Nghiên cứu khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế ở Yên Bái

Luận văn đánh giá khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế tại Yên Bái, nghiên cứu tiềm năng ứng dụng trong y học và nông nghiệp.

• Tác giả: Hoàng Thị Tròn
• Người hướng dẫn: TS. Phí Quyết Tiến
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Đánh Giá Khả Năng Sinh Kháng Sinh Của Xạ Khuẩn Nội Cộng Sinh Trên Cây Quế Tại Yên Bái
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp đại học
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.2. Ý nghĩa của đề tài
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Xạ khuẩn nội cộng sinh trên thực vật
• 2.2. Xạ khuẩn nội cộng sinh và mối tương tác giữa xạ khuẩn với cây chủ
• 2.3. Đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn
• 2.3.1. Đặc điểm hình thái tế bào, bào tử
• 2.3.2. Đặc điểm sinh lý – sinh hóa
• 2.3.3. Phân loại xạ khuẩn bằng phân tích trình tự gen 16S rDNA
• 2.4. Tiềm năng ứng dụng của xạ khuẩn nội cộng sinh
• 2.4.1. Kháng ung thư và kháng viêm
• 2.4.2. Kích thích sinh trưởng
• 3. PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
• 3.1. Vật liệu nghiên cứu
• 3.2. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
• 3.3. Môi trường nuôi cấy
• 3.4. Địa điểm và thời gian tiến hành
• 3.5. Nội dung nghiên cứu
• 3.6. Phương pháp nghiên cứu
• 3.6.1. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật
• 3.6.2. Xác định khả năng sinh anthracyline
• 3.6.3. Khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS của xạ khuẩn
• 3.6.4. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một chủng xạ khuẩn
• 3.6.5. Phân loại chủng xạ khuẩn YBQ75 dựa trên phân tích trình tự gen 16S rDNA
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật
• 4.2. Xác định gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS tham gia sinh tổng hợp kháng sinh
• 4.3. Sàng lọc xạ khuẩn sinh kháng sinh thuộc nhóm anthraycycline
• 4.4. Đặc điểm sinh học và phân loại của chủng xạ khuẩn YBQ75
• 4.5. Đặc điểm hình thái và bề mặt chuỗi bào tử của xạ khuẩn YBQ75
• 4.6. Đặc điểm sinh hóa của xạ khuẩn YBQ75
• 4.7. Khuếch đại và phân tích trình tự gen 16S rDNA của xạ khuẩn YBQ75
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC 1

Tóm tắt

I. Giới thiệu

Nghiên cứu về khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế tại Yên Bái đã trở thành một chủ đề quan trọng trong lĩnh vực vi sinh vật học. Việc tìm kiếm các nguồn kháng sinh mới từ tự nhiên là cần thiết, đặc biệt trong bối cảnh vi khuẩn kháng thuốc ngày càng gia tăng. Cây quế, với đặc tính sinh học phong phú, là môi trường lý tưởng cho sự phát triển của vi sinh vật nội cộng sinh. Nghiên cứu này không chỉ nhằm đánh giá khả năng kháng vi sinh vật của các chủng xạ khuẩn mà còn xác định sự hiện diện của các gen liên quan đến tổng hợp kháng sinh, như PKS-I, PKS-II và NRPS.

1.1. Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chính của nghiên cứu là đánh giá khả năng kháng vi sinh vật của các chủng xạ khuẩn nội cộng sinh thu thập từ cây quế tại Yên Bái. Nghiên cứu sẽ tập trung vào việc xác định các gen mã hóa cho khả năng sinh kháng sinh, từ đó mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các loại kháng sinh tự nhiên. Việc này không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn có giá trị thực tiễn trong việc tìm kiếm các hợp chất kháng sinh mới từ nguồn tài nguyên thiên nhiên.

II. Tổng quan tài liệu

Tổng quan về xạ khuẩn nội cộng sinh cho thấy sự đa dạng và tiềm năng ứng dụng của chúng trong việc sản xuất các hợp chất kháng sinh. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng xạ khuẩn có khả năng sinh ra nhiều loại kháng sinh khác nhau, bao gồm cả nhóm anthracycline. Sự tương tác giữa xạ khuẩn và cây chủ không chỉ giúp cây phát triển mà còn tạo ra các sản phẩm có hoạt tính sinh học. Việc nghiên cứu về kháng sinh tự nhiên từ xạ khuẩn trên cây quế có thể mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các loại thuốc kháng sinh hiệu quả.

2.1. Khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn

Khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội cộng sinh được xác định thông qua việc phân lập và kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng ức chế sự phát triển của các vi sinh vật gây bệnh. Việc xác định các gen như PKS-I, PKS-II và NRPS là rất quan trọng trong việc hiểu rõ cơ chế sinh tổng hợp kháng sinh. Những phát hiện này không chỉ có giá trị trong nghiên cứu mà còn có thể ứng dụng trong sản xuất các loại thuốc kháng sinh mới.

III. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện thông qua việc thu thập mẫu từ cây quế tại Yên Bái và phân lập các chủng xạ khuẩn nội cộng sinh. Các phương pháp nuôi cấy và phân tích gen được áp dụng để xác định khả năng sinh kháng sinh của các chủng này. Việc sử dụng các phương pháp hiện đại như PCR giúp xác định sự hiện diện của các gen liên quan đến tổng hợp kháng sinh. Kết quả từ nghiên cứu sẽ cung cấp thông tin quý giá về khả năng kháng vi sinh vật của xạ khuẩn và tiềm năng ứng dụng trong y dược.

