Luận văn thạc sĩ chiết xuất phân lập một số hợp chất trong lá trà hoa vàng cúc phương camellia cucphuongensis ninh rosmann

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu chiết xuất phân lập một số hợp chất trong lá trà hoa vàng cúc phương camellia cucphuongensis ninh, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất biện

• Tác giả: Trần Thị Thơm
• Người hướng dẫn: TS. Vũ Đức Lợi
• Trường học: Đại học Quốc Gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược Học
• Đề tài: Chiết Xuất, Phân Lập Một Số Hợp Chất Trong Lá Trà Hoa Vàng Cúc Phương (Camellia Cucphuongensis Ninh & Rosmann)
• Loại tài liệu: Khóa Luận Tốt Nghiệp Đại Học
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Về thực vật
• 1.2. Vị trí phân loại của chi Camellia L. và loài Camellia cucphuongensis
• 1.3. Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Camellia L.
• 1.4. Đặc điểm thực vật và phân bố của loài Camellia cucphuongensis
• 1.5. Thành phần hóa học
• 1.5.1. Thành phần hóa học của chi Camellia
• 1.5.2. Nhóm sterol và tinh dầu
• 1.5.3. Nhóm acid amin và vitamin
• 1.6. Thành phần hóa học của các loài Trà hoa vàng
• 1.6.1. Nhóm tinh dầu
• 1.6.2. Nhóm acid amin
• 1.6.3. Tác dụng sinh học
• 1.6.3.1. Tác dụng chống oxi hóa
• 1.6.3.2. Tác dụng chống ung thư
• 1.6.3.3. Tác dụng kháng khuẩn
• 1.6.3.4. Tác dụng giảm cân và làm đẹp
• 1.6.3.5. Tác dụng theo y học cổ truyền
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Nguyên liệu và thiết bị
• 2.2. Đối tượng nghiên cứu
• 2.3. Nguyên vật liệu nghiên cứu
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Phương pháp định tính các nhóm chất
• 2.4.2. Phương pháp chiết xuất và phân lập
• 2.4.3. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất
• 3. CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Định tính các nhóm chất hữu cơ thường gặp bằng phản ứng hóa học
• 3.2. Định tính các nhóm chất trong dịch chiết ether dầu hỏa
• 3.3. Định tính các nhóm chất trong dịch chiết cồn
• 3.4. Định tính các nhóm chất trong dịch chiết nước
• 3.5. Định tính các nhóm chất khác
• 3.6. Chiết xuất và phân lập các chất
• 3.6.1. Chiết xuất cao toàn phần và cao phân đoạn
• 3.6.2. Chiết xuất và phân lập hợp chất CC1
• 3.6.3. Chiết xuất và phân lập hợp chất CC5
• 3.7. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được
• 3.7.1. Hợp chất CC1
• 3.7.2. Hợp chất CC5
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Chiết Xuất Hợp Chất Từ Lá Trà Hoa Vàng Cúc Phương

Chiết xuất hợp chất từ lá trà hoa vàng Cúc Phương (Camellia cucphuongensis) đang thu hút sự chú ý của nhiều nhà nghiên cứu. Loài trà này không chỉ nổi bật với vẻ đẹp mà còn chứa nhiều hợp chất có lợi cho sức khỏe. Nghiên cứu về thành phần hóa học của lá trà hoa vàng cho thấy sự phong phú của các nhóm chất như polyphenol, flavonoid và saponin. Những hợp chất này có tác dụng chống oxi hóa, chống ung thư và kháng khuẩn, góp phần nâng cao sức khỏe con người.

1.1. Đặc Điểm Thực Vật Của Camellia cucphuongensis

Camellia cucphuongensis là loài trà đặc hữu của Việt Nam, được phát hiện tại Vườn Quốc gia Cúc Phương. Cây có chiều cao từ 3-6m, lá thuôn dài, hoa màu vàng, và thường nở từ tháng 10 đến tháng 2 năm sau. Đặc điểm này không chỉ tạo nên sự hấp dẫn mà còn là cơ sở cho việc nghiên cứu và chiết xuất các hợp chất có giá trị.

1.2. Tác Dụng Của Trà Hoa Vàng Đối Với Sức Khỏe

Trà hoa vàng Cúc Phương được biết đến với nhiều tác dụng tích cực như chống oxi hóa, chống ung thư và kháng khuẩn. Nghiên cứu cho thấy các hợp chất trong trà có khả năng giảm nguy cơ mắc bệnh và cải thiện sức khỏe tổng thể. Điều này đã được chứng minh qua nhiều nghiên cứu khoa học và y học cổ truyền.

