I HỌ QU GI H N I TRƢ NG I HỌ HO HỌ TỰ NHI N ----------------------- Nguyễn Thị Thu Huyên SỰ D NG DI TRUYỀN Ủ Á HỦNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS PHÂN LẬP ƢỢ Ở BẾP ĂN TẬP THỂ T I MỘT SỐ TRƢ NG TIỂU HỌ BÁN TRÚ HÀ NỘI LUẬN V N TH S KHO HỌ Hà Nội – Năm 2018 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com I HỌ QU GI H N I TRƢ NG I HỌ HO HỌ TỰ NHI N ----------------------- Nguyễn Thị Thu Huyên SỰ D NG DI TRUYỀN Ủ Á HỦNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS PHÂN LẬP ƢỢ Ở BẾP ĂN TẬP THỂ T I MỘT SỐ TRƢ NG TIỂU HỌ BÁN TRÚ HÀ NỘI Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 8420101.07 LUẬN V N TH S KHO HỌ NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHO HỌ : TS. PH M THẾ HẢI Hà Nội – Năm 2018 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Thu Huyên – K24 Lời cảm ơn Đối với mỗi học viên cao học uận văn tốt nghiệp là một công trình nghiên cứu khoa học nhỏ nhưng ại mang ý nghĩa vô cùng to ớn đánh dấu một bước trưởng thành của mỗi người trên con đường nghiên cứu khoa học. Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Phạm Thế Hải – Bộ môn Vi sinh vật học, khoa Sinh học Đại học Khoa học Tự nhiên ĐHQGHN người đã dành nhiều thời gian, công sức, tận tình hướng dẫn giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành đề tài này.
Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Nguyễn Thị Giang – Trung tâm dịch vụ Khoa học kỹ thuật, Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia người đã chỉ bảo giúp đỡ và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị thuộc khoa Vi sinh vật học, Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã chỉ bảo giúp đỡ tôi tận tình và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu. Tôi cũng xin cảm ơn các cô các chị phòng thí nghiệm Sinh học phân tử Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã hướng dẫn tạo mọi điều kiện cho tôi thực hiện đề tài trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã uôn bên cạnh, động viên, khuyến khích, chia sẻ và tạo mọi điều kiện tốt nhất trong suốt quá trình học tập để tôi đạt được kết quả như ngày hôm nay. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 08 tháng 10 năm 2018 Nguyễn Thị Thu Huyên TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Thu Huyên – K24 L I M O N Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả Nguyễn Thị Thu Huyên TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Thu Huyên – K24 MỤ LỤ ẶT VẤN Ề.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn. Ngộ độc thực phẩm do tụ cầu vàng. Tình hình ngộ độc thực phẩm do tụ cầu vàng.
Giới thiệu chung về Staphylococcus aureus. Giới thiệu về Staphylococcus. Hình thái, đặc điểm sinh hóa. iều kiện sinh trƣởng.
Sự phân bố. Khả năng gây bệnh. Khả năng kháng kháng sinh. ác yếu tố độc lực và cấu trúc kháng nguyên.
Một số phƣơng pháp nghiên cứu đa dạng di truyền Staphylococcus aureus. Phân tích plasmid. Phân tích DN nhiễm sắc thể sau khi xử lý enzyme cắt giới hạn (RE ). Phƣơng pháp lai đầu dò (Southern blotting).
Phƣơng pháp điện di trƣờng xung (PFGE). ác kỹ thuật dựa trên phản ứng chuỗi polymerase (P R). Multilocus Sequence Typing (MLST). Tình hình nghiên cứu Staphylococcus aureus trong và ngoài nƣớc.
22 HƢƠNG II: NGUYÊN LIỆU V PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN ỨU. ối tƣợng và địa điểm nghiên cứu. Các hóa chất, môi trƣờng và thiết bị thí nghiệm. Thiết bị thí nghiệm.
Phƣơng pháp nghiên cứu. 25 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Thu Huyên – K24 2. Phân lập các chủng Staphylococcus aureus. Tách chiết DN tổng số.
P R xác định các gen sinh độc tố ruột của S. PFGE xác định mối quan hệ di truyền giữa các chủng. 29 HƢƠNG III: KẾT QUẢ. Kết quả phân lập các chủng Staphylococcus aureus trong thực phẩm.
Hình thái khuẩn lạc. Hình thái nhuộm Gram. Kết quả thử phản ứng coagulase. Kết quả phân loại các gen coa và gen sinh độc tố ruột của S.
aureus bằng kỹ thuật PCR. Kết quả chạy gen coa bằng P R. Kết quả phân loại các gen sinh độc tố ruột của S. Kết quả PFGE xác định đa dạng di truyền giữa các chủng S.
43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 50 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Thu Huyên – K24 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT bp Base pair (cặp bazơ) DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleic triphosphate ET Exfoliative toxin ( ộc tố chốc lở da) MRSA Methicillin resistant Staphylococcus aureus (Tụ cầu vàng kháng Methicillin) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng trùng hợp chuỗi) PFGE Pulsed-field Gel Electroforesis ( iện di trƣờng xung) SE Staphylococcal Enterotoxin ( ộc tố ruột tụ cầu) TSST Toxin Shock Syndrome Toxin ( ộc tố hội chứng sốc) VRSA Vancomicin resistant Staphylococcus aureus (Tụ cầu vàng kháng Vancomicin) TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Thu Huyên – K24 D NH MỤ BẢNG BIỂU Bảng 1. Các tác nhân vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm ở Pháp năm 1999-2000 (%) [30].