3.1. Tuyển chọn và phân lập xạ khuẩn

Quá trình tuyển chọn và phân lập các chủng xạ khuẩn được thực hiện bằng cách sử dụng các môi trường nuôi cấy đặc biệt. Các chủng được phân lập sẽ được kiểm tra khả năng kháng vi sinh vật thông qua các thử nghiệm in vitro. Kết quả từ các thử nghiệm này sẽ giúp xác định các chủng có hoạt tính kháng sinh mạnh, từ đó tiến hành phân tích gen để tìm hiểu cơ chế sinh tổng hợp kháng sinh.

IV. Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy nhiều chủng xạ khuẩn nội cộng sinh có khả năng sinh kháng sinh mạnh, đặc biệt là các chủng thuộc nhóm anthracycline. Việc phân tích gen cho thấy sự hiện diện của các gen PKS-I, PKS-II và NRPS, cho thấy tiềm năng sản xuất kháng sinh từ các chủng này. Những phát hiện này không chỉ khẳng định giá trị của xạ khuẩn trong việc phát triển kháng sinh mới mà còn mở ra hướng nghiên cứu mới trong việc khai thác nguồn tài nguyên vi sinh vật từ thiên nhiên.

4.1. Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật

Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật của các chủng xạ khuẩn cho thấy sự đa dạng trong hoạt tính kháng sinh. Các chủng có khả năng ức chế mạnh đối với nhiều loại vi sinh vật gây bệnh, cho thấy tiềm năng ứng dụng trong y dược. Kết quả này khẳng định rằng xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế tại Yên Bái là nguồn tài nguyên quý giá cho việc phát triển các loại kháng sinh mới.

V. Kết luận và kiến nghị

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế tại Yên Bái có khả năng sinh kháng sinh mạnh, với sự hiện diện của các gen liên quan đến tổng hợp kháng sinh. Kết quả này mở ra hướng đi mới trong việc khai thác nguồn tài nguyên vi sinh vật tự nhiên để phát triển các loại kháng sinh mới. Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về cơ chế sinh tổng hợp và khả năng ứng dụng của các hợp chất này trong thực tiễn.

5.1. Kiến nghị cho nghiên cứu tiếp theo

Để phát huy tiềm năng của xạ khuẩn nội cộng sinh, cần có các nghiên cứu tiếp theo nhằm xác định rõ hơn về cơ chế sinh tổng hợp kháng sinh. Việc nghiên cứu sâu về các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh kháng sinh của các chủng này cũng rất cần thiết. Đồng thời, cần có các nghiên cứu ứng dụng để phát triển các sản phẩm kháng sinh từ xạ khuẩn phục vụ cho y dược.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Sự gia tăng của các chủng vi khuẩn gây bệnh kháng kháng sinh đang là thách thức y tế nghiêm trọng trên toàn cầu, thúc đẩy nhu cầu cấp thiết trong việc tìm kiếm các hoạt chất kháng sinh mới từ tự nhiên. Trong số các nguồn tài nguyên sinh học, thực vật và đặc biệt là các loài cây dược liệu chứa tinh dầu có hoạt tính sinh học cao như cây quế (Cinnamomum loureirii Nees) được chứng minh là môi trường cư trú tiềm năng của hệ vi sinh vật nội sinh. Xạ khuẩn nội cộng sinh sinh trưởng trong các mô thực vật mà không gây hại cho cây chủ, đồng thời có khả năng trao đổi chất bậc hai mạnh mẽ, sản sinh các hợp chất tự nhiên đa dạng như chất kháng khuẩn, kháng ung thư, chống oxy hóa và các chất điều hòa sinh trưởng.

Tại Việt Nam, các nghiên cứu về xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu nói chung và cây quế nói riêng nhằm khai thác các gen chức năng sinh tổng hợp kháng sinh vẫn còn rất hạn chế. Đề tài "Đánh giá khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế thu thập tại tỉnh Yên Bái" được thực hiện nhằm giải quyết các mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể sau:

1. Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng xạ khuẩn nội cộng sinh phân lập từ cây quế thu thập tại tỉnh Yên Bái.
2. Xác định sự hiện diện của 03 nhóm gen chức năng liên quan đến quá trình sinh tổng hợp kháng sinh (pks-I, pks-II, nrps) và sàng lọc khả năng sinh kháng sinh nhóm anthracycline của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn.
3. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học (hình thái nuôi cấy, đặc điểm sinh lý - sinh hóa) và phân loại phân tử dựa trên phân tích trình tự gen mã hóa 16S rDNA của chủng xạ khuẩn tiềm năng nhất.

