CHƯƠNG 1: Tổng quan 1.1 Cảm biến sinh học 1.1 Định nghĩa và cấu tạo cảm biến sinh học Hiệp hội quốc tế về hóa học ứng dụng – IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) năm 1999 đã định nghĩa: Cảm biến sinh học (biosensor) là một thiết bị tích hợp có khả năng cung cấp thông tin phân tích định lượng hoặc bán định lượng đặc trưng, bao gồm một phần tử nhận biết sinh học (bioreceptor) kết hợp trực tiếp với một phần tử chuyển đổi tín hiệu (transducer). Chất được gắn trên bộ phận chuyển đổi được gọi là “phần tử dò/phần tử nhận biết sinh học”, chất cần phân tích trong mẫu được gọi là “phần tử đích”. Nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học là dựa trên các phản ứng đặc hiệu: kháng nguyên/kháng thể (cảm biến miễn dịch), lai hóa DNA-DNA (cảm biến DNA) hoặc enzym/cơ chất (cảm biến enzym)… Trên cơ sở các phản ứng đặc hiệu này, phần tử nhận biết sinh học giữ vai trò dò tìm đối tượng đích trong mẫu phân tích và phần tử chuyển đổi giữ vai trò chuyển đổi tương tác sinh học thành tín hiệu điện hóa, quang, nhiệt… sau đó đưa qua bộ phận xử lý tín hiệu và hiển thị kết quả đo (hình 1.1 Nguyên lý cấu tạo của cảm biến sinh học[1] Có nhiều dạng chuyển đổi tín hiệu như chuyển đổi điện hóa, chuyển đổi quang, chuyển đổi nhiệt, chuyển đổi bằng tinh thể áp điện hoặc chuyển đổi bằng các hệ vi cơ… Trong đó, cảm biến sinh học trên cơ sở chuyển đổi theo nguyên lý điện hóa có nhiều khả năng ứng dụng trong phân tích các đối tượng y sinh vì độ nhạy tốt và có thể vi cấu trúc hóa để chuyển đổi thành các thiết bị cầm tay. Nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học điện hóa là chuyển các tín hiệu của phản ứng sinh hóa giữa phần tử nhận biết sinh học và phần tai lieu, luan van, khoa luan, tieu luan 17 of 61.
3 Header Page of 61. tử đích trong dung dịch điện ly thành các tín hiệu được nhận biết bởi kỹ thuật điện hóa. Các kỹ thuật điện hóa có thể được sử dụng để đánh giá một cách định lượng (theo nồng độ) hoặc định tính (âm tính/dương tính) sự có mặt của các thành phần sinh học (DNA hoặc kháng nguyên/kháng thể…) trong dung dịch. Có nhiều phương pháp để đo tín hiệu điện hóa khi có sự tương tác giữa đầu thu sinh học và chất cần phân tích như đo dòng, đo thế, đo độ dẫn và đo phổ tổng trở…[54].
Tuy nhiên, bên cạnh đó cảm biến sinh học điện hóa cũng có nhiều nhược điểm như (1) cần thiết bị nghiên cứu đắt tiền (máy đo), các điện cực để nghiên cứu cũng có chi phí cao, gia công phức tạp. So với cảm biến điện hóa thì cảm biến so màu có một số lợi thế như có thể quan sát bằng mắt thường nhờ sự chuyển màu của các chất chỉ thị, dụng cụ tiến hành đơn giản, gia công dễ dàng…Do đó cảm biến sinh học so màu đang được dùng nhiều trong thực tế và khẳng định được sự tin cậy như phép xét nghiệm ELISA trong xét nghiệm bệnh ung thư, cảm cúm, các bệnh do virus, ở bệnh viện [1, 2].2 Các thành phần của cảm biến sinh học 1.1 Đầu dò (capture probe) Cảm biến sinh học là khái niệm chỉ cảm biến mà có đầu dò là các phần tử sinh học (bioreceptors) như là enzym, kháng thể (antibody), các chuỗi DNA hoặc RNA hoặc các chuỗi peptit hoặc protein dùng để phát hiện các chất cần phân tích. Quan hệ giữa đầu dò (probe) và đối tượng cần phát hiện (hay còn gọi là đích- target) có thể tóm lược thành 3 nhóm chính như sau: (1) Nếu đầu dò là các đoạn DNA hay RNA hoặc axit nucleic peptide sẽ ứng dụng trong chế tạo các bộ cảm biến DNA hay RNA nhằm phát hiện ra các đoạn DNA hoặc RNA dùng trong các nghiên cứu sinh học xét nghiệm huyết thống bệnh tật, trong chuyển đổi gen. Nguyên tắc hoạt động là các chuỗi này có quan hệ bổ sung (ghép cặp) rất nhạy và rất chọn lọc nên cảm biến loại này có độ nhạy cao và tính chọn lọc [3-17].