II. Vấn Đề Trong Nghiên Cứu Chiết Xuất Hợp Chất Từ Lá Trà

Mặc dù có nhiều lợi ích, việc chiết xuất hợp chất từ lá trà hoa vàng Cúc Phương vẫn gặp phải một số thách thức. Các vấn đề như phương pháp chiết xuất, độ tinh khiết của hợp chất và khả năng tái tạo nguồn nguyên liệu là những yếu tố cần được xem xét kỹ lưỡng.

2.1. Thách Thức Trong Phương Pháp Chiết Xuất

Việc lựa chọn phương pháp chiết xuất phù hợp là rất quan trọng. Các phương pháp như chiết xuất bằng dung môi, chiết xuất siêu tới hạn hay chiết xuất bằng nước đều có ưu nhược điểm riêng. Cần nghiên cứu để tìm ra phương pháp tối ưu nhất nhằm đảm bảo hiệu suất và chất lượng của hợp chất chiết xuất.

2.2. Độ Tinh Khiết Của Hợp Chất Chiết Xuất

Độ tinh khiết của hợp chất chiết xuất ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả sử dụng. Việc phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất cần được thực hiện một cách chính xác để đảm bảo chất lượng sản phẩm cuối cùng. Các phương pháp phân tích như NMR và HPLC thường được áp dụng trong nghiên cứu này.

III. Phương Pháp Chiết Xuất Hợp Chất Từ Lá Trà Hoa Vàng Cúc Phương

Có nhiều phương pháp chiết xuất hợp chất từ lá trà hoa vàng Cúc Phương. Mỗi phương pháp có những ưu điểm và nhược điểm riêng, ảnh hưởng đến chất lượng và hiệu suất của hợp chất chiết xuất.

3.1. Chiết Xuất Bằng Dung Môi

Phương pháp chiết xuất bằng dung môi là một trong những phương pháp phổ biến nhất. Dung môi như ethanol, methanol hoặc nước được sử dụng để hòa tan các hợp chất có trong lá trà. Phương pháp này dễ thực hiện và cho hiệu suất cao, nhưng cần chú ý đến độ an toàn của dung môi.

3.2. Chiết Xuất Siêu Tới Hạn

Chiết xuất siêu tới hạn là một phương pháp hiện đại, sử dụng CO2 ở trạng thái siêu tới hạn để chiết xuất hợp chất. Phương pháp này giúp tăng cường hiệu suất chiết xuất và giảm thiểu sự phân hủy của các hợp chất nhạy cảm với nhiệt độ.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Về Hợp Chất Chiết Xuất Từ Lá Trà

Nghiên cứu về hợp chất chiết xuất từ lá trà hoa vàng Cúc Phương đã cho thấy nhiều kết quả khả quan. Các hợp chất được phân lập và xác định cấu trúc đã chứng minh được tác dụng sinh học của chúng.

4.1. Các Hợp Chất Được Phân Lập

Trong nghiên cứu, một số hợp chất như flavonoid và polyphenol đã được phân lập thành công. Những hợp chất này không chỉ có giá trị dinh dưỡng mà còn có tác dụng chống oxi hóa mạnh mẽ, góp phần nâng cao sức khỏe.

4.2. Tác Dụng Sinh Học Của Hợp Chất

Các hợp chất chiết xuất từ lá trà hoa vàng Cúc Phương đã được nghiên cứu về tác dụng sinh học. Chúng cho thấy khả năng chống ung thư, kháng khuẩn và chống viêm, mở ra hướng đi mới cho việc phát triển sản phẩm từ thiên nhiên.

V. Kết Luận Về Chiết Xuất Hợp Chất Từ Lá Trà Hoa Vàng Cúc Phương

Chiết xuất hợp chất từ lá trà hoa vàng Cúc Phương là một lĩnh vực nghiên cứu đầy tiềm năng. Những kết quả đạt được không chỉ khẳng định giá trị của loài trà này mà còn mở ra cơ hội cho việc phát triển các sản phẩm chăm sóc sức khỏe từ thiên nhiên.

5.1. Tương Lai Của Nghiên Cứu

Nghiên cứu về chiết xuất hợp chất từ lá trà hoa vàng Cúc Phương cần được tiếp tục mở rộng. Việc tìm hiểu sâu hơn về thành phần hóa học và tác dụng sinh học sẽ giúp phát triển các sản phẩm mới, đáp ứng nhu cầu thị trường.

5.2. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Hợp Chất Chiết Xuất

Các hợp chất chiết xuất từ lá trà hoa vàng có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm chức năng, mỹ phẩm và dược phẩm. Điều này không chỉ mang lại lợi ích cho sức khỏe mà còn góp phần bảo vệ môi trường.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong lĩnh vực nghiên cứu hóa học các hợp chất thiên nhiên và phát triển nguồn dược liệu, các thảo dược thuộc chi Trà (Camellia L., họ Theaceae) từ lâu đã thu hút sự chú ý của giới khoa học nhờ giá trị sử dụng phong phú và các tác dụng sinh học có lợi cho sức khỏe như chống oxy hóa, chống lão hóa và phòng ngừa khối u. Trong số các loài thuộc chi này, nhóm Trà hoa vàng là nguồn tài nguyên thực vật đặc hữu, có giá trị sinh học và kinh tế cao.