• Đối tượng nghiên cứu: 105 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh được phân lập từ các mẫu cây quế thu thập tại tỉnh Yên Bái, lưu trữ tại Bộ sưu tập giống vi sinh vật của Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam); cùng 09 chủng vi sinh vật kiểm định gồm vi khuẩn Gram âm (Salmonella enterica ATCC 14028, Escherichia coli ATCC 11105, Proteus vulgaris CNLM, Pseudomonas aeruginosa CNLM, Enterobacter aerogenes ATCC 13048), vi khuẩn Gram dương (Sarcina lutea CNLM, Bacillus cereus ATCC 11778, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228) và nấm men (Candida albicans ATCC 10231).
• Phạm vi không gian và thời gian: Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam trong thời gian từ tháng 12/2014 đến tháng 06/2015.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Nghiên cứu dựa trên cơ sở sinh tổng hợp các hợp chất trao đổi chất bậc hai từ xạ khuẩn thông qua các phức hợp enzyme chuyên biệt:

• Polyketide Synthase loại I (PKS-I): Enzyme đa chức năng chịu trách nhiệm tạo khung polyketide hoàn chỉnh và kéo dài chuỗi.
• Polyketide Synthase loại II (PKS-II): Phức hợp enzyme tham gia tổng hợp cấu trúc cơ bản của các polyketide đa vòng thơm.
• Nonribosomal Peptide Synthetase (NRPS): Hệ enzyme chịu trách nhiệm tổng hợp các peptide không thông qua ribosome từ các amino acid và protein.
• Kháng sinh nhóm Anthracycline: Nhóm kháng sinh có cấu trúc vòng anthraquinone, thường được ứng dụng trong hóa trị liệu khối u và ung thư (như doxorubicin, daunorubicin), có tính chất biến đổi màu sắc phụ thuộc vào pH môi trường (màu da cam trong môi trường acid và màu tím trong môi trường kiềm).
• Phân loại phân tử qua 16S rDNA: Sử dụng gen 16S rDNA kích thước khoảng 1540 bp mang tính bảo thủ cao để xác định vị trí phân loại và mức độ tương đồng di truyền học giữa các loài xạ khuẩn.

Hệ thống phương pháp thực nghiệm bao gồm:

Phương pháp	Quy trình và kỹ thuật thực hiện	Chỉ tiêu / Thiết bị ghi nhận
Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn	Phương pháp khuếch tán giếng thạch trên môi trường LB, nồng độ vi sinh vật kiểm định $5 \times 10^8\text{ CFU/ml}$, bổ sung $100\ \mu\text{l}$ dịch lên men xạ khuẩn vào giếng thạch.	Đường kính vòng kháng khuẩn: $V_{kk} = D - d\text{ (mm)}$ (với $D$ là đường kính vòng vô khuẩn, $d$ là đường kính giếng thạch).
Thử nghiệm sinh anthracycline	Phép thử màu trực tiếp trên đĩa thạch YIM38 sau 5 ngày nuôi cấy với $50\ \mu\text{l}\text{ NaOH } 2,0\text{ N}$ và $50\ \mu\text{l}\text{ HCl } 1,0\text{ N}$.	Quan sát sự chuyển màu: tím ở pH kiềm và vàng cam ở pH acid quanh giếng thạch sau 30 phút.
Khuếch đại gen chức năng (pks-I, pks-II, nrps)	Tách chiết DNA tổng số theo phương pháp Sambrook và Russell, thực hiện PCR bằng các cặp mồi suy biến chuyên biệt (K1F/M6R cho pks-I, KSaF/KSaR cho pks-II, A3F/A7R cho nrps).	Điện di kiểm tra trên gel agarose 1,0%; ghi nhận kích thước băng sản phẩm PCR (~1400 bp cho pks-I, ~600 bp cho pks-II, ~750 bp cho nrps).
Nghiên cứu hình thái và sinh lý - sinh hóa	Nuôi cấy trên 9 môi trường chuẩn (Gauze 1, Gauze 2, ISP1 - ISP7); đánh giá sử dụng cacbon trên ISP9, sử dụng nitơ trên ISP8; khảo sát nhiệt độ ($10-55^\circ\text{C}$), pH (3-12), nồng độ NaCl ($1-10%$) trên môi trường Bennett.	Hệ thống phân loại Shirling - Gottlieb (1966), bảng màu Tresner - Backus; quan sát chuỗi bào tử bằng kính hiển vi quang học và quét điện tử (SEM).
Định danh phân tử 16S rDNA	Nhân bản đoạn gen 16S rDNA bằng cặp mồi phổ biến 27F/1429R, tinh sạch bằng kit PureLink™ DNA Purification, giải trình tự trên hệ thống tự động ABI PRISM® 3100-Avant Genetic Analyzer.	Đoạn gen ~1,4 kb; so sánh trình tự với cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI) bằng công cụ BLAST.

---

Nội dung chính theo từng chương

Phần 1: Mở đầu

Phần này trình bày tính cấp thiết của đề tài xuất phát từ thực trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh và tiềm năng to lớn của các hợp chất tự nhiên từ cây quế cũng như hệ vi sinh vật nội cộng sinh trên cây dược liệu. Tác giả xác định mục tiêu đánh giá phổ kháng khuẩn, dò tìm các cụm gen chức năng sinh tổng hợp kháng sinh (pks-I, pks-II, nrps) và định danh chủng tiềm năng nhằm đóng góp cơ sở khoa học cho lĩnh vực hóa dược và công nghệ sinh học vi sinh.

