Nghiên cứu chiết xuất và định lượng Cordycepin, Adenosin từ nấm Cordyceps Militaris

Khóa luận dược sĩ khảo sát các phương pháp chiết xuất và định lượng Cordycepin Adenosin từ nấm Cordyceps militaris được nuôi cấy in-vitro.

• Tác giả: Đỗ Bá Việt Long
• Người hướng dẫn: TS. Hoàng Quỳnh Hoa
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược học
• Đề tài: Khảo sát các phương pháp chiết xuất và định lượng cordycepin và adenosin từ nấm Cordyceps militaris được nuôi cấy in-vitro
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2025
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Nấm Cordyceps Militaris và Thành Phần Hoạt Chất

Nấm Cordyceps militaris là một loại nấm quý hiếm được biết đến với giá trị y học cao, đặc biệt là khả năng sản sinh các hợp chất có hoạt tính sinh học mạnh. Nấm này được nuôi cấy in-vitro, cho phép tối ưu hóa sản xuất các chất hoạt động như cordycepin và adenosin. Các hợp chất này có ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực dược học, từ tăng cường miễn dịch đến hỗ trợ điều trị các bệnh mãn tính. Nghiên cứu tại Trường Đại học Dược Hà Nội đã khẳng định vai trò quan trọng của nấm này trong công nghệ dược phẩm hiện đại. Hiểu rõ thành phần hóa học của Cordyceps militaris là bước đầu tiên để phát triển các phương pháp chiết xuất hiệu quả.

1.1. Đặc Điểm Sinh Học và Phân Loài

Cordyceps militaris là một loài nấm có giá trị kinh tế lớn, phân bố chủ yếu ở khu vực Đông Á. Nấm này có khả năng thích ứng tốt với điều kiện sinh thái đa dạng và có thể được nuôi cấy in-vitro để tăng năng suất. Các đặc điểm hình thái của nấm bao gồm thân quả dài, mảnh và màu sắc vàng nâu đặc trưng. Việc nuôi cấy nhân tạo giúp kiểm soát chất lượng và tăng hàm lượng các hợp chất hoạt động.

1.2. Thành Phần Hóa Học Chính

Nấm Cordyceps militaris chứa nhiều hợp chất quý giá, trong đó cordycepin và adenosin là hai thành phần chính có hoạt tính sinh học mạnh. Cordycepin là một deoxyadenosine analog có tác dụng chống oxy hóa, chống viêm và hỗ trợ tăng năng lượng tế bào. Adenosin có vai trò điều hòa miễn dịch và bảo vệ tế bào. Bên cạnh đó, nấm còn chứa các polysaccharide, amino acid và các vi lượng yếu tố khác.

II. Phương Pháp Chiết Xuất Cordycepin và Adenosin

Chiết xuất cordycepin và adenosin từ nấm Cordyceps militaris là một quy trình phức tạp đòi hỏi sự tối ưu hóa nhiều yếu tố. Các phương pháp chiết xuất khác nhau sẽ cho kết quả sản lượng và chất lượng hoạt chất khác nhau. Nghiên cứu tại Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội đã so sánh hiệu quả của các phương pháp chiết xuất truyền thống và hiện đại. Việc lựa chọn dung môi chiết xuất, thời gian, nhiệt độ và tỉ lệ rắn lỏng đóng vai trò quan trọng trong việc cải thiện hiệu suất chiết xuất. Sử dụng phương pháp thay đổi một yếu tố (OFAT) và phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) giúp xác định điều kiện tối ưu.

2.1. Phương Pháp Chiết Xuất Truyền Thống

Phương pháp chiết xuất truyền thống sử dụng dung môi như nước, ethanol hoặc methanol để chiết xuất cordycepin và adenosin. Các yếu tố như thời gian chiết xuất, nhiệt độ và loại dung môi có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất. Chiết xuất nước đơn giản nhưng hiệu suất thấp, trong khi chiết xuất ethanol cho hiệu suất cao hơn. Phương pháp này được sử dụng rộng rãi vì chi phí thấp và an toàn cho môi trường.

2.2. Tối Ưu Hóa Yếu Tố Chiết Xuất

Phương pháp OFAT (thay đổi một yếu tố) giúp xác định ảnh hưởng riêng lẻ của từng yếu tố đến quá trình chiết xuất adenosin và cordycepin. Phương pháp RSM (phản ứng bề mặt) cho phép tối ưu hóa đồng thời nhiều yếu tố, tiết kiệm thời gian và chi phí. Các yếu tố chính bao gồm pH dung dịch, nhiệt độ chiết xuất (40-80°C), thời gian (0,5-4 giờ) và tỉ lệ rắn lỏng.

