Chương 1: CẢM BIẾN ADN ĐIỆN HÓA Hiện nay, cùng với các phương pháp phân tích truyền thống như PCR, ELISA, cảm biến sinh học cũng đang dần trở thành thiết bị bổ sung hiệu quả để xác định vi sinh vật gây bệnh. Cảm biến sinh học đầu tiên trên thế giới được nghiên cứu bởi L. Clark vào năm 1962 là cảm biến sinh học enzym dùng để phát hiện gluco trong máu [13]. Kể từ đó, cộng đồng nghiên cứu từ các lĩnh vực khác nhau như: vật lý, hóa học, vật liệu… đã cùng nhau nghiên cứu phát triển loại cảm biến này ngày hoàn thiện hơn nữa.
Cấu tạo chung của một cảm biến sinh học bao gồm: 1) Bộ chuyển đổi (transducer): là các cảm biến vật lý hoặc hoá học giúp chuyển đổi các tín hiệu thu được do các phản ứng sinh hóa tạo ra thành các tín hiệu có thể quan sát được. 2) Tác nhân cố định: là thành phần làm cầu nối giúp gắn kết các phần tử sinh học lên trên bề mặt cảm biến. Tác nhân cố định thường là các vật liệu polyme dẫn, ống nano cacbon, ô xít kim loại, vật liệu nano composit hoặc vật liệu lai [5–7], [11]. 3) Phần tử nhận biết sinh học (bioreceptor): là enzym, kháng thể, đoạn ssADN…[15], có vai trò tương tác với chất cần phân tích tạo ra các tín hiệu đặc trưng, các tín hiệu này được phát hiện bằng bộ chuyển đổi.
Ngoài ra, nó còn có bộ phận chuyển đổi và xử lý tín hiệu. Có nhiều cách để phân loại cảm biến sinh học. Dựa vào các phần tử sinh học, nó được chia thành cảm biến enzym, cảm biến miễn dịch và cảm biến ADN…v. Nếu dựa vào bộ chuyển đổi tín hiệu, cảm biến sinh học được chia thành cảm biến quang, cơ, nhiệt, điện.
Trong đó, cảm biến sinh học trên cơ sở bộ chuyển đổi tín hiệu điện được sử dụng nhiều hơn cả do nó có cấu tạo đơn giản, thiết bị nhỏ gọn, độ nhạy cao. Trong các bộ chuyển đổi tín hiệu điện, bộ chuyển đổi tín hiệu điện hoá đang được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu. Đây là bộ chuyển đổi dựa vào sự tương tác của các phân tử sinh học với các chất cần phân tích làm thay đổi tín hiệu sinh hoá, tín hiệu này sẽ được phát hiện bằng bộ chuyển đổi và hiển thị ở đầu ra của cảm biến. Trong chương này, tác giả sẽ trình bày tổng quan về cảm biến sinh học ADN điện hoá.
Nội dung chương sẽ khái quát lại cơ sở lý thuyết về các phương pháp điện 6 luan an hóa, các bộ chuyển đổi sử dụng trong cảm biến sinh học ADN, phương pháp cố định, cơ chế phát hiện lai hóa và các ứng dụng của cảm biến sinh học điện hóa ADN.1 Giới thiệu về chuỗi ADN ADN có tên gọi đầy đủ là axit deoxyribo nucleic cấu tạo bởi 2 chuỗi polyme sinh học là các poly nucleotit liên kết với nhau hình thành cấu trúc xoắn kép xung quanh một trục tưởng tượng (Hình 1.1: Hình ảnh mô phỏng phân tử ADN với 2 chuỗi xoắn kép [16] Mỗi nucleotit được cấu tạo bởi các nucleobazo gọi tắt là bazo chứa nitơ liên kết với một phân tử đường deoxyribo và một nhóm phốt phát thông qua các liên kết hóa học. Các nucleotit liên kết với nhau thông qua liên kết hóa học giữa phân tử đường của nucleotit đứng trước với nhóm phốt phát của nucleotit đứng sau. Các chuỗi poly nucleotit của ADN liên kết với nhau thông qua liên kết hydro giữa các cặp bazo A-T và C-G theo nguyên tắc bổ sung cặp bazo. Trong đó A chỉ liên kết với T thông qua 2 liên kết hydro còn C chỉ liên kết với G thông qua 3 liên kết hydro và ngược lại để tạo nên chuỗi dsADN mạch kép như được mô tả ở Hình 1.