Phần 2: Tổng quan tài liệu

Tác giả hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về:

• Cơ chế xâm nhập và quan hệ tương tác giữa xạ khuẩn nội sinh và cây chủ qua các mô, vết nứt tự nhiên hoặc vết thương cơ học.
• Tiềm năng ứng dụng của xạ khuẩn nội cộng sinh trong kiểm soát sinh học, kích thích sinh trưởng cây trồng (tiết auxin, cytokinin, siderophore) và sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học (chất kháng khuẩn, kháng nấm, kháng ung thư nhóm anthracycline, maytansinoid, naphthomycin K).
• Vai trò của các cụm gen sinh tổng hợp pks-I, pks-II, nrps và ý nghĩa của việc sử dụng kỹ thuật PCR mồi suy biến để sàng lọc nhanh các chủng có tiềm năng trao đổi chất thứ cấp.
• Tổng quan về thành phần hóa thực vật của cây quế (Cinnamomum loureirii Nees), trong đó hoạt chất cinnamaldehyde chiếm trên 85% hàm lượng tinh dầu và có khả năng ức chế mạnh nhiều vi sinh vật gây bệnh.

Phần 3: Vật liệu và phương pháp

Chương này mô tả chi tiết nguồn gốc 105 chủng xạ khuẩn nội sinh từ cây quế Yên Bái, 09 chủng vi sinh vật kiểm định, hóa chất, thiết bị sử dụng và quy trình thực nghiệm:

• Nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường lắc YIM38 ($30^\circ\text{C}$, 200 vòng/phút trong 5 ngày), thu dịch nổi ly tâm phục vụ thử nghiệm khuếch tán giếng thạch.
• Phép thử màu định tính nhóm anthracycline với dung dịch acid/base.
• Quy trình tách chiết DNA, chu trình nhiệt PCR nhân bản gen pks-I, pks-II, nrps và gen 16S rDNA.
• Phương pháp khảo sát đặc điểm hình thái trên 9 môi trường thạch chuẩn, khả năng sinh sắc tố melanin, khả năng đồng hóa 13 nguồn cacbon và 13 nguồn nitơ, cùng khả năng chống chịu các yếu tố môi trường (nhiệt độ, pH, NaCl).

Phần 4: Kết quả và thảo luận

Chương 4 cung cấp toàn bộ số liệu thực nghiệm qua 4 nội dung chính:

1. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của 105 chủng xạ khuẩn:
   • Tuyển chọn được 36/105 chủng (tỷ lệ 34,3%) có khả năng ức chế ít nhất 01 chủng vi sinh vật kiểm định.
   • Tỷ lệ kháng vi sinh vật kiểm định dao động từ 3,8% (kháng Sarcina lutea) đến 21,0% (kháng Staphylococcus epidermidis). Có 08 chủng tạo vòng ức chế mạnh $\ge 20\text{ mm}$.

Vi sinh vật kiểm định	Nhóm phân loại	Số chủng có hoạt tính	Tỷ lệ (%)	Phân bố kích thước vòng vô khuẩn ($V_{kk}$, mm)
				$\le 10\text{ mm}$	$10-20\text{ mm}$	$\ge 20\text{ mm}$
Escherichia coli ATCC 11105	Gram (-)	9	8,6%	2	7	0
Proteus vulgaris CNLM	Gram (-)	20	19,1%	7	12	1
Salmonella enterica ATCC 14028	Gram (-)	19	18,1%	2	16	1
Enterobacter aerogenes ATCC 13048	Gram (-)	8	7,6%	2	6	0
Pseudomonas aeruginosa CNLM	Gram (-)	16	15,2%	2	7	7
Sarcina lutea CNLM	Gram (+)	4	3,8%	1	3	0
Staphylococcus epidermidis ATCC 12228	Gram (+)	22	21,0%	7	14	1
Bacillus cereus ATCC 11778	Gram (+)	15	14,3%	8	7	0
Candida albicans ATCC 10231	Nấm men	13	12,4%	6	4	3

2. Khuếch đại gen sinh tổng hợp kháng sinh và sàng lọc anthracycline:

   • Trong số 36 chủng có hoạt tính: 9 chủng mang gen pks-I (25,0%), 19 chủng mang gen pks-II (52,8%), 13 chủng mang gen nrps (36,1%).
   • Phát hiện 04 chủng xạ khuẩn (YBQ59, YBQ63, YBQ75, YBQ94) mang đồng thời cả 03 gen chức năng pks-I, pks-II, nrps.
   • Có 14 chủng không nhân bản được gen nào trong 3 loại gen trên mặc dù có hoạt tính đối kháng thực tế.
   • 30/36 chủng (chiếm 83,3%) cho phản ứng chuyển màu đặc trưng của nhóm anthracycline.

3. Đặc điểm sinh học của chủng tiềm năng YBQ75:

   • Chủng YBQ75 thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh trên nhiều chủng kiểm định (P. aeruginosa: 22,0 mm; S. epidermidis: 19,3 mm; S. enterica: 17,7 mm; P. vulgaris: 16,3 mm; E. aerogenes: 10,3 mm), đồng thời mang đủ 3 gen pks-I, pks-II, nrps và dương tính với phép thử anthracycline.
   • Hình thái: Khuẩn lạc tròn (đường kính 6-9 mm), khuẩn ty khí sinh màu vàng, khô, lồi, tạo nhú ở tâm; khuẩn ty cơ chất màu vàng đến vàng nâu; không tạo sắc tố melanin; tiết sắc tố tan màu vàng nhạt trên ISP1, ISP2, ISP3, ISP6 và Gauze 2.
   • Bào tử: Cuống sinh bào tử dạng thẳng hoặc hơi lượn sóng (dạng RF), chuỗi chứa 19-50 bào tử; bề mặt bào tử nhẵn (Sm), hình trụ.
   • Sinh hóa và điều kiện sinh trưởng: Đồng hóa được 10/13 nguồn cacbon và 9/13 nguồn nitơ thử nghiệm; sinh trưởng ở dải nhiệt độ $15-40^\circ\text{C}$ (tối ưu $30^\circ\text{C}$), nồng độ muối NaCl $0-5%$ (tối ưu 2%), pH từ 5-10 (tối ưu pH 7,0).