Việt Nam được ghi nhận là một trong những trung tâm phân bố đa dạng của các loài Trà hoa vàng trên thế giới với hơn 40 loài đã được công bố. Loài Trà hoa vàng Cúc Phương (Camellia cucphuongensis Ninh & Rosmann) được phát hiện và công bố lần đầu tiên vào năm 1995 bởi hai nhà thực vật học Jean-Claude Rosmann và TS. Trần Ninh tại Vườn Quốc gia Cúc Phương, tỉnh Ninh Bình. Đây là loài thực vật đặc hữu của Việt Nam, sinh trưởng chủ yếu tại vùng thung lũng ẩm ướt ở độ cao 300–400 m. Mặc dù nhiều loài Trà hoa vàng đã được mô tả về mặt hình thái học và phân loại học, các dữ liệu thực nghiệm chuyên sâu về thành phần hóa thực vật của loài Camellia cucphuongensis vẫn còn rất hạn chế.

Nhằm đóng góp dữ liệu khoa học về thành phần hóa học của loài thực vật này, đề tài "Chiết xuất, phân lập một số hợp chất trong lá trà hoa vàng Cúc Phương (Camellia cucphuongensis)" do sinh viên Trần Thị Thơm thực hiện tại Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội (khóa QHY.2014) dưới sự hướng dẫn của TS. Vũ Đức Lợi và PGS. Đỗ Thị Hà (Viện Dược liệu) đã tập trung giải quyết 3 mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

1. Định tính một số nhóm chất hữu cơ trong lá Trà hoa vàng Cúc Phương.
2. Chiết tách, phân lập 1–2 hợp chất từ lá Trà hoa vàng Cúc Phương.
3. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được.

Về đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Mẫu lá của cây Trà hoa vàng Cúc Phương (Camellia cucphuongensis Ninh & Rosmann).
• Phạm vi không gian và thời gian thu mẫu: Mẫu dược liệu được thu hái tại Vườn Quốc gia Cúc Phương, huyện Nho Quan, tỉnh Ninh Bình vào ngày 26/02/2018. Mẫu thực vật đã được giám định khoa học bởi ThS. Nguyễn Anh Đức (Tổ giám định mẫu, Bảo tàng Thực vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN) và lưu trữ tại Bảo tàng Thực vật với số hiệu mẫu HNU 024061.
• Địa điểm thực nghiệm: Nghiên cứu được triển khai tại Bộ môn Dược liệu – Dược học cổ truyền (Khoa Y Dược – ĐHQGHN), Khoa Hóa Thực vật – Viện Dược liệu và Viện Hóa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết và hệ thống phân loại

Nghiên cứu dựa trên hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan (2009), xác định vị trí của cây Trà hoa vàng Cúc Phương:

• Giới: Thực vật (Plantae)
• Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta)
• Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida)
• Phân lớp: Sổ (Dilleniidae)
• Bộ: Trà (Theales)
• Họ: Trà (Theaceae)
• Chi: Trà (Camellia)
• Loài: Camellia cucphuongensis Ninh & Rosmann

Cơ sở lý thuyết của khóa luận tổng hợp các công trình nghiên cứu về thành phần hóa học điển hình của chi Camellia L. bao gồm: các polyphenol (alcaloid purin, acid phenolic, các dẫn xuất catechin như EGCG, ECG, EGC, EC và flavonol), saponin triterpenoid khung oleanane, polysaccarit trà (TPS), sterol, acid béo, tinh dầu và acid amin tự do (đặc biệt là theanin và GABA).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Khóa luận sử dụng các phương pháp thực nghiệm tiêu chuẩn trong nghiên cứu Hóa thực vật:

• Phương pháp định tính hóa học: Sử dụng các phản ứng hóa học màu và tạo kết tủa đặc trưng trên các phân đoạn dịch chiết khác nhau (dịch chiết ether dầu hỏa, cồn và nước) để xác định sự có mặt hoặc vắng mặt của các nhóm hợp chất tự nhiên chính (caroten, sterol, chất béo, flavonoid, saponin, coumarin, acid amin, glycosid tim, acid hữu cơ, đường khử, tanin, alcaloid, anthranoid).
• Phương pháp chiết xuất:
  • Chiết ngâm phân đoạn mẫu lá khô nghiền nhỏ với dung môi cồn ethanol 96% ở nhiệt độ phòng (tỷ lệ dung môi/dược liệu 5:1 l/kg, ngâm chiết 3 lần, mỗi lần 48 giờ).
  • Thu hồi dung môi dưới áp suất giảm bằng máy cô quay chân không để thu cao cồn toàn phần.
  • Phân tán cao toàn phần trong nước nóng và chiết phân bố lỏng - lỏng lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, dichloromethan (DCM), ethyl acetat (EtOAc) và n-butanol (n-BuOH).
• Phương pháp sắc ký phân tách và tinh chế:
  • Sắc ký lớp mỏng (SKLM) trên bản mỏng tráng sẵn silica gel DC-Alufolien 60 F254 và pha đảo RP-18 F254 (Merck) để kiểm tra các phân đoạn và phát hiện vết bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm.
  • Sắc ký cột pha thường (CC) sử dụng pha tĩnh silica gel với cỡ hạt 0,063–0,200 mm và 0,040–0,063 mm.
  • Sắc ký rây phân tử sử pha tĩnh Sephadex LH-20 (Amersham Bioscience).
• Phương pháp xác định cấu trúc hóa học:
  • Đo điểm nóng chảy ($t^o_{nc}$) bằng máy đo điểm nóng chảy chuyên dụng.
  • Đo phổ khối ion hóa phun mù điện tử (ESI-MS) xác định khối lượng phân tử.
  • Đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D ($^1\text{H-NMR}$ ở tần số 500 MHz, $^{13}\text{C-NMR}$ ở tần số 125 MHz và phổ DEPT) trên máy Bruker Avance 500MHz.
  • So sánh và đối chiếu dữ liệu dịch chuyển hóa học ($\delta$), độ bội và hằng số tương tác ghép cặp ($J$) với các tài liệu chuẩn quốc tế đã công bố.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 tổng thuật các tư liệu khoa học trong nước và quốc tế liên quan đến đối tượng nghiên cứu:

• Thực vật học: Trình bày đặc điểm phân loại, hình thái thân, lá, hoa, quả của chi Camellia L. và loài Camellia cucphuongensis. Thống kê danh mục phân bố địa lý của 42 loài Trà hoa vàng tại Việt Nam (Bảng 1.1 trong khóa luận).
• Thành phần hóa học: Trình bày chi tiết các nhóm hoạt chất sinh học đã được phân lập từ các loài trong chi Trà và Trà hoa vàng, bao gồm nhóm polyphenol (17 loại flavonol, 8 dẫn xuất catechin tiêu biểu), 188 hợp chất saponin triterpenoid pentacyclic dạng oleanane, các polysaccarit trung tính (NTPS) và acid (ATPS), các sterol trong dầu hạt (canophyllol, spinasterol, $\beta$-sitosterol), các cấu tử tinh dầu chính (linalool, phytol, eudesmol) và các acid amin tự do (theanin, GABA, arginine, glutamic acid).
• Hoạt tính sinh học và ứng dụng: Tổng hợp các nghiên cứu dược lý về khả năng chống oxy hóa (bắt gốc tự do DPPH, ABTS, bảo vệ màng hồng cầu trước sự phân hủy do AAPH), hoạt tính ức chế tế bào ung thư (ức chế dòng tế bào ung thư vú MDA-MB231, ức chế enzyme tổng hợp acid béo FASN, phòng ngừa ung thư gan do NDEA trên chuột), tác dụng kháng khuẩn (trên Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli), tác dụng hạ lipid máu, giảm mỡ nội tạng của EGCG và các bài thuốc y học cổ truyền chữa kiết lỵ, chốc lở, tăng huyết áp.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn nguyên liệu, trang thiết bị, hóa chất và các quy trình thực nghiệm:

• Tiêu chuẩn hóa mẫu thực vật thu hái ngày 26/02/2018 tại Cúc Phương, Ninh Bình (mã số HNU 024061).
• Danh mục hóa chất thử nghiệm đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích (dung môi chiết xuất: EtOH, Hx, DCM, EtOAc, MeOH, n-BuOH; các thuốc thử định tính: Mayer, Dragendorff, Bouchardat, diazo, $\text{FeCl}_3$, gelatin, chì acetat, Legal, ninhydrin).
• Sơ đồ hóa quy trình ngâm chiết cao toàn phần, phân bố lỏng - lỏng thu các cao phân đoạn và quy trình sắc ký cột phân lập chất tinh khiết.

Chương 3: Thực nghiệm, kết quả và bàn luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được:

• Kết quả định tính các nhóm chất: Thử nghiệm phản ứng hóa học trên 13 nhóm chất hữu cơ trong các dịch chiết phân lập từ lá Trà hoa vàng Cúc Phương.

