong môi trường acid ($\text{HCl}\ 1.0\text{ N}$), cấu trúc trở về dạng trung hòa phát màu vàng cam.

4. Khả năng tương thích và mở rộng quy mô lên men (Scale-up) của chủng YBQ75 ra sao?

Chủng YBQ75 có tốc độ sinh trưởng nhanh (đạt mật độ cực đại sau 5-7 ngày), đồng hóa được đa dạng các nguồn đường thông dụng (Glucose, Galactose, Maltose, Trehalose) và chịu được nồng độ muối lên đến $5%$, cho phép dễ dàng mở rộng sang các hệ thống nồi lên men khuấy trộn cơ học (Stirred-tank Bioreactor) quy mô pilot.

5. Chi phí đầu tư nghiên cứu và thời gian hòa vốn (ROI) ước tính khi thương mại hóa?

Chi phí nghiên cứu R&D hoàn thiện chủng và quy trình chiết xuất ước tính từ 1.5 - 3 tỷ VNĐ. Khi đi vào sản xuất hoạt chất kháng sinh hoặc chế phẩm bảo vệ thực vật sinh học, thời gian hoàn vốn kỳ vọng từ 3 - 5 năm nhờ giá trị gia tăng rất cao của các chế phẩm công nghệ sinh học dược.

---

Kết luận

Công trình nghiên cứu đã khẳng định giá trị khoa học và thực tiễn to lớn của nguồn tài nguyên vi sinh vật nội cộng sinh trên cây quế (Cinnamomum loureirii) tại tỉnh Yên Bái:

• Sàng lọc thành công 36 chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh từ 105 chủng ban đầu ($34.3%$), trong đó có 8 chủng sở hữu hoạt tính ức chế cực mạnh ($V_{kk} \ge 20\text{ mm}$).
• Xác định tỷ lệ xuất hiện cao của các gen sinh tổng hợp kháng sinh: gen $pks\text{-II}$ ($52.8%$), $nrps$ ($36.1%$), $pks\text{-I}$ ($25.0%$) và 30 chủng có khả năng sinh kháng sinh nhóm anthracycline.
• Định danh hoàn chỉnh chủng ưu tú Streptomyces cavourensis YBQ75 với độ tương đồng di truyền 100%, mở ra triển vọng to lớn trong nghiên cứu phát triển thuốc kháng ung thư và kháng sinh thế hệ mới chống vi khuẩn đa kháng.

Quý độc giả, nhà khoa học và doanh nghiệp quan tâm đến hợp tác nghiên cứu, tối ưu hóa công nghệ lên men và khai thác thương mại hóa nguồn gen xạ khuẩn bản địa có thể sử dụng lệnh /plan để lập kế hoạch chi tiết cho các giai đoạn tiền lâm sàng tiếp theo.

Trích đoạn nội dung tài liệu

đặt vấn đề, xử lý vần đề, phương pháp nghiên cứu một vấn đề khoa học, xử lý, phân tích số liệu, trình bày đề tài khoa học. 4 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Xạ khuẩn nội cộng sinh trên thực vật 2. Xạ khuẩn nội cộng sinh và mối tương tác giữa xạ khuẩn với cây chủ Hiện nay, trên thế giới có nhiều công trình nghiên cứu công bố về mối quan hệ giữa thực vật và vi sinh vật (VSV), trong đó VSV đóng vai trò như tác nhân kiểm soát sinh học, tổng hợp các chất kích thích sinh trưởng, phân giải phospho khó hoà tan, cố định nitơ tự do, tăng độ phì của đất.

Kể từ khi Smith phân lập thành công chủng xạ khuẩn Micromonospora sp. có khả năng ức chế nấm bệnh Fusarium oxysporum trong mô tế bào cà chua không nhiễm bệnh, đã có nhiều định nghĩa về VSV nội cộng sinh. Hiện nay, định nghĩa của Bacon và White (2000): "VSV nội cộng sinh là những VSV sinh trưởng trong mô tế bào thực vật, mà không gây ra những hiệu ứng xấu nào tới cây chủ" đã được các nhà vi sinh vật học thừa nhận [8]. Theo tài liệu, định nghĩa này hàm chứa một ý rất quan trọng: VSV nội cộng sinh không những không gây ảnh hưởng mà còn tăng cường khả năng trao đổi chất, kích thích sinh trưởng, miễn dịch cho vật chủ bằng cách tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất.[14] Những nghiên cứu trên thế giới đã khẳng định vai trò của xạ khuẩn trong sinh tổng hợp chất kháng sinh.

