Mở đầu Theo tổ chức y tế thế giới (WHO), có khoảng 221 triệu người đang mắc tiểu đường vào năm 2010. Dự đoán tiểu đường sẽ trở thành nguyên nhân đứng thứ 7 trong các nguyên nhân dẫn tới cái chết cho tới năm 2030 khi đạt mức 330 triệu người. Ở nước ta, tỉ lệ bệnh nhân mắc tiểu đường là 5,4%, đối với các thành phố lớn có tỉ lệ này lên tới 7% [37]. Các biến chứng do tiểu đường như bệnh tim mạch vành, tai biến mạch máu não, mù lòa, suy thận hay hoại thư là nguyên nhân dẫn đến cái chết hoặc tai biến cho bệnh nhân của tiểu đường.
Việc chẩn đoán và chữa trị tiểu đường đều yêu cầu sự định lượng chính xác và thường xuyên nồng độ glucose trong máu người bệnh nhằm cung cấp một lượng insulin phù hợp vào cơ thể, tránh tình trạng nguy hiểm do thừa insulin đưa vào dẫn tới lượng đường trong máu quá thấp. Do đó, một số lượng lớn các nghiên cứu trong khoảng một thập kỉ trở lại đây nhằm phát triển, chế tạo được một thiết bị đảm bảo đo chính xác, dễ sử dụng và đáng tin cậy trong việc định lượng glucose trong cơ thể [23]. Từ loại cảm biến glucose đầu tiên dựa trên cấu trúc enzyme được công bố năm 1962 của Clark có độ chọn lọc và độ nhạy tốt, nhưng nhược điểm là dễ bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ, nồng độ oxy hòa tan và các chất hòa tan trong máu. Vì vậy việc phát triển cảm biến glucose không sử dụng enzyme là một hướng nghiên cứu hấp dẫn và nhiều tiềm năng.
Các cấu trúc nano của kim loại quý như Pt, Pd và Au hoặc hợp kim của chúng thể hiện khả năng xác định glucose trong máu với độ nhạy cao, bền bỉ theo thời gian. Tuy nhiên loại điện cực dựa trên hệ kim loại này có nhược điểm là giá thành cao, và dễ bị mất hoạt tính do sự hấp phụ của ion Cl- trong máu và huyết thanh. Vì vậy việc chuyển hướng sang sử dụng các kim loại chuyển tiếp có giá thành rẻ và hoạt tính xúc tác tốt như Cu, Co, Ni và các oxit của chúng trong xác định glucose là một hướng nghiên cứu tiềm năng. Trong luận văn thạc sỹ này chúng tôi đề xuất “Chế tạo vật liệu lỗ xốp đa tầng kim loại và ứng dụng trong cảm biến glucose” trên nền than chì.
Vật liệu xốp đồng và oxit của nó được chế tạo bằng phương pháp điện hóa và kết hợp xử lý nhiệt với mục tiêu chế tạo điện cực giá thành rẻ, nhỏ gọn và có hoạt tính xúc tác cao với glucose, ít bị ảnh hưởng bởi các chất gây nhiễu, khoảng hoạt động rộng và bền bỉ. 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chƣơng 1. Tổng quan về cảm biến glucose Cảm biến glucose đóng một vai trò cốt lõi trong các thiết bị chuẩn đoán và phát hiện bệnh nhân tiểu đường, đồng thời theo dõi hàm lượng đường trong máu của các bệnh nhân tiểu đường hằng ngày. Hầu hết các phương pháp truyền thống để định lượng đường trong máu là phương pháp điện hóa hoặc phương pháp quang phổ.