STT	Nhóm chất thử nghiệm	Phản ứng / Thuốc thử sử dụng	Kết quả quan sát	Kết luận
1	Chất béo	Thử vết mờ trên giấy lọc	Âm tính (-)	Không có
2	Caroten	Tác dụng với $\text{H}_2\text{SO}_4$ đặc	Dương tính (+) (màu xanh ve)	Có
3	Sterol	Phản ứng Liebermann – Burchardt	Dương tính (+) (màu bền)	Có
4	Flavonoid	Phản ứng kiềm, Cyanidin, $\text{FeCl}_3$ 5%, Diazo	Dương tính (+) (đỏ tím, xanh sẫm, đỏ gạch)	Có
5	Saponin	Hiện tượng tạo bọt bền, phản ứng Salkowski	Dương tính (+) (vòng đỏ tím)	Có
6	Coumarin	Mở và đóng vòng lacton	Âm tính (-)	Không có
7	Acid amin	Phản ứng với Ninhydrin 0,5%	Dương tính (+) (chuyển màu tím)	Có
8	Glycosid tim	Phản ứng Keller–Kiliani, Baljet, Legal	Âm tính (-)	Không có
9	Acid hữu cơ	Phản ứng sủi bọt với tinh thể $\text{Na}_2\text{CO}_3$	Dương tính (+)	Có
10	Đường khử	Phản ứng khử với thuốc thử Fehling B	Dương tính (+) (kết tủa)	Có
11	Tanin	Phản ứng tủa với $\text{FeCl}_3$ 5%, chì acetat 10%, gelatin 1%	Dương tính (+)	Có
12	Alcaloid	Thuốc thử Mayer, Bouchardat, Dragendorff	Âm tính (-)	Không có
13	Anthranoid	Phản ứng Borntraeger	Âm tính (-)	Không có

• Kết quả chiết xuất cao: Từ 4 kg lá Trà hoa vàng Cúc Phương sấy khô (độ ẩm 12,4%), chiết ngấm lạnh thu được 409 g cao ethanol toàn phần (hiệu suất đạt hơn 10% tính trên dược liệu khô). Từ 380 g cao toàn phần đem chiết phân bố lỏng - lỏng thu được:

  • Phân đoạn n-hexan (CCH): 100,01 g
  • Phân đoạn dichloromethan (CCD): 38,63 g
  • Phân đoạn ethyl acetat (CCE): 60,15 g
  • Phân đoạn n-butanol (CCBu): 38,70 g
  • Phân đoạn nước (CCW): 125,0 g

• Kết quả phân lập và xác định cấu trúc hợp chất CC1:

  • Từ 50 g cao phân đoạn ethyl acetat (CCE), qua sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi n-hexan : aceton (tỷ lệ 50:1 đến 1:5, v/v) thu được 10 phân đoạn (CCE1–CCE10).
  • Phân đoạn CCE5 (1,5 g) tiếp tục sắc ký cột với hệ n-hexan : aceton (10:1 đến 1:1, v/v) thu 3 phân đoạn nhỏ; phân đoạn CCE5.3 được tinh chế qua cột Sephadex LH-20 rửa giải bằng hệ methanol : nước (2:1, v/v), thu được 10 mg hợp chất CC1.
  • Đặc điểm lý hóa và phổ: Tinh thể rắn màu vàng, điểm nóng chảy $277\text{--}279^\circ\text{C}$, phổ ESI-MS cho tín hiệu ion phân tử $m/z\ 287\ [\text{M+H}]^+$ (công thức phân tử $\text{C}{15}\text{H}{10}\text{O}_6$). Phổ $^1\text{H-NMR}$ và $^{13}\text{C-NMR}$ xác định CC1 là kaempferol.

Vị trí Carbon	$^{13}\text{C-NMR}$ ($\delta$ ppm, 125 MHz)	$^1\text{H-NMR}$ ($\delta$ ppm, $J$ Hz, 500 MHz)
2	148,1	-
3	137,1	-
4	177,4	-
5	160,5	-
6	99,3	6,20 (1H, d, $J = 2,0\text{ Hz}$)
7	162,5	-
8	94,5	6,40 (1H, d, $J = 2,0\text{ Hz}$)
9	158,2	-
10	104,6	-
$1'$	123,7	-
$2', 6'$	130,7	8,09 (2H, d, $J = 8,5\text{ Hz}$)
$3', 5'$	116,3	6,92 (2H, d, $J = 8,5\text{ Hz}$)
$4'$	165,6	-