4. Định danh phân tử chủng YBQ75:

   • Khuếch đại và giải trình tự thành công đoạn gen 16S rDNA kích thước khoảng 1,4 kb.
   • So sánh BLAST trên GenBank cho thấy trình tự 16S rDNA của YBQ75 có độ tương đồng 100% với loài Streptomyces cavourensis (các chủng chuẩn NRRL 2740 và NBRC 13026) và 99% với Streptomyces albolongus NBRC 13465. Chủng được định danh chính thức là Streptomyces cavourensis YBQ75.

Phần 5: Kết luận và kiến nghị

Tóm tắt các phát hiện thực nghiệm cốt lõi về tỷ lệ kháng khuẩn, tỷ lệ mang gen chức năng và phân loại thành công chủng YBQ75; đồng thời đưa ra kiến nghị tiếp tục nghiên cứu tối ưu hóa môi trường và điều kiện lên men để thu nhận kháng sinh từ chủng Streptomyces cavourensis YBQ75.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính kèm số liệu

• Tuyển chọn được 36/105 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh cây quế có hoạt tính ức chế vi sinh vật kiểm định (34,3%).
• Xác định tỷ lệ mang gen sinh tổng hợp kháng sinh trên 36 chủng: gen pks-I đạt 25,0% (9 chủng), gen pks-II đạt 52,8% (19 chủng), gen nrps đạt 36,1% (13 chủng). Phát hiện 04 chủng mang cả 3 gen: YBQ59, YBQ63, YBQ75, YBQ94.
• Xác định 30/36 chủng (83,3%) có phản ứng màu dương tính với nhóm kháng sinh anthracycline.
• Định danh và phân loại toàn diện chủng xạ khuẩn tiềm năng YBQ75: thuộc chi Streptomyces, loài Streptomyces cavourensis (độ tương đồng 16S rDNA đạt 100%), có phổ ức chế rộng trên cả vi khuẩn Gram âm, Gram dương và mang đầy đủ 3 gen sinh tổng hợp kháng sinh.

Giải pháp và kiến nghị của tác giả

• Đề xuất tiếp tục tối ưu hóa thành phần môi trường nuôi cấy và các thông số điều kiện lên men (nhiệt độ, pH, nguồn dinh dưỡng) nhằm nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh của chủng Streptomyces cavourensis YBQ75.
• Cần thực hiện các nghiên cứu chuyên sâu về tách chiết, tinh sạch và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất kháng sinh (đặc biệt là anthracycline) sinh ra từ các chủng tiềm năng.

Đóng góp về mặt khoa học

• Cung cấp dẫn liệu thực nghiệm hệ thống đầu tiên về sự đa dạng sinh học và tiềm năng sinh kháng sinh của tập đoàn xạ khuẩn nội sinh phân lập từ cây quế (Cinnamomum loureirii Nees) tại khu vực Yên Bái.
• Chứng minh tính hiệu quả của phương pháp kết hợp sàng lọc kiểu hình (kháng khuẩn, thử màu anthracycline) với kỹ thuật sinh học phân tử (dò gen pks-I, pks-II, nrps bằng mồi suy biến) trong việc đánh giá nhanh nguồn gen vi sinh vật có giá trị dược lý.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Nghiên cứu mới dừng lại ở mức độ sàng lọc hoạt tính sinh học in vitro, xác định sự có mặt của các đoạn gen chức năng bằng kỹ thuật PCR mồi suy biến và thử nghiệm màu định tính nhóm anthracycline. Chưa tiến hành tách chiết, tinh sạch các hợp chất thứ cấp cũng như chưa xác định cấu trúc hóa học chính xác của hoạt chất kháng khuẩn. Bên cạnh đó, có 14 chủng thể hiện hoạt tính đối kháng nhưng không bắt cặp được với mồi pks/nrps sử dụng, cho thấy hạn chế về độ bao phủ của bộ mồi suy biến đối với các biến chủng tự nhiên.
• Hướng mở tiếp theo: Tối ưu hóa điều kiện lên men thu sinh khối và hoạt chất từ chủng Streptomyces cavourensis YBQ75; chiết xuất phân đoạn và tinh sạch hợp chất kháng sinh; kiểm tra độc tính tế bào và phổ kháng khối u của sản phẩm lên men; thiết kế thêm các bộ mồi mới để dò tìm các con đường trao đổi chất chưa được khuếch đại.