Ngày nay, chủ yếu là oligodeoxyribo- nucleotides tổng hợp (ODNs) được sử dụng làm đầu dò trong cảm biến DNA. Một kháng thể (antibody) sẽ liên kết một cách đặc hiệu với một đối tượng kháng nguyên (antigen) [7, 18-22], tạo ra độ chọn lọc cao (tính đặc hiệu tốt) cho phép phân tích. Cảm biến kiểu này dùng rất phổ biến với nhiều tai lieu, luan van, khoa luan, tieu luan 18 of 61. 4 Header Page of 61.
bộ kit được phát triển để phân tích các mẫu thực phẩm, nước uống, bệnh phẩm…với tên gọi chung là bộ kit ELISA. Ví dụ bộ kit xét nghiệm là các chất độc hại như 2,4-D (chất độc màu da cam); các phụ gia trong sản xuất giấy gói có ảnh hưởng đến sức khỏe như bisphenol A; các loại thuốc diệt cỏ, thuốc trừ sâu như atrazine hoặc các loại protein bệnh như virus cúm, bệnh ung thư. Một số cảm biến enzym đã được phát triển và ứng dụng [23-29]. Ví dụ với đầu dò là enzym thì sẽ dùng để phát hiện các cơ chất tương ứng với enzym đó, ví dụ enzym glucose oxidase (GOx) dùng để phát hiện glucose; enzym cholesterol oxidase dùng để phát hiện cholesterol….Ngoài ra, do cảm biến enzym rất nhạy, phản ứng nhanh và chọn lọc nên cảm biến enzym còn được dùng trong việc khuếch đại tín hiệu để nâng cao giói hạn phát hiện cho các loại cảm biến khác.
Trong Luận án này sử dụng đầu dò enzym GOx để nhận biết cơ chất tương ứng là glucose, một trong các chỉ số sinh hóa quan trọng của máu. GOx sẽ oxy hóa glucose thành gluconic và giải phóng H2O2 theo phản ứng (PT 1. GOx 𝐺𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑒 + O2 + H2 O → Gluconic + H2 O2 (PT 1.1) Có nhiều cách khác nhau để đo nồng độ H2O2 giải phóng ra theo (PT 1.1) và nồng độ H2O2 sẽ phản ánh nồng độ glucose trong mẫu. Ngày nay, phân tích glucose bằng GOx tích hợp thêm enzym Horseradish peroxidase (HRP) một loại enzym phân hủy H2O2 tạo gốc OH tự do và giải phóng electron qua đó có thể đo nồng độ H2O2 bằng phương pháp điện hóa hoặc so màu trở thành một cấu trúc cảm biến sinh học kinh điển.2 Bộ phận chuyển đổi (transducer) Hình 1.2 Phân loại cảm biến trên cơ sở bộ phận chuyển đổi (transducer)[2] Bộ phận chuyển đổi trong các cảm biến sinh học là bộ phận chuyển đổi tín hiệu của việc bắt cặp nhau giữa đầu dò và đích thành các tín hiệu có thể đo được [30-32].