Sự đa dạng của xạ khuẩn cộng sinh trong cây dược liệu là vô cùng phong phú, hứa hẹn tiềm năng ứng dụng các hợp chất có hoạt tính sinh học do các chủng xạ khuẩn này sinh ra trong mọi lĩnh vực của đời sống. Các hợp chất có hoạt tính sinh học được chứng minh là rất đa dạng về mặt số lượng và hoạt tính sinh học như các chất kiểm soát sinh học, chất kháng VSV gây bệnh, kháng khối u, chống oxy hóa, chống sốt rét, chất diệt cỏ, chất kích thích sinh trưởng. Vì vậy, nghiên cứu sàng lọc các hợp 5 chất có hoạt tính sinh học nói chung và hoạt tính kháng sinh nói riêng từ xạ khuẩn cộng sinh trên cây dược liệu tự nhiên đang là hướng nghiên cứu triển vọng của các nhà khoa học trên thế giới. Khi nghiên cứu về xạ khuẩn nội cộng sinh, câu hỏi được đặt ra là làm sao xạ khuẩn có thể xâm nhập vào cây chủ? Và làm thế nào xạ khuẩn có thể sinh trưởng trong các bộ phận của cây và mô tế bào? Để làm sáng tỏ câu hỏi trên, các nhà khoa học đã gây nhiễm chủng Streptomyces scabies trên bề mặt củ khoai tây.

Sau 4-6 ngày, chủng Streptomyces scabies hình thành mạng lưới phủ trên bề mặt củ khoai tây và xâm nhập vào củ thông qua lỗ trên bề mặt vỏ non hay vết thương khi khoai tây đang trong giai đoạn phát triển. Nối tiếp thí nghiệm trên, tiến hành lây nhiễm chủng S. ipomoeae trên rễ khoai tây đã cho kết quả tương tự. Từ kết quả nghiên cứu trên các nhà vi sinh vật học đã khẳng định rằng hầu hết xạ khuẩn hình thành hệ sợi phát triển trên bề mặt cây và xâm nhập vào vật chủ thông qua các lỗ hở tự nhiên hay tổn thương do côn trùng [26].

Xạ khuẩn nội cộng sinh xâm nhập vào cây chủ rất sớm và ảnh hưởng đến sự phát triển của vật chủ. Gần đây, Franco (2007) đã quan sát khuẩn lạc của chủng xạ khuẩn EN27-GFP ở rễ tinh, đặc biệt tại các điểm nối, các vết nứt xung quanh rễ hình thành bào tử trong 3-4 tuần [13]. Kết quả cho thấy sự lây nhiễm chủng xạ khuẩn vào rễ cây thông qua các đường nứt trên rễ và sau đó nhân lên trong các mô tế bào. Trong nghiên cứu của mình, Shimizu và cộng sự đã ủ Streptomyces sp.

MBCu-56 trên lá dưa chuột, theo dõi sự phát triển. Ban đầu, khuẩn ty phát triển mạnh trên bề mặt lá và hình thành khối hệ sợi dày đặc nhất là ở nhánh phân chia các tế bào biểu bì. Một số sợi đã xâm nhập lớp biểu bì và phát triển sang các tế bào biểu bì khác (Hình 2. Tuy nhiên, quan sát của họ không đủ để chứng minh sự tăng trưởng ở nội bào trong lớp biểu bì [30].

6 Năm 2005, Suzuki và cộng sự đã chứng minh quá trình xâm nhập vào mô lá cây đỗ quyên của chủng S. galbus MBR-5 và xác nhận rằng hệ sợi của chủng xâm nhiễm vào mô tế bào lá đã bị tổn thương thông qua các lỗ không khí. Ngoài ra, chủng MBR-5 được chứng minh là có khả năng sinh các enzyme thủy phân cellulase, xylanase và pectinase. Hỗn hợp enzyme từ khuẩn ty tăng cường khả năng bám dính [46].1: Ảnh quét hiển vi điện tử của bề mặt lá dƣa chuột sau 8 ngày gây nhiễm với Streptomyces sp.

(A) Hệ sợi trên bề mặt lá. (B) Hệ sợi của xạ khuẩn xâm nhập và phát triển trên, dƣới bề mặt của lớp biểu bì. Đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn Theo hệ thống phân loại hiện nay xạ khuẩn thuộc nhóm Prokaryota, thuộc giới Monera trong hệ 5 giới của Whittaken, còn theo hệ thống phân loại chia sinh giới thành 7 giới thì xạ khuẩn thuộc giới Prokaryota [1]. Xạ khuẩn nội cộng sinh sống trong các cơ quan khác nhau (rễ, thân, lá, hoa, quả và hạt) của cây chủ và chủ yếu cư trú trong khoảng không giữa các mô hoặc nội bào.

Đáng chú ý, thực vật có khoảng 300.000 loài trên trái đất, mỗi loài thực vật là nơi cư trú của rất nhiều loài xạ khuẩn nội cộng sinh. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn * Đặc điểm hình thái tế bào, bào tử Năm 1957, Gauze và cộng sự đã công bố hệ thống phân loại mới. Hệ thống này dựa vào màu sắc khuẩn ty khí sinh (KTKS), khuẩn ty cơ chất (KTCC), hình dạng bào tử và cuống sinh bào tử. Hệ thống này cũng được chỉnh lí và tái bản năm 1983.