III. Phương Pháp Định Lượng HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp phân tích chuyên dụng được sử dụng để định lượng đồng thời cordycepin và adenosin trong dịch chiết nấm Cordyceps militaris. Phương pháp này cung cấp độ chính xác cao, độ chuyên biệt tốt và có khả năng phân tách các hợp chất có cấu trúc tương tự. Tại Trường Đại học Dược Hà Nội, các nhà khoa học đã thẩm định phương pháp HPLC để đảm bảo tính tin cậy của kết quả. Pha động sử dụng gradient với nước (kênh A) và methanol (kênh B) cho phép tách riêng hai chất. Phương pháp này được áp dụng trong kiểm nghiệm chất lượng sản phẩm Cordyceps militaris.

3.1. Nguyên Lý và Điều Kiện HPLC

HPLC hoạt động dựa trên nguyên lý phân tách dựa trên độ hấp phụ khác nhau của các hợp chất. Pha tĩnh là cột sắc ký với độ phân giải cao, pha động là gradient nước-methanol. Cordycepin và adenosin được phát hiện bằng đầu dò UV ở bước sóng thích hợp. Thời gian chạy mẫu khoảng 15-20 phút, cho phép xác định chính xác hàm lượng từng hợp chất.

3.2. Thẩm Định Phương Pháp

Thẩm định phương pháp HPLC bao gồm kiểm tra tính phù hợp hệ thống, tuyến tính (R² > 0.99), độ lặp lại (RSD < 5%), độ đúng (recovery 95-105%) và độ ổn định mẫu. Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp có khả năng định lượng cordycepin và adenosin chính xác và tin cậy trong các mẫu chiết xuất từ Cordyceps militaris.

IV. Ứng Dụng và Triển Vọng Nghiên Cứu

Phát triển các phương pháp chiết xuất và định lượng hiệu quả cho cordycepin và adenosin từ nấm Cordyceps militaris mở ra nhiều cơ hội ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm. Các hoạt chất này có tiềm năng trong phát triển thuốc chữa bệnh, thực phẩm bổ sung sức khỏe và mỹ phẩm chức năng. Công nghệ nuôi cấy in-vitro cho phép sản xuất ổn định, độc lập với điều kiện tự nhiên. Nghiên cứu tại Đại học Dược Hà Nội từng bước xây dựng nền tảng cho sản xuất công nghiệp nấm Cordyceps militaris chất lượng cao. Tiêu chuẩn phân tích được thẩm định sẽ hỗ trợ kiểm soát chất lượng sản phẩm và bảo vệ quyền lợi người tiêu dùng.

4.1. Ứng Dụng Trong Y Dược

Cordycepin và adenosin có tính chất chống oxy hóa, chống viêm và tăng cường miễn dịch, được ứng dụng trong điều trị các bệnh mãn tính như ung thư, bệnh tim mạch và tiểu đường. Nấm Cordyceps militaris còn được sử dụng để tăng sức đề kháng, cải thiện năng lượng và tăng cường sức khỏe sinh sản. Các sản phẩm từ nấm này được phát triển thành thuốc, viên nang bổ sung sức khỏe.

4.2. Triển Vọng Phát Triển Công Nghệ

Công nghệ nuôi cấy in-vitro Cordyceps militaris cho phép tăng năng suất, giảm chi phí sản xuất và đảm bảo tính bền vững. Nghiên cứu sâu hơn về tối ưu hóa chiết xuất sẽ nâng cao hiệu suất thu hồi cordycepin và adenosin. Tiêu chuẩn kiểm nghiệm chuẩn hóa sẽ tạo điều kiện cho các nhà sản xuất phát triển sản phẩm chất lượng cao, cạnh tranh trên thị trường quốc tế.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Tổng quan dược liệu 1. Vị trí phân loài, phân bố Theo Sung và các cộng sự năm 2007 [4] , trang web Species Fungorum [5] và sách Thực vật Dược [6], nấm Cordyceps militaris được sắp xếp theo thứ tự phân loại như sau: Giới: Nấm (Fungi) Ngành: Ascomycota Phân ngành: Pezizomycotina Lớp: Sordariomycetes Phân lớp: Hypocreomycetidae Bộ: Hypocreales Họ: Cordycipitaceae Chi: Cordyceps Tên khoa học: Cordyceps militaris (L. Tên đồng nghĩa: Cordyceps militaris (L.; Clavaria squamosa Lam.; Clavaria granulosa Bull.