• Kết quả phân lập và xác định cấu trúc hợp chất CC5:
  • Từ 38,63 g cao phân đoạn dichloromethan (CCD), qua sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi dichloromethan : methanol (100:0 đến 1:2, v/v) thu được 13 phân đoạn (CCD1–CCD13).
  • Phân đoạn CCD3 (0,75 g) được sắc ký cột với hệ n-hexan : ethyl acetat (8:2, v/v) thu 3 phân đoạn nhỏ; phân đoạn CCD3B (0,46 g) được tinh chế lại bằng sắc ký lớp mỏng điều chế với hệ dichloromethan : methanol (8:2, v/v), thu được 17,0 mg hợp chất CC5.
  • Đặc điểm lý hóa và phổ: Dạng bột màu trắng, tan trong DCM và MeOH. Phổ $^1\text{H-NMR}$ cho tín hiệu nhóm aldehyd $\delta_\text{H}\ 9,829\text{ ppm}$ (1H, s), nhóm methoxy $\delta_\text{H}\ 3,970\text{ ppm}$ (3H, s), hệ 3 proton thơm ABX tại $\delta_\text{H}\ 7,051\text{ ppm}$ (1H, d, $J = 3,5\text{ Hz}$, H-6), $7,423\text{ ppm}$ (1H, dd, H-5), $7,265\text{ ppm}$ (1H, s, H-7). Phổ $^{13}\text{C-NMR}$ cho 8 tín hiệu carbon tương ứng khung vanillin (4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde).

Vị trí Carbon	$^{13}\text{C-NMR}$ ($\delta$ ppm, 125 MHz)	$^1\text{H-NMR}$ ($\delta$ ppm, $J$ Hz, 500 MHz)
1 (-CHO)	190,89	9,829 (1H, s)
2 (C-O)	151,73	-
3 (C-O)	147,20	-
4 (C-C)	129,95	-
5 (CH)	127,52	7,423 (1H, dd)
6 (CH)	114,75	7,051 (1H, d, $J = 3,5\text{ Hz}$)
7 (CH)	108,87	7,265 (1H, s)
$8\ (-\text{OCH}_3)$	56,16	3,970 (3H, s)

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính

1. Dữ liệu sàng lọc hóa thực vật sơ bộ: Xác định trong lá Trà hoa vàng Cúc Phương có mặt 8 nhóm chất hữu cơ gồm Caroten, Sterol, Flavonoid, Saponin, Acid amin, Acid hữu cơ, Đường khử tự do và Tanin; không phát hiện sự có mặt của 5 nhóm chất gồm Chất béo, Coumarin, Glycosid tim, Alcaloid và Anthranoid.
2. Quy trình chiết xuất và phân đoạn: Xây dựng quy trình xử lý 4 kg dược liệu khô (độ ẩm 12,4%) thu 409 g cao cồn toàn phần, phân bố thành 5 phân đoạn có độ phân cực khác nhau để phục vụ tinh chế.
3. Phân lập và nhận danh cấu trúc:
   • Phân lập thành công 10,0 mg hợp chất flavonoid kaempferol (CC1) từ phân đoạn ethyl acetat.
   • Phân lập thành công 17,0 mg hợp chất phenolic aldehyd vanillin (CC5) từ phân đoạn dichloromethan.

Đóng góp khoa học tự nêu

• Công trình bổ sung dữ liệu thực nghiệm về thành phần hóa thực vật của loài Camellia cucphuongensis Ninh & Rosmann – một loài thực vật đặc hữu của Vườn Quốc gia Cúc Phương.
• Hợp chất vanillin (CC5) lần đầu tiên được phát hiện và phân lập từ lá của loài Trà hoa vàng Cúc Phương, góp phần giải thích các đặc tính hương vị và giá trị dược lý tiềm năng của loài trà này.
• Cung cấp dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$) và phổ khối (ESI-MS) chuẩn xác, đóng góp cơ sở dữ liệu đối chiếu phục vụ công tác tiêu chuẩn hóa và kiểm nghiệm dược liệu Trà hoa vàng tại Việt Nam.

Kiến nghị của tác giả

• Tiếp tục thực hiện chiết xuất và phân lập các hợp chất tự nhiên khác từ các phân đoạn còn lại của lá Trà hoa vàng Cúc Phương (đặc biệt là phân đoạn n-hexan, n-butanol và phân đoạn nước).
• Triển khai các nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính sinh học trên các hợp chất tinh khiết và cao phân đoạn, bao gồm thử nghiệm khả năng chống oxy hóa, kháng khuẩn, ức chế tế bào ung thư và hỗ trợ điều trị đái tháo đường, tim mạch.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Nghiên cứu mới hoàn thành việc phân lập và xác định cấu trúc của 2 hợp chất đơn lẻ từ 2 phân đoạn chiết (ethyl acetat và dichloromethan); 3 phân đoạn còn lại (n-hexan, n-butanol, nước) chưa được tiến hành tách chiết sâu. Khóa luận dừng lại ở bước hóa thực vật (định tính, chiết tách, giải phổ cấu trúc), chưa thực hiện các thử nghiệm đánh giá hoạt tính sinh học (in vitro hoặc in vivo) trực tiếp trên các hợp chất đã phân lập của loài Camellia cucphuongensis.
• Hướng mở tiếp theo: Khảo sát toàn diện các phân đoạn chiết còn lại để tìm kiếm các hợp chất saponin hoặc polyphenol đặc trưng; tiến hành thử nghiệm hoạt tính dọn gốc tự do, bảo vệ tế bào và đánh giá độc tính tế bào của các cao phân đoạn và hợp chất sạch.