Tùy vào tai lieu, luan van, khoa luan, tieu luan 19 of 61. 5 Header Page of 61. tín hiệu đầu ra (output signal) mà chúng ta có thể gọi tên là cảm biến điện hóa hay cảm biến quang…Như tóm tắt ở hình 1.2, hầu hết các loại cảm biến sinh học có thể phân thành 5 loại bộ phận chuyển đổi tín hiệu khi có phản ứng (bắt cặp giữa đầu dò và đích) thành tín hiệu đo đạc được, gồm tín hiệu điện hóa (electrochemical), điện (electrical), quang (optical), cơ hoặc áp điện (piezoelectric) hoặc nhiệt (thermal). Trong luận án này chúng tôi sử dụng bộ phận chuyển đổi quang học hay còn gọi là cảm biến quang với sự đổi màu của chất chỉ thị nên còn có thể gọi là cảm biến so màu.3 Cảm biến so màu Từ khi ngành hóa học phát triển đã sử dụng các chất chỉ thị, chất chỉ thị màu để phát hiện môi trường các chất một cách nhanh chóng và đến nay các chất chỉ thị vẫn được sử dụng rộng dãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau.
Để nâng cao độ tiện dụng cũng như để ứng dụng rộng rãi trong đời sống người ta đã chế tạo ra các bộ kit so màu để xác định nồng độ một số chất thậm chí để xác định tình trạng bệnh tật. Chẳng hạn, bộ so màu đơn giản và hay dùng nhất là giấy pH (hình 1.3a), sau đó là các que thử như thử 10 chỉ tiêu trong nước tiểu (gồm pH, tỷ trọng) (hình 1.3c), giấy thử hàn the trong thực phẩm như chả, bún, phở (hình 1.3d); bộ kit xét nghiệm sự có mặt của methanol trong rượu (hình 1.3e) và cao cấp là que thử thai (hình 1.3 Cảm biến so màu phổ dụng: (a) giấy đo độ pH; (b) Hộp que thử 10 thông số của nước tiểu và (c) các màu sắc ứng với nồng độ trong 10 thông số của que thử nước tiểu; (d) giấy thử hàn the trong thực phẩm; (e) bộ kit xác định hàm lượng methanol trong rượu và (f) que thử thai. Nguyên tắc hoạt động của cảm biến so màu ở dạng giấy chỉ thị khá đơn giản, đó là trên cơ sở giấy có độ tro thấp, người ta sẽ tẩm các hóa chất đóng vai trò là chất chỉ thị lên. Khi thử, gặp các tác nhân cần kiểm tra ở trong mẫu thì chỉ thị sẽ biến đổi màu, tùy thuộc tai lieu, luan van, khoa luan, tieu luan 20 of 61.
6 Header Page of 61. vào màu sắc và cường độ để xác định sự có mặt của tác nhân cần kiểm tra cao hay thấp. Đại đa số cảm biến so màu là cảm biến hóa học, chỉ một số ít là cảm biến sinh học như que thử thai là cảm biến sinh học dựa theo phản ứng kháng nguyên - kháng thể để xét nghiệm hormone HCG (Human Chorionic Gonadotrophin). Hiện nay ngày càng có nhiều cảm biến sinh học dựa trên phương pháp so màu đang được phát triển vì tính tiện lợi và đơn giản của quy trình xét nghiệm.
Cảm biến so màu không chỉ được phát triển để xét nghiệm các hóa chất hay các phần tử sinh học, loại cảm biến này đang được phát triển cho xét nghiệm quản lý môi trường, kiểm tra chất lượng nước.4 Một số ứng dụng của cảm biến sinh học Các cảm biến sinh học tỏ ra có nhiều ưu điểm so với các phương pháp truyền thống như tính chọn lọc cao, đáp ứng nhanh, đơn giản và chính xác. Chính vì vậy nó được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của cuộc sống, tuy nhiên hiện nay chủ yếu được dùng cho các lĩnh vực sau: 1. Ứng dụng trong kiểm nghiệm an toàn thực phẩm và kiểm soát môi trường (a) (b) Hình 1.4 (a) Bộ kit cảm biến sinh học để xác định phân tử nấm aflatoxin B1 trong thực phẩm theo nguyên lý cảm biến miễn dịch ELISA [33]và (b) Bộ kit xét nghiệm dư lượng thuốc bảo vệ thực vật trong nước [34] Ngày nay vấn đề môi trường và vệ sinh an toàn thực phẩm là mối quan tâm của toàn xã hội. Các hệ cảm biến được phát triển và ứng dụng trong phân tích nhanh dư lượng các loại thuốc trừ sâu, dư lượng các chất kháng sinh, các nấm mốc độc hại tồn tại trong thức ăn như sabutamon, aflatoxin (hình 1.