Ở đó, 4 loại bazo trong cấu trúc ADN bao gồm: C- Cytosine và T- thymine là 2 bazo có 7 luan an kích thước phân tử nhỏ thuộc nhóm pyrimidin; G- guanine và A- adenine là 2 bazo có kích thước phân tử lớn thuộc nhóm purin (Hình 1. Cấu tạo của chuỗi nucleotit và các bazo có trong chuỗi ADN được mô tả lại ở Hình 1.2: Cấu tạo chuỗi polynucleotit và các nucleo bazo Khi đun nóng vượt quá nhiệt độ sinh lý (khoảng 80÷90 ℃) các chuỗi ssADN trong dsADN xoắn kép sẽ tách nhau ra tạo thành hai chuỗi đơn. Do A liên kết với T bằng 2 liên kết hydro nên liên kết A-T sẽ bị đứt trước còn G liên kết với C bằng 3 liên kết hydro bền vững hơn nên sẽ bị đứt sau ở khoảng nhiệt độ lớn hơn 90 ℃. Hiện tượng này được gọi là hiện tượng biến tính của ADN.
Nhiệt độ mà tại đó các chuỗi ssADN trong chuỗi dsADN cấu trúc xoắn kép tách nhau ra được gọi là điểm chảy (melting point)-Tm của ADN. Giá trị Tm đặc trưng cho các chuỗi dsADN phụ thuộc vào số liên kết A-T và G-C có trong chuỗi dsADN đó. Chuỗi dsADN có lượng liên kết G-C càng cao thì giá trị Tm sẽ càng lớn. Khi hạ nhiệt độ từ từ tới khoảng 60÷70 ℃, các chuỗi ssADN sau khi biến tính sẽ liên kết lại với nhau theo nguyên tắc bổ sung cặp bazo.
Đây được gọi là hiện tượng hồi tính của ADN. Trong số 4 bazo của ADN thì A và G là hai bazo có khả năng oxy hóa dễ nhất trên bề mặt điện cực khi có dòng điện đi qua tại điện thế tương ứng là 1,18 và 1,05 V (so với điện cực calomen bão hòa-SCE) [17]. Đây là một trong những tính chất quan trọng của ADN được các nhà khoa học sử dụng để phát hiện sự lai hóa các chuỗi ssADN trong cảm biến sinh học ADN điện hóa.2 Cơ sở lý thuyết về các phương pháp điện hóa sử dụng trong nghiên cứu cảm biến ADN Các phương pháp điện hóa sử dụng trong nghiên cứu cảm biến ADN hoạt động dựa trên cơ sở bình điện hóa 3 điện cực bao gồm: điện cực làm việc (WE), điện cực đối hay điện cực tham chiếu (CE), thường sử dụng điện cực Pt hoặc C graphit, và điện cực so sánh (RE) có điện thế điện cực không đổi, thường dùng là điện cực Ag/AgCl. Để thực hiện phép đo điện hóa, các điện cực được kết nối với hệ đo điện hoá có phần mềm điều khiển trên máy tính.
Hiện nay, các phương pháp đo phổ biến thường được sử dụng trong các cảm biến sinh học điện hóa nói chung và cảm biến sinh học điện hóa ADN nói riêng là: phương pháp quét thế vòng, quét thế xung vi phân, quét thế sóng vuông và phương pháp đo phổ tổng trở điện hóa. Đặc điểm chính của các phương pháp này được khái quát ở các phần tiếp theo sau đây.1 Phương pháp quét thế vòng Quét thế vòng là phương pháp nghiên cứu điện hóa trên cơ sở cho dòng một chiều đi qua bình điện hóa có điện thế biến đổi theo thời gian với tốc độ quét được giữa ở một giá trị nhất định. Cường độ dòng trao đổi giữa điện cực WE và CE sẽ được ghi lại theo sự thay đổi của điện thế áp đặt lên WE so với điện cực RE. Đồ thị mô tả sự biến thiên của cường độ dòng điện thu được theo quá trình quét thế được gọi là đồ thị CV (cyclic voltammetry) (Hình 1.3: Đồ thị quét thế vòng 9 luan an Quá trình quét thế từ điện thế âm sang điện thế dương gọi là quá trình phân cực thuận và ngược lại quá trình quét thế từ điện thế dương sang điện thế âm gọi là quá trình phân cực ngược.
Khoảng điện thế quét được lựa chọn sao cho làm xuất hiện quá trình oxy hóa khử trên bề mặt điện cực làm việc và có thể thu lại được dưới dạng tín hiệu dòng-thế trên đồ thị CV. Để thu được tín hiệu rõ nét, nhạy với sự thay đổi về tính chất bề mặt điện cực, các chất dò oxy hóa khử như: [Fe(CN)6]3-/4-, [Ru(NH3)6]2-/3-… đã được sử dụng để phát hiện sự lai hóa trong các cảm biến sinh học ADN điện hóa sử dụng phương pháp không đánh