---

Giá trị tham khảo

• Đối tượng hưởng lợi: Tài liệu là nguồn tham khảo hữu ích cho sinh viên, học viên cao học, nghiên cứu sinh và các cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Công nghệ sinh học, Vi sinh vật học, Dược học, Hóa sinh và Bảo vệ thực vật.
• Nội dung giá trị:
  • Quy trình chi tiết về sàng lọc hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp đục lỗ thạch và thử nghiệm định tính nhóm anthracycline bằng kiềm/acid.
  • Trình tự mồi suy biến và chu trình nhiệt PCR để nhân bản các đoạn gen sinh tổng hợp pks-I, pks-II, nrps và 16S rDNA.
  • Bảng dẫn liệu chi tiết về đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa (khả năng đồng hóa 13 loại đường và 13 loại acid amin) cùng ngưỡng thích ứng môi trường của chủng Streptomyces cavourensis.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Khóa luận đã khảo sát tổng cộng bao nhiêu chủng xạ khuẩn và bao nhiêu chủng có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định?
Nghiên cứu đã tiến hành khảo sát hoạt tính đối kháng trên tổng số 105 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh phân lập từ cây quế Yên Bái, qua đó tuyển chọn được 36 chủng có hoạt tính ức chế đối với ít nhất một trong 09 chủng vi sinh vật kiểm định (đạt tỷ lệ 34,3%).

2. Ba bộ mồi suy biến nào được sử dụng để khuếch đại các gen chức năng sinh tổng hợp kháng sinh và kích thước sản phẩm mong đợi là bao nhiêu?
Ba cặp mồi suy biến được sử dụng gồm:

• Cặp mồi K1F/M6R khuếch đại gen pks-I, sản phẩm PCR có kích thước khoảng 1400 bp.
• Cặp mồi KSaF/KSaR khuếch đại gen pks-II, sản phẩm PCR có kích thước khoảng 600 bp.
• Cặp mồi A3F/A7R khuếch đại gen nrps, sản phẩm PCR có kích thước khoảng 750 bp.

3. Có bao nhiêu chủng xạ khuẩn mang đồng thời cả ba gen pks-I, pks-II và nrps?
Trong số 36 chủng được phân tích di truyền, có 04 chủng xạ khuẩn mang đồng thời cả 03 gen chức năng trên, ký hiệu là: YBQ59, YBQ63, YBQ75 và YBQ94.

4. Phép thử màu nhận biết nhóm kháng sinh anthracycline được thực hiện như thế nào và kết quả ra sao?
Phép thử dựa trên sự đổi màu của vòng anthraquinone theo pH: nhỏ $50\ \mu\text{l}\text{ NaOH } 2,0\text{ N}$ và $50\ \mu\text{l}\text{ HCl } 1,0\text{ N}$ vào các giếng thạch nuôi cấy xạ khuẩn sau 5 ngày; phản ứng dương tính khi xuất hiện màu tím ở pH kiềm và màu vàng cam ở pH acid. Kết quả cho thấy 30/36 chủng xạ khuẩn thử nghiệm (83,3%) dương tính với phản ứng này.

5. Chủng xạ khuẩn tiêu biểu YBQ75 được định danh là loài nào và có đặc điểm sinh trưởng tối ưu ra sao?
Dựa trên hình thái học, đặc tính sinh hóa và trình tự gen 16S rDNA có độ tương đồng 100% với dữ liệu GenBank, chủng YBQ75 được định danh là Streptomyces cavourensis YBQ75. Chủng này sinh trưởng tối ưu ở nhiệt độ $30^\circ\text{C}$, nồng độ muối NaCl 2% và pH ban đầu 7,0.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Hoàng Thị Tròn đã hoàn thành toàn diện việc sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn và đánh giá tiềm năng di truyền của 105 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế thu thập tại tỉnh Yên Bái. Nghiên cứu xác định được 36 chủng có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định, trong đó tỷ lệ mang các gen sinh tổng hợp pks-I, pks-II, nrps lần lượt là 25,0%, 52,8%, 36,1% và 83,3% chủng có khả năng sinh kháng sinh nhóm anthracycline. Chủng ưu việt YBQ75 đã được khảo sát sinh học chi tiết và định danh chính xác là Streptomyces cavourensis YBQ75, cung cấp cơ sở dữ liệu quan trọng cho các nghiên cứu lên men thu nhận hoạt chất kháng sinh tự nhiên phục vụ y dược học.

Trích đoạn nội dung tài liệu

đặt vấn đề, xử lý vần đề, phương pháp nghiên cứu một vấn đề khoa học, xử lý, phân tích số liệu, trình bày đề tài khoa học. 4 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Xạ khuẩn nội cộng sinh trên thực vật 2. Xạ khuẩn nội cộng sinh và mối tương tác giữa xạ khuẩn với cây chủ Hiện nay, trên thế giới có nhiều công trình nghiên cứu công bố về mối quan hệ giữa thực vật và vi sinh vật (VSV), trong đó VSV đóng vai trò như tác nhân kiểm soát sinh học, tổng hợp các chất kích thích sinh trưởng, phân giải phospho khó hoà tan, cố định nitơ tự do, tăng độ phì của đất.

Kể từ khi Smith phân lập thành công chủng xạ khuẩn Micromonospora sp. có khả năng ức chế nấm bệnh Fusarium oxysporum trong mô tế bào cà chua không nhiễm bệnh, đã có nhiều định nghĩa về VSV nội cộng sinh. Hiện nay, định nghĩa của Bacon và White (2000): "VSV nội cộng sinh là những VSV sinh trưởng trong mô tế bào thực vật, mà không gây ra những hiệu ứng xấu nào tới cây chủ" đã được các nhà vi sinh vật học thừa nhận [8]. Theo tài liệu, định nghĩa này hàm chứa một ý rất quan trọng: VSV nội cộng sinh không những không gây ảnh hưởng mà còn tăng cường khả năng trao đổi chất, kích thích sinh trưởng, miễn dịch cho vật chủ bằng cách tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất.[14] Những nghiên cứu trên thế giới đã khẳng định vai trò của xạ khuẩn trong sinh tổng hợp chất kháng sinh.