Điển hình như thiết bị glucometer cầm tay phổ biến đang được sử dụng hiện nay dựa trên việc chích máu ở đầu ngón tay bệnh nhân, sau đó mẫu máu này được xác định hàm lượng đường bằng cách áp dụng phương pháp điện hóa, dưới xúc tác của enzyme glucose oxidase (GOx) hoặc glucose dehydroase (GDH). Glucose phản ứng với oxi tự do tạo thành sản phẩm, đồng thời thay đổi các tính chất điện hóa của dung dịch mẫu thử tiếp xúc với điện, sự thay đổi này tương ứng với hàm lượng glucose trong máu và được hiển thị trên màn hình thiết bị. Mặc dù cách kiểm tra này cho kết quả chính xác, tuy nhiên phương pháp chích ngón tay lấy mẫu máu này khiến bệnh nhân không hài lòng do tạo thành một lỗ nhỏ chảy máu trên đầu ngón tay, gây ra một sự bất tiện trong việc điều trị bệnh do phải thực hiện thường xuyên [23]. Trong những thập kỉ gần đây, các nhóm nghiên cứu trên toàn thế giới đã phát triển không ngừng theo nhiều hướng khác nhau.
Họ tập trung vào phát triển các kĩ thuật hiệu quả bao gồm kiểm tra xâm lấn và không xâm lấn hàm lượng đường trong cơ thể dựa trên cảm biến có cấu trúc enzyme và không có cấu trúc enzyme. Những nỗ lực để làm tạo ra được kĩ thuật làm hài lòng bệnh nhân, thay thế phương pháp chích lấy máu mà vẫn đem lại độ chính xác và tin cậy cao như kiểm tra hàm lượng glucose trong nước mắt, mồ hôi [23] hoặc nồng độ acetone có trong hơi thở như một dấu hiệu nhận biết bệnh tiểu đường, hướng tới chế tạo một thế hệ cảm biến glucose dễ sử dụng, cho kết quả nhanh, giá rẻ, di động và không gây đau đớn. Bên cạnh đó, nồng độ glucose cũng là một thang đo rất quan trọng trong các ngành công nghiệp, nông nghiệp, và môi trường [45, 53]. Các hướng nghiên cứu về cảm biến glucose đã phát triển từ năm 1962, khi lần đầu tiên hai nhà hóa học là Clark và Lyons công bố ý tưởng đầu tiên về điện cực enzyme glucose.
Cho đến nay, các cảm biến glucose có thể chia thành 4 thế chính [40, 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Thế hệ đầu tiên là cảm biến sử dụng enzyme xúc tác cho phản ứng oxi hóa glucose bằng oxygen hòa tan trong máu, thế hệ thứ hai sử dụng các chất trung gian nhân tạo thay thế oxygen hòa tan và nâng cao hiệu suất vận chuyển electron đến điện cực. Sang đến thế hệ cảm biến thứ ba, các enzyme GOx được cố định trên những vật liệu nền có cấu trúc nano hoặc micro nhằm tăng tốc độ vận chuyển electron. Ba thế hệ cảm biến đầu tiên này đều dựa vào các enzyme xúc tác cho quá trình oxi hóa glucose.
Tuy nhiên việc sử dụng enzyme tồn tại những hạn chế về môi trường phản ứng: nhiệt độ, pH hay sự nhiễu của các ion hòa tan trong máu ảnh hưởng tới độ chính xác của kết quả đo. Các cảm biến này đòi hỏi bảo quản ở nhiệt độ và độ ẩm thấp để tránh làm giảm hoạt tính sinh học của các enzyme trong thời gian chưa sử dụng tới. Nhằm khắc phục các hạn chế đó, các hướng nghiên cứu mới hiện nay cố gắng tìm ra các vật liệu xúc tác không sử dụng enzyme. Thế hệ cảm biến glucose mới này được coi là thế hệ thứ 4 trong chỗi phát triển các loại cảm biến đo đường huyết.
Trong thế hệ cảm biến này thì glucose được oxi hóa trực tiếp trên bề mặt điện cực và tạo ra sự thay đổi tín hiệu điện có thể đo được. Số lượng các nghiên cứu được công bố về thế hệ cảm biến này tăng lên đáng kể theo từng năm, được thể hiện ở trên hình 1 [38]: Hình 1. Số lượng bài báo về cảm biến glucose không có cấu trúc enzyme 1. Thế hệ cảm biến glucose thứ nhất Với lịch sử hơn 50 năm phát triển, xuất phát từ ý tưởng về điện cực enzyme glucose được xuất bản năm 1962 bởi hai nhà hóa học Clark và Lyons từ bệnh viện Children Cincinnati [12].