Giá trị tham khảo

• Đối tượng tham khảo: Sinh viên, học viên cao học, nghiên cứu sinh và giảng viên chuyên ngành Dược học, Hóa Dược, Hóa học các hợp chất thiên nhiên và Thực vật học.
• Nội dung có giá trị ứng dụng:
  • Quy trình chiết phân đoạn và các hệ dung môi sắc ký cột phân lập hoạt chất từ lá thực vật chi Camellia.
  • Bộ dữ liệu phổ phân tích cộng hưởng từ hạt nhân và các bước biện luận phổ xác định cấu trúc của khung flavonoid (kaempferol) và dẫn xuất phenolic (vanillin).
  • Bảng tổng hợp vị trí phân bố địa lý của 42 loài Trà hoa vàng tại Việt Nam phục vụ công tác điều tra và bảo tồn nguồn gen dược liệu.

Câu hỏi thường gặp

1. Dược liệu nghiên cứu trong khóa luận được thu hái ở đâu, vào thời gian nào và có mã số lưu mẫu là gì?

Mẫu lá Trà hoa vàng Cúc Phương được thu hái tại Vườn Quốc gia Cúc Phương, huyện Nho Quan, tỉnh Ninh Bình vào ngày 26/02/2018. Mẫu được ThS. Nguyễn Anh Đức giám định tên khoa học là Camellia cucphuongensis Ninh & Rosmann và được lưu trữ tại Bảo tàng Thực vật (Khoa Sinh học, Trường ĐHKHTN – ĐHQGHN) với số hiệu mẫu HNU 024061.

2. Các nhóm chất nào có mặt và không có mặt trong lá Trà hoa vàng Cúc Phương theo kết quả định tính?

• Nhóm chất có mặt (8 nhóm): Caroten, Sterol, Flavonoid, Saponin, Acid amin, Acid hữu cơ, Đường khử và Tanin.
• Nhóm chất không có mặt (5 nhóm): Chất béo, Coumarin, Glycosid tim, Alcaloid và Anthranoid.

3. Quy trình chiết xuất thu được bao nhiêu cao toàn phần và lượng cao ở các phân đoạn là bao nhiêu?

Từ 4 kg dược liệu lá khô (hàm ẩm 12,4%), chiết ngấm lạnh với ethanol 96% thu được 409 g cao toàn phần. Từ 380 g cao cồn đem chiết phân bố lỏng - lỏng thu được:

• Phân đoạn n-hexan: 100,01 g
• Phân đoạn dichloromethan: 38,63 g
• Phân đoạn ethyl acetat: 60,15 g
• Phân đoạn n-butanol: 38,70 g
• Phân đoạn nước: 125,0 g

4. Hai hợp chất được phân lập và xác định cấu trúc trong khóa luận là gì?

• Hợp chất CC1 (phân lập từ phân đoạn ethyl acetat với khối lượng 10 mg): Tinh thể màu vàng, nhiệt độ nóng chảy $277\text{--}279^\circ\text{C}$, được xác định là kaempferol ($\text{C}{15}\text{H}{10}\text{O}_6$, $M = 286\text{ g/mol}$).
• Hợp chất CC5 (phân lập từ phân đoạn dichloromethan với khối lượng 17 mg): Dạng bột màu trắng, được xác định là vanillin (4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde, $\text{C}_8\text{H}_8\text{O}_3$).

5. Phát hiện mới nhất về thành phần hóa học của khóa luận này đối với loài Camellia cucphuongensis là gì?

Hợp chất vanillin (CC5) lần đầu tiên được phân lập và xác định cấu trúc từ loài Camellia cucphuongensis Ninh & Rosmann, trong khi hợp chất kaempferol (CC1) tái khẳng định các phát hiện hóa thực vật trước đó trên loài cây này.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Trần Thị Thơm đã hoàn thành đầy đủ các mục tiêu đề ra về mặt hóa thực vật trên đối tượng lá Trà hoa vàng Cúc Phương (Camellia cucphuongensis Ninh & Rosmann). Nghiên cứu đã xác định sự hiện diện của 8 nhóm chất hữu cơ tự nhiên trong lá, đồng thời chiết xuất và phân lập thành công 2 hợp chất sạch là kaempferol (10 mg) và vanillin (17 mg). Trong đó, vanillin là hợp chất lần đầu tiên được công bố phân lập từ loài thực vật đặc hữu này. Kết quả của công trình cung cấp cơ sở khoa học thực nghiệm quan trọng phục vụ công tác kiểm nghiệm, chuẩn hóa dược liệu và định hướng các nghiên cứu dược lý tiếp theo trên chi Trà hoa vàng tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Về thực vật 1. Vị trí phân loại của chi Camellia L. và loài Camellia cucphuongensis Vị trí của chi Camellia L.

trong hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan (2009) [39] như sau: Giới: Thực vật (Plantae) Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp: Sổ (Dilleniidae) Bộ: Trà (Theales) Họ: Trà ( Theaceae) Chi: Trà (Camellia) Loài Camellia cucphuongensis: Tên khoa học: Camellia cucphuongensis Ninh & Rosmann. Tên Việt Nam: Trà hoa vàng Cúc Phương. Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Camellia L. Cây bụi hoặc cây nhỏ thường xanh, cành nhẵn hay có lông.