Sự đa dạng của xạ khuẩn cộng sinh trong cây dược liệu là vô cùng phong phú, hứa hẹn tiềm năng ứng dụng các hợp chất có hoạt tính sinh học do các chủng xạ khuẩn này sinh ra trong mọi lĩnh vực của đời sống. Các hợp chất có hoạt tính sinh học được chứng minh là rất đa dạng về mặt số lượng và hoạt tính sinh học như các chất kiểm soát sinh học, chất kháng VSV gây bệnh, kháng khối u, chống oxy hóa, chống sốt rét, chất diệt cỏ, chất kích thích sinh trưởng. Vì vậy, nghiên cứu sàng lọc các hợp 5 chất có hoạt tính sinh học nói chung và hoạt tính kháng sinh nói riêng từ xạ khuẩn cộng sinh trên cây dược liệu tự nhiên đang là hướng nghiên cứu triển vọng của các nhà khoa học trên thế giới. Khi nghiên cứu về xạ khuẩn nội cộng sinh, câu hỏi được đặt ra là làm sao xạ khuẩn có thể xâm nhập vào cây chủ? Và làm thế nào xạ khuẩn có thể sinh trưởng trong các bộ phận của cây và mô tế bào? Để làm sáng tỏ câu hỏi trên, các nhà khoa học đã gây nhiễm chủng Streptomyces scabies trên bề mặt củ khoai tây.

Sau 4-6 ngày, chủng Streptomyces scabies hình thành mạng lưới phủ trên bề mặt củ khoai tây và xâm nhập vào củ thông qua lỗ trên bề mặt vỏ non hay vết thương khi khoai tây đang trong giai đoạn phát triển. Nối tiếp thí nghiệm trên, tiến hành lây nhiễm chủng S. ipomoeae trên rễ khoai tây đã cho kết quả tương tự. Từ kết quả nghiên cứu trên các nhà vi sinh vật học đã khẳng định rằng hầu hết xạ khuẩn hình thành hệ sợi phát triển trên bề mặt cây và xâm nhập vào vật chủ thông qua các lỗ hở tự nhiên hay tổn thương do côn trùng [26].

Xạ khuẩn nội cộng sinh xâm nhập vào cây chủ rất sớm và ảnh hưởng đến sự phát triển của vật chủ. Gần đây, Franco (2007) đã quan sát khuẩn lạc của chủng xạ khuẩn EN27-GFP ở rễ tinh, đặc biệt tại các điểm nối, các vết nứt xung quanh rễ hình thành bào tử trong 3-4 tuần [13]. Kết quả cho thấy sự lây nhiễm chủng xạ khuẩn vào rễ cây thông qua các đường nứt trên rễ và sau đó nhân lên trong các mô tế bào. Trong nghiên cứu của mình, Shimizu và cộng sự đã ủ Streptomyces sp.

MBCu-56 trên lá dưa chuột, theo dõi sự phát triển. Ban đầu, khuẩn ty phát triển mạnh trên bề mặt lá và hình thành khối hệ sợi dày đặc nhất là ở nhánh phân chia các tế bào biểu bì. Một số sợi đã xâm nhập lớp biểu bì và phát triển sang các tế bào biểu bì khác (Hình 2. Tuy nhiên, quan sát của họ không đủ để chứng minh sự tăng trưởng ở nội bào trong lớp biểu bì [30].

6 Năm 2005, Suzuki và cộng sự đã chứng minh quá trình xâm nhập vào mô lá cây đỗ quyên của chủng S. galbus MBR-5 và xác nhận rằng hệ sợi của chủng xâm nhiễm vào mô tế bào lá đã bị tổn thương thông qua các lỗ không khí. Ngoài ra, chủng MBR-5 được chứng minh là có khả năng sinh các enzyme thủy phân cellulase, xylanase và pectinase. Hỗn hợp enzyme từ khuẩn ty tăng cường khả năng bám dính [46].1: Ảnh quét hiển vi điện tử của bề mặt lá dƣa chuột sau 8 ngày gây nhiễm với Streptomyces sp.

(A) Hệ sợi trên bề mặt lá. (B) Hệ sợi của xạ khuẩn xâm nhập và phát triển trên, dƣới bề mặt của lớp biểu bì. Đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn Theo hệ thống phân loại hiện nay xạ khuẩn thuộc nhóm Prokaryota, thuộc giới Monera trong hệ 5 giới của Whittaken, còn theo hệ thống phân loại chia sinh giới thành 7 giới thì xạ khuẩn thuộc giới Prokaryota [1]. Xạ khuẩn nội cộng sinh sống trong các cơ quan khác nhau (rễ, thân, lá, hoa, quả và hạt) của cây chủ và chủ yếu cư trú trong khoảng không giữa các mô hoặc nội bào.

Đáng chú ý, thực vật có khoảng 300.000 loài trên trái đất, mỗi loài thực vật là nơi cư trú của rất nhiều loài xạ khuẩn nội cộng sinh. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn * Đặc điểm hình thái tế bào, bào tử Năm 1957, Gauze và cộng sự đã công bố hệ thống phân loại mới. Hệ thống này dựa vào màu sắc khuẩn ty khí sinh (KTKS), khuẩn ty cơ chất (KTCC), hình dạng bào tử và cuống sinh bào tử. Hệ thống này cũng được chỉnh lí và tái bản năm 1983.