Thiết bị đầu tiên xác định nồng độ glucose trong máu dựa 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com trên lớp mỏng GOx được kẹp xung quanh điện cực oxi, xúc tác quá trình tiêu thụ oxy, oxi hóa glucose thành gluconic acid [53]: Glucose + O 2 GOx Gluconic Acid + H 2 O 2 (1) Sau đó, sự thay đổi thế âm điện do sự tiêu thụ O2 được ghi lại và chuyển đổi thành nồng độ glucose thông qua phản ứng (2): O2 4 H 4e 2 H 2O (2) Phương pháp này cho kết quả đo chính xác và tin cậy cao với lượng máu cần thiết cho việc xác định nồng độ glucose là cỡ 100 µL. Các nghiên cứu tiếp sau đó nhằm thu nhỏ kích thước thiết bị bằng cách thay đổi thiết kế điện cực, vật liệu, màng tiếp xúc hoặc cố định hướng tiếp cận mẫu đã được mô tả và công bố trong suốt những năm 80 của thế kỉ trước. Điều nà góp phần giúp cảm biến sinh học trở thành một chủ đề hấp dẫn, phản ánh sự phát triển của công nghệ sinh học trong giai đoạn này. Thế hệ cảm biến glucose sinh học thương mại đầu tiên dựa vào enzyme glucose oxidase (GOx), xúc tác phản ứng tiêu thụ glucose và đo tín hiệu xuất hiện của hydro peroxide trên điện cực.
Nồng độ hydro peroxide được xác định một cách tương đối đơn giản bằng so sánh thay đổi hiệu điện thế với điện cực so sánh, giúp cho thiết kế thiết bị 3 điện cực có kích thước nhỏ. Một bộ cảm biến rất phổ biến của thế hệ này là bộ cảm biến của hãng YSI, bao gồm một lớp GOx được đặt giữa một lớp màng polycarbonate và một màng cellulose acetate. Sơ đồ cảm biến thể hiện ở hình 2 [45]: Hình 2. Sơ đồ cấu tạo cảm biến glucose thế hệ một 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Kĩ thuật và bằng sáng chế của Clark sau đó được chuyển giao cho Công ty Yellow Spring Instrument để đưa vào ứng dụng như một thiết bị phân tích thương mại từ năm 1975 (Model 23 YSI analyzer).
Thiết bị này có thể để đo nồng độ glucose trong mẫu máu có thể tích 25 μL. Năm 1967, nhóm nghiên cứu của Updike và Hicks tiếp tục nghiên cứu và phát triển lý thuyết của Clark bằng cách sử dụng hai điện cực oxi hoạt động (được phủ một lớp enzyme). Tiến hành đo sự khác nhau về cường độ dòng để loại bỏ đường nền oxi trong mẫu, tăng độ chính xác của phép đo [42]. Năm 1973, nhóm nghiên cứu của Guilbault và Lubrano [18] đã thiết kế điện cực enzyme làm anode để xác định hàm lượng glucose trong máu dựa vào phản ứng phân hủy H2O2 sinh ra oxygen: H 2O2 O2 2 H 2e (3) Phương pháp này cho kết quả độ chính xác và độ tin cậy cao đối với các mẫu máu có thể tích 100 μL.
Nhược điểm cơ bản của các cảm biến thế hệ thứ nhất là khi xác định nồng độ H2O2 cần có thế oxy hóa điện hóa cao, gây nhiễu các tín hiệu điện mà đầu dò của điện cực ghi nhận được. Thế oxy hóa điện hóa cao khi áp vào điện cực cũng dẫn đến sự oxi hóa các chất khác có trong mẫu máu hoặc huyết thanh như ascorbic acid, uric acid và một số loại thuốc có trong máu như acetaminophen làm sai lệch kết quả đo [45]. Có hai cách chính để làm giảm nhiễu đã được áp dụng: một là sử dụng màng phủ chọn lọc phù hợp để giảm các chất có thể gây nhiễu tiến tới gần bề mặt điện cực.