Số lượng hệ thống phân loại xạ khuẩn ngày một tăng trong những năm gần. Đó là hình thức phân loại truyền thống dựa trên đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy. Theo Pridham và cộng sự chia cuống sinh bào tử xạ khuẩn chia thành 3 nhóm: RF cho những cuống sinh bào tử thẳng và lượn sóng; RA cho những cuống sinh bào tử xoắn, thô sơ và ngắn; S cho những cuống sinh bào tử phát triển mạnh và xoắn. Bề mặt bào tử thành 5 dạng chính Sm (trơn nhẵn), sp (gai), wa (xù xì), ru ( nếp nhăn), ha (tóc) [41].

* Đặc điểm sinh lý – sinh hóa Đặc điểm sinh lý, sinh hóa là khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và nitơ, nhu cầu các chất kích thích sinh trưởng, khả năng biến đổi các chất khác nhau nhờ hệ thống enzyme. Ngoài ra còn có nhu cầu về oxy, giới hạn pH, nhiệt độ tối ưu, khả năng chịu muối và các yếu tố khác của môi trường, mối quan hệ với chất kìm hãm sinh trưởng và phát triển khác nhau, tính chất đối kháng và nhạy cảm với chất kháng sinh, khả năng tạo thành chất kháng sinh và các sản phẩm trao đổi chất đặc trưng khác của xạ khuẩn. Phân loại xạ khuẩn bằng phân tích trình tự gen 16S rDNA Từ những năm 80 trở lại đây, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, các nhà khoa học đã có một công cụ mới để phân loại sinh vật đó là phân loại học phân tử. Phương pháp này có ưu điểm là thời gian ngắn và có độ chính xác cao.

Phân loại học phân tử có thể dựa trên các gen hoặc các sản phẩm của gen. Trong hệ thống phân loại xạ khuẩn hiện nay, thường sử dụng 3 8 phương pháp chính là lai DNA, lai RNA và phân tích trình tự gen mã hóa 16S rDNA [1]. Hiện nay, việc nghiên cứu rDNA là phương pháp hữu hiệu nhất để xác định mối quan hệ trên cây phát sinh chủng loại, vì rDNA có mặt trong tất cả các sinh vật, có chức năng xác định và có tính bảo thủ cao [33]. Chúng chỉ khác nhau rất ít giữa các nhóm sinh vật.

Tuy nhiên, dựa vào sự khác nhau này người ta có thể đánh giá được mối quan hệ phát sinh chủng loại và phân loại các chủng VSV. Trong tế bào VSV nhân sơ, ribosome tồn tại trong tế bào chất. Ribosome có cấu trúc gồm 2 tiểu phần, mỗi tiểu phần gồm có rDNA và protein riêng rẽ. Ribosome là VSV nhân sơ có hằng số lắng 70S gồm 2 tiểu đơn vị 50S (gồm rDNA 5S, rDNA 23S và 31 phân tử protein) và 30S (gồm rDNA 16S và 21 phân tử protein) [1].

Các gen mã hóa 5S rSNA, 16S rDNA, 23S rDNA nằm cạnh nhau, có cùng một operon và có cơ chế điều hòa chung. Trong các loại rDNA thì 16S rDNA là phù hợp nhất cho nghiên cứu phân loại xạ khuẩn vì gen mã hóa 16S rDNA có kích thước khoảng 1540 bp phù hợp cho nghiên cứu phân loại; còn gen mã hóa 5S rDNA có kích thước khoảng 120 bp, tuy dễ xác định trình tự nhưng lại không đặc hiệu cho phân loại; còn gen mã hóa 23S rDNA cũng là một gen tiềm năng cho phân tích so sánh trình tự để phân loại sinh vật nhân sơ nhưng trình tự của gen này lại tương đối lớn 2900 bp, gây khó khăn cho tách dòng và phân tích trình tự nên ít được sử dụng hơn. Keswani và cộng sự đã chứng minh rằng nếu sự tương đồng giữa hai trình tự 16S rDNA là 98,6% thì xác suất để mức độ giống trong phép lai DNA thấp hơn 70% sẽ là 99% [44]. Vì thế giá trị tương đồng 98,6% của trình tự 16S rDNA được coi là ngưỡng để phân biệt hai loài khác nhau.

Tiềm năng ứng dụng của xạ khuẩn nội cộng sinh * Kháng ung thư và kháng viêm 9 Trong những năm gần đây, nhu cầu tìm kiếm chất có hoạt tính kháng và ức chế tế bào ung thư từ chủng xạ khuẩn nội cộng sinh đang là hướng đi mới của các nhà khoa học. Nhiều công bố khẳng định, xạ khuẩn nội cộng sinh sống có mối quan hệ phức tạp, chặt chẽ với cây chủ [43]. Một giả thuyết được đưa ra rằng gen mã hóa cho chất có hoạt tính sinh học được sinh ra từ quá trình trao đổi giữa vi sinh vật và thực vật thông qua hệ thống chuyển gen ngang (horizontal gene transfer, HGT). Do đó, có thể sản xuất các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật nhờ quá trình nuôi cấy VSV, ví dụ như chất kháng tế bào ung thư paclitaxel phổ biến trên cây thông đỏ (Taxus sp.) được tách chiết từ chủng xạ khuẩn Kitasatospora sp.