Lá thường có cuống; đơn, mọc cách, không có lá kèm, kích thước lá thay đổi, dài từ vài cm đến 45 cm; chất lá thường dạng da, dày mỏng khác nhau, ít khi chất màng mỏng; chóp lá nhọn, có đầu nhọn hoặc kéo dài thành đuôi; gốc lá hình nêm hẹp, nêm rộng, tròn hay hình tim; mép lá có răng cưa nhọn hay tù. Hoa đều, lưỡng tính, kích thước lớn hoặc nhỏ, mọc đơn độc hoặc tập trung 2-5 hoa ở nách lá hoặc đỉnh cành. Hoa màu đỏ, trắng hay màu vàng. Cuống hoa ngắn hoặc gần như không.

Lá bắc 2-10, mọc xoắn trên cuống hoa, tồn tại hoặc sớm rụng. Lá đài thường 5 phiến, tồn tại hoặc sớm rụng. Cánh hoa 4-19, hợp một phần ở gốc cùng với vòng nhị ngoài. Nhị nhiều, những nhị ngoài thường dính nhau thành cái chén hay ống ở phía gốc; vòng nhị phía trong rời nhau; chỉ nhị dài.

Bầu trên, 1-5 ô; vòi nhụy 1-5, dạng sợi, rời hoặc dính nhau ở mức độ khác nhau, bầu và vòi nhụy nhẵn hay phủ lông mịn. Quả nang hình cầu, hình cầu dẹt hoặc hình trứng, khi khô chẻ ô từ trên xuống thành 3, 4 hay 5 mảnh; có trụ quả hay không; vỏ quả dày hay mỏng, hoá gỗ. Hạt thường 1 đến nhiều 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] hạt trong mỗi ô, hình cầu, nửa cầu hay hình nêm; vỏ hạt màu nâu, nâu hạt giẻ nhạt hoặc nâu hồng, phủ lông hay nhẵn [3]. Có khoảng 280 loài, phân bố chủ yếu ở Nhiệt đới và Á nhiệt đới như Ấn Độ, Trung Quốc, Vệt Nam, Thổ Nhĩ Kì, Brazil, Australia,.Ở Việt Nam đã bắt gặp 58 loài Camellia [3], trong đó có hơn 40 loài có hoa màu vàng, tập trung ở khu vực phía Bắc (Thái Nguyên, Vĩnh Phúc, Quảng Ninh,…) và phía Nam ở một số tỉnh như Lâm Đồng, Đồng Nai,…( xem bảng 1.

Đặc điểm thực vật và phân bố của loài Camellia cucphuongensis Cây gỗ nhỏ, cao 3 - 6 m. Cành già màu nâu đậm, sần sùi. Lá có cuống ngắn, dài 2,5 mm, có lông. Lá thuôn dài hoặc hình elip, dài 6-12 cm, rộng 2,7 – 4,5 cm, mỏng, gốc lá tròn nhẵn.

Hoa màu vàng, mọc ở đầu cành, đường kính khi nở 4,5 – 5 cm; cuống hoa nhẵn, dài 5 – 7 mm; lá bắc 5 – 6 lá, hình trứng, dài 2 – 5 mm; lá đài 8 – 9 lá, dài 0,4 – 1 cm, có lông. Có 13 – 15 cánh hoa, hình trứng, dài 1,8 – 2,3 cm, rộng 1,5 cm, đầu tròn, mặt dưới có lông. Nhị hoa dài 0,8 – 2,4 cm, chỉ nhị rời, có lông. Noãn có 5 ô, có 5 vòi nhụy, rời, dài khoảng 1,3 cm.

Quả hình cầu, dài 3,9 cm, đường kính 3,8 cm, màu đen gỗ khi khô, quả có 5 ô với 6 – 8 hạt trong mỗi ô, hạt hình nêm dài 1,2 – 1,4 cm [29]. Mùa hoa kéo dài từ tháng 10 năm trước đến tháng 2 năm sau [2]. Loài này ưa ẩm mọc trong các thung lũng của rừng nhiệt đới ở độ cao 300- 400 m (khu vực gần hồ Mạc thuộc Vườn Quốc gia Cúc Phương) [2].