Tên thường gọi: Nấm Nhộng trùng thảo, Nấm bắc trùng thảo, nấm cam sâu bướm, Dõng trùng thảo,… 1. Điều kiện sinh thái Chi nấm Cordyceps bao gồm khoảng 750 loài đã được xác định và phân bố rộng rãi trên toàn thế giới. Tuy nhiên, chúng chủ yếu được tìm thấy ở Nam Á, châu Âu và Bắc Mỹ [7]. Tại Việt Nam, các mẫu nấm thuộc chi Cordyceps đã được thu thập ở các khu vực rừng nhiệt đới có độ cao từ 800 đến 2000 mét.

Tuy nhiên, các nghiên cứu về sự phân bố tự nhiên của C. militaris tại Việt Nam vẫn còn hạn chế. Tính đến năm 2022, đã có 13 loài thuộc chi Cordyceps được ghi nhận tại Việt Nam [8]. Trong đó, loài Cordyceps militaris đã được phát hiện tại một số địa điểm như Vườn Quốc gia Hoàng Liên (Lào Cai) [9], Khu bảo tồn thiên nhiên Copia [8].

Đặc điểm hình thái Cordyceps militaris được đặc trưng bởi các đặc điểm hình thái sau: Phần thể đệm (stroma) thường có màu vàng, đỏ hoặc cam, với kết cấu chắc chắn do sự đan xen chặt chẽ của các sợi nấm. Thể đệm có chiều cao dao động từ 20 đến 60 mm và đường kính khoảng 3 đến 10 mm. Quả thể (perithecia) có màu tương tự thể đệm, sắp xếp theo trật tự nhất định và có thể nằm nghiêng chìm một phần, chìm hoàn toàn hoặc phân bố rời rạc trên bề mặt thể đệm. Mô bên trong của quả thể có màu trắng đến cam nhạt.

Bào tử có dạng sợi, dài trên 200 µm và phân chia thành nhiều bào tử thứ cấp hình trụ, kích thước khoảng 3,5–6 × 1–1,5 µm, xếp chồng lên nhau tạo thành chuỗi. Vật chủ của loài nấm này thường là ấu trùng hoặc nhộng của các loài thuộc ngành Chân khớp (Arthropoda), được tìm thấy chủ yếu trong lớp lá mục, lớp rêu hoặc tầng đất bề mặt [4], [10]. Thành phần hóa học Vào năm 2024, tại Việt Nam, một nghiên cứu đã tiến hành đánh giá hàm lượng một số hoạt chất trong các chủng C. militaris lai hữu tính, được tạo ra từ sự lai tạo giữa các chủng bố mẹ có nguồn gốc từ Nhật Bản và Hàn Quốc.

Kết quả phân tích cho thấy hàm lượng adenosin dao động trong khoảng 900 đến 1900 µg/g khối lượng nấm khô, trong khi hàm lượng cordycepin nằm trong khoảng từ 50 đến 190 µg/g. Tổng hàm lượng hợp chất phenolic được ghi nhận đạt khoảng 100 µg GAE/mL, flavonoid tổng số vào khoảng 1 µg QE/mL, và hàm lượng glucose trong dịch chiết đạt xấp xỉ 0,2 g/L [11]. Trên thế giới, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện nhằm xác định thành phần hóa học của Cordyceps militaris. Các kết quả cho thấy rằng những hợp chất có vai trò chính trong hoạt tính sinh học của loài nấm này chủ yếu thuộc hai nhóm: nucleoside và polysaccharide [2], [12], [13].

Trong nhóm nucleoside, hai hoạt chất nhận được sự quan tâm lớn từ các nhà nghiên cứu là adenosin và cordycepin [2], [12], [13]. Adenosin là nucleoside chủ yếu được tìm thấy trong các loài thuộc chi Cordyceps. Đây là một nucleoside nội sinh, cấu thành từ một phân tử đường ribose liên kết với một phân tử adenin – một trong bốn nucleotide cơ bản tạo nên cấu trúc của DNA, vật liệu di truyền [2], [12], [13]. Tên gọi IUPAC của adenosin là (2R,3R,4S,5R)-2-(6-amino-9H- purin-9-yl)-5-(hydroxymethyl)oxolane-3,4-diol.