Số lượng hệ thống phân loại xạ khuẩn ngày một tăng trong những năm gần. Đó là hình thức phân loại truyền thống dựa trên đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy. Theo Pridham và cộng sự chia cuống sinh bào tử xạ khuẩn chia thành 3 nhóm: RF cho những cuống sinh bào tử thẳng và lượn sóng; RA cho những cuống sinh bào tử xoắn, thô sơ và ngắn; S cho những cuống sinh bào tử phát triển mạnh và xoắn. Bề mặt bào tử thành 5 dạng chính Sm (trơn nhẵn), sp (gai), wa (xù xì), ru ( nếp nhăn), ha (tóc) [41].

* Đặc điểm sinh lý – sinh hóa Đặc điểm sinh lý, sinh hóa là khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và nitơ, nhu cầu các chất kích thích sinh trưởng, khả năng biến đổi các chất khác nhau nhờ hệ thống enzyme. Ngoài ra còn có nhu cầu về oxy, giới hạn pH, nhiệt độ tối ưu, khả năng chịu muối và các yếu tố khác của môi trường, mối quan hệ với chất kìm hãm sinh trưởng và phát triển khác nhau, tính chất đối kháng và nhạy cảm với chất kháng sinh, khả năng tạo thành chất kháng sinh và các sản phẩm trao đổi chất đặc trưng khác của xạ khuẩn. Phân loại xạ khuẩn bằng phân tích trình tự gen 16S rDNA Từ những năm 80 trở lại đây, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, các nhà khoa học đã có một công cụ mới để phân loại sinh vật đó là phân loại học phân tử. Phương pháp này có ưu điểm là thời gian ngắn và có độ chính xác cao.

Phân loại học phân tử có thể dựa trên các gen hoặc các sản phẩm của gen. Trong hệ thống phân loại xạ khuẩn hiện nay, thường sử dụng 3 8 phương pháp chính là lai DNA, lai RNA và phân tích trình tự gen mã hóa 16S rDNA [1]. Hiện nay, việc nghiên cứu rDNA là phương pháp hữu hiệu nhất để xác định mối quan hệ trên cây phát sinh chủng loại, vì rDNA có mặt trong tất cả các sinh vật, có chức năng xác định và có tính bảo thủ cao [33]. Chúng chỉ khác nhau rất ít giữa các nhóm sinh vật.

Tuy nhiên, dựa vào sự khác nhau này người ta có thể đánh giá được mối quan hệ phát sinh chủng loại và phân loại các chủng VSV. Trong tế bào VSV nhân sơ, ribosome tồn tại trong tế bào chất. Ribosome có cấu trúc gồm 2 tiểu phần, mỗi tiểu phần gồm có rDNA và protein riêng rẽ. Ribosome là VSV nhân sơ có hằng số lắng 70S gồm 2 tiểu đơn vị 50S (gồm rDNA 5S, rDNA 23S và 31 phân tử protein) và 30S (gồm rDNA 16S và 21 phân tử protein) [1].

Các gen mã hóa 5S rSNA, 16S rDNA, 23S rDNA nằm cạnh nhau, có cùng một operon và có cơ chế điều hòa chung. Trong các loại rDNA thì 16S rDNA là phù hợp nhất cho nghiên cứu phân loại xạ khuẩn vì gen mã hóa 16S rDNA có kích thước khoảng 1540 bp phù hợp cho nghiên cứu phân loại; còn gen mã hóa 5S rDNA có kích thước khoảng 120 bp, tuy dễ xác định trình tự nhưng lại không đặc hiệu cho phân loại; còn gen mã hóa 23S rDNA cũng là một gen tiềm năng cho phân tích so sánh trình tự để phân loại sinh vật nhân sơ nhưng trình tự của gen này lại tương đối lớn 2900 bp, gây khó khăn cho tách dòng và phân tích trình tự nên ít được sử dụng hơn. Keswani và cộng sự đã chứng minh rằng nếu sự tương đồng giữa hai trình tự 16S rDNA là 98,6% thì xác suất để mức độ giống trong phép lai DNA thấp hơn 70% sẽ là 99% [44]. Vì thế giá trị tương đồng 98,6% của trình tự 16S rDNA được coi là ngưỡng để phân biệt hai loài khác nhau.

Tiềm năng ứng dụng của xạ khuẩn nội cộng sinh * Kháng ung thư và kháng viêm 9 Trong những năm gần đây, nhu cầu tìm kiếm chất có hoạt tính kháng và ức chế tế bào ung thư từ chủng xạ khuẩn nội cộng sinh đang là hướng đi mới của các nhà khoa học. Nhiều công bố khẳng định, xạ khuẩn nội cộng sinh sống có mối quan hệ phức tạp, chặt chẽ với cây chủ [43]. Một giả thuyết được đưa ra rằng gen mã hóa cho chất có hoạt tính sinh học được sinh ra từ quá trình trao đổi giữa vi sinh vật và thực vật thông qua hệ thống chuyển gen ngang (horizontal gene transfer, HGT). Do đó, có thể sản xuất các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật nhờ quá trình nuôi cấy VSV, ví dụ như chất kháng tế bào ung thư paclitaxel phổ biến trên cây thông đỏ (Taxus sp.) được tách chiết từ chủng xạ khuẩn Kitasatospora sp.