3 Bảng 2: Các loại hóa chất. Trình tự mồi và kích thƣớc sản phẩm PCR [62]. Thành phần các chất ủ enzyme cắt giới hạn. Số lƣợng các chủng S.
aureus trên các đối tƣợng mẫu. Nguồn gốc các chủng S. 45 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Thu Huyên – K24 D NH MỤ HÌNH ẢNH Hình 1. Hình thái nhuộm Gram của các tế bào Staphylococcus aureus [20].
Khuẩn lạc của S. aureus trên môi trƣờng thạch máu sau 24 giờ nuôi cấy [20]. Khuẩn lạc của S. aureus trên môi trƣờng Baird Parker [10].
Khuẩn lạc của S. aureus trên môi trƣờng MSA [35]. Vị trí nhiễm trùng và bệnh do Staphylococcus aureus gây ra [59]. Các yếu tố độc lực của Staphylococcus aureus [59].
Tạo plug chủng vi khuẩn. Rửa plug bằng đệm. Cắt plug thành các miếng nhỏ. Hình ảnh mô tả đổ gel điện di.
iện di gel dƣới trƣờng xung. Khuẩn lạc của Staphylococcus aureus trên môi trƣờng Baird-Parker. Kết quả nhuộm Gram. Kết quả thử phản ứng đông huyết tƣơng của S.
Kết quả điện di sản phẩm chạy PCR gen coa. Kết quả điện di các chủng dƣơng tính với gen sinh độc tố. Biểu đồ phân bố các chủng S. aureus theo gen sinh độc tố.
Kết quả điện di trƣờng xung (PFGE). Kết quả phân tích quan hệ các chủng bằng PFGE. 45 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Thu Huyên – K24 ẶT VẤN Ề Hiện nay, ngộ độc thực phẩm, bao gồm ngộ độc do nhiễm khuẩn đang là vấn đề nghiêm trọng trên thế giới, đặc biệt là ở Việt Nam. Hàng năm, các bệnh lây truyền qua thực phẩm ảnh hƣởng tới hàng triệu ngƣời, nhiều ngƣời trong số đó bị những rối loạn nghiêm trọng, biến chứng lâu dài hoặc tử vong do ăn phải thực phẩm không an toàn.
ác bệnh lây truyền qua thực phẩm là mối quan tâm lớn trên toàn thế giới. Cho đến nay, khoảng 250 bệnh lây truyền qua thực phẩm khác nhau đã đƣợc mô tả. Ở hầu hết các nƣớc, vi khuẩn là nguyên nhân hàng đầu gây ra các bệnh lây truyền qua thực phẩm, chiếm khoảng 2/3 số dịch bệnh. Nhiều vi khuẩn (bao gồm cả vi khuẩn Gram dƣơng và Gram âm) sản sinh các độc tố gây ngộ độc thực phẩm, dẫn đến các triệu chứng khác nhau, từ rối loạn tiêu hóa đến tê liệt và chết.
Trong số những vi khuẩn ấy, phải kể đến Salmonella, Clostridium perfringen, Clostridium botulinum, Bacillus cereus…và đặc biệt là Staphylococcus aureus (hay còn gọi là tụ cầu vàng). aureus đƣợc xem là một trong ba tác nhân chính gây ngộ thực phẩm chính ở nhiều nƣớc trên thế giới, chỉ sau Salmonella và Clostridium perfringen. aureus là một thành viên của hệ vi khuẩn ở ngƣời. Phần lớn các chủng đều có một hay một số gen độc lực liên quan đến tình trạng nhiễm trùng hay các bệnh lý khác nhau.
húng mang một số gen chịu trách nhiệm sản xuất các độc tố ruột, độc tố gây hội chứng sốc, hay một số gen liên quan đến hiện tƣợng kháng kháng sinh…. Trên thế giới, ngày càng có nhiều nghiên cứu dịch tễ học phân tử của S. aureus và mối liên quan giữa các yếu tố độc lực, các kiểu gen…. Ngộ độc thực phẩm do tụ cầu là kết quả của việc tiêu thụ thực phẩm có chứa độc tố ruột enterotoxin của loài vi khuẩn này.
aureus là nguyên nhân chính gây ngộ độc thực phẩm. Do khí hậu nóng ẩm, thiếu các điều kiện bảo quản phù hợp, S. aureus xuất hiện với số lƣợng lớn trong thực phẩm. Nƣớc ta cũng đã có nhiều công trình nghiên cứu khoa học về tụ cầu của một số nhóm tác giả.
Tuy nhiên, các công trình nghiên cứu này vẫn chỉ dừng lại ở mức độ tìm hiểu đặc tính của chúng, xác định các kiểu gen độc tố mà chƣa đi sâu vào việc đánh giá mối quan hệ di truyền của chúng. Và hiện vẫn chƣa có nhóm nghiên cứu nào áp dụng kỹ thuật PFGE để điều tra 1 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Thu Huyên – K24 dịch tễ, đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các chủng. Do đó, đề tài “Sự đa dạng di truyền của các chủng Staphylococcus aureus phân lập đƣợc ở bếp ăn tập thể tại một số trƣờng tiểu học bán trú Hà Nội” đƣợc thực hiện với mục tiêu: 1. Phân lập các chủng Staphylococcus aureus trong thực phẩm tại một số bếp ăn tập thể.
ánh giá sự đa dạng di truyền giữa các chủng S. Từ đó xác định con đƣờng lây nhiễm tụ cầu vàng trong thực phẩm. 2 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Thu Huyên – K24 HƢƠNG I. TỔNG QU N TÀI LIỆU 1.
Ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn ác bệnh gây ra bởi thực phẩm là mối quan tâm hàng đầu trên thế giới.