Hoạt chất này có công thức hóa học như sau: 3 Hình 1: Công thức hóa học của Adenosin Cordycepin là một dẫn xuất của adenosin [2], [12], [13]. Tên gọi IUPAC là 3′- Deoxyadenosin. Hoạt chất này có công thức hóa học như sau: Hình 2: Công thức hóa học của Cordycepin Dựa vào công thức hóa học của hai chất, có thể thấy rằng adenosin và cordycepin có cấu trúc tương tự nhau. Adenosin hơn cordycepin một nhóm OH trên vòng ribose.

Điều này có thể ảnh hưởng tới khả năng hòa tan trong dung môi và điều kiện chiết xuất tối ưu. Các nucleoside khác và các chất liên quan của chúng được tìm thấy trong C. militaris: cytidine, cytosine, guanine, guanosine, uracil, uridine, hypoxanthine, inosine, thymine, thymidine, 2`-deoxyuridine, 2`-deoxya-denosine, N6-methyladenosine và 6- hydroxyethyl-adenosine,… [2], [12], [13]. militaris chủ yếu bao gồm các thành phần monosaccharide như glucose (Glc), galactose (Gal) và mannose (Man).

Ngoài ra, trong quá trình phân tích thành phần, còn có thể phân lập được các đường đơn khác như rhamnose, arabinose (Ara), xylose (Xyl), ribose, fucose, acid galacturonic (GalA), acid glucuronic (GlcA) và N-acetyl galactosamine… [2], [12], [13]. Bên cạnh hai nhóm hoạt chất đặc trưng là nucleoside và polysaccharide, C. militaris còn chứa nhiều hợp chất khác có hoạt tính sinh học đáng chú ý. Các thành phần 4 này bao gồm các acid amin (như γ-aminobutyric acid – GABA, ergothioneine), glycolipid (như cerebrosides), glycoprotein (như lectins), D-mannitol (hay còn gọi là cordycepic acid), các xanthophyll như carotenoid (lutein, zeaxanthin), các sterol (như ergosterol), statin (như lovastatin), các hợp chất phenolic (bao gồm acid phenolic và flavonoid), các nguyên tố khoáng (magie, kali, selen, lưu huỳnh) [14], acid béo (acid palmitic, acid linoleic), cùng với một số vitamin như B2, B3, A, C và E [12].

militaris là một loài nấm dược liệu quý, được chứng minh có nhiều tác dụng sinh học có lợi. Các nghiên cứu gần đây đã làm sáng tỏ nhiều cơ chế dược lý tiềm năng của C. militaris, đặc biệt là thông qua các hoạt chất chính như cordycepin, adenosin, polysaccharide, cerebroside và acid cordycepic. - Tác dụng chống viêm C.

militaris thể hiện khả năng chống viêm thông qua nhiều cơ chế: ức chế sản xuất các cytokine tiền viêm như TNF-α, IL-1β, IL-6 [15], [16], [1], [17]; điều hòa con đường tín hiệu NF-κB và MAPK [1], [16], [17], [18]; ức chế các enzyme gây viêm như iNOS và COX-2 [1], [16], [17]. militaris còn điều hòa phản ứng miễn dịch của microglia trong hệ thần kinh trung ương, góp phần giảm viêm thần kinh [15], [16]. Vai trò của polysaccharides và cerebrosides cũng được ghi nhận trong việc ức chế các phản ứng viêm [1], [16]. - Tác dụng chống oxy hóa và chống lão hóa C.

militaris có khả năng trung hòa các gốc tự do ROS [2], [16], [19], tăng cường hoạt động của các enzym chống oxy hóa nội sinh như SOD, CAT và GPx, đồng thời làm giảm quá trình peroxy hóa lipid – một nguyên nhân chính gây tổn thương tế bào [2], [16]. Các polysaccharides và cordycepin đóng vai trò quan trọng trong hoạt tính chống oxy hóa này. militaris góp phần làm chậm quá trình lão hóa tế bào và bảo vệ cơ thể khỏi các tổn thương do stress oxy hóa, đặc biệt có ý nghĩa trong chăm sóc da và các bệnh thoái hóa thần kinh [2], [16], [19]. - Tác dụng hỗ trợ ức chế khối u Cordycepin đã được chứng minh gây chết tế bào theo chương trình (apoptosis), gây ngừng chu kỳ tế bào ung thư, ức chế di căn và tăng sinh mạch máu ở nhiều dòng tế bào ung thư [18].

militaris còn điều hòa vi môi trường khối u, tăng cường miễn dịch chống lại tế bào ung thư, và ức chế các yếu tố miễn dịch giúp khối u né tránh như CD47. Các polysaccharides của nấm này cũng góp phần chuyển đổi đại thực bào kiểu M2 sang M1, tăng hiệu quả tiêu diệt khối u [18]. 5 - Tác dụng điều hòa miễn dịch C. militaris có thể điều hòa miễn dịch thông qua việc kích hoạt đại thực bào, điều hòa hoạt động tế bào lympho T và B, sản xuất Cytokine [1], [16], [20].

Các chiết xuất với nồng độ ethanol khác nhau của nấm có thể thúc đẩy miễn dịch type 1 (tăng cường ức chế khối u, virus) hoặc miễn dịch type 2 (giảm viêm, điều hòa miễn dịch) [16]. - Tác dụng hạ đường huyết C. militaris giúp cải thiện độ nhạy của tế bào với insulin, tăng biểu hiện của các protein quan trọng như IRS-1, AKT và GLUT-4, từ đó giúp glucose được vận chuyển vào trong tế bào hiệu quả hơn, làm giảm nồng độ glucose trong máu [21]. - Tác dụng bảo vệ gan và thận C.

militaris có khả năng bảo vệ tế bào gan khỏi stress oxy hóa, viêm và tổn thương do mỡ hóa, đặc biệt trong các mô hình bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu (NAFLD, NASH). Tác dụng này liên quan đến việc ức chế apoptosis, giảm ER stress và cải thiện chức năng ty thể [22]. militaris cũng giúp bảo vệ thận khỏi tổn thương trong bệnh thận mạn và biến chứng thận do tiểu đường thông qua điều hòa con đường tín hiệu phân tử quan trọng như TLR4/NF-κB [23], TGF-β1/Smad và microRN [3]. - Tác dụng điều hòa chuyển hóa lipid C.

militaris làm giảm đáng kể nồng độ cholesterol toàn phần, LDL-C và triglycerid, đồng thời làm tăng HDL-C [24]. Cơ chế tác động đa chiều từ gan, ruột đến mô mỡ thông qua điều hòa các con đường tín hiệu như PPARγ, LXRα, SREBP-1c [24]. Điều này giúp bảo vệ cơ thể khỏi xơ vữa động mạch cũng như các bệnh tim mạch khác. Tổng quan về chiết xuất các phương pháp chiết xuất adenosin và cordycepin trong dược liệu Phạm Thị Chuyên và cộng sự (2023) đã thực hiện quy trình chiết như sau: Vụn hỗn hợp Đông trùng hạ thảo được nghiền thành bột, rây mịn, đo hàm ẩm, sử dụng dung môi chiết xuất là MeOH và phương pháp chiết siêu âm để thu được dịch chiết.

Các khảo sát cho kết quả thời gian chiết phù hợp là 30 phút, chiết 3 lần (10 phút/ lần) với thể tích MeOH thêm mỗi lần là 4/3/3 mL; tỉ lệ khối lượng mẫu/dung môi phù hợp là 0,4 g/10 mL, nhiệt độ chiết phù hợp 60℃ [25]. Theo nghiên cứu của Vũ Kim Dung và cộng sự (2024), điều kiện tối ưu cho quá trình chiết xuất mẫu bột Cordyceps militaris là: Tỷ lệ nguyên liệu:dung môi = 1:40 (g/mL), nồng độ methanol 17,5% và thời gian siêu âm 70 phút, nhiệt độ 25°C. Nghiên cứu cũng chỉ ra hàm lượng adenosine và cordycepin tăng dần theo loại môi trường tương 6 ứng: nước (50% so với ethanol)< nước nóng (80% so với methanol)< ethanol < methanol [26]. Trần Văn Thanh và cộng sự (2022) đã thực hiện quy trình chiết như sau: Nghiền nhỏ mẫu nấm Cordyceps militaris, cân chính xác 1g cho vào các ống ly tâm 50 mL.

Lần lượt cho dung môi gồm: 30°; 60° và 90°C. Chiết xuất bằng cách rung siêu âm trong 30 phút. Đem ly tâm rồi chuyển dịch chiết vào bình định mức 100 mL. Chiết 3 lần cho kiệt hoạt chất, định mức bằng dung môi chiết vừa đủ 100 mL, lọc dịch chiết qua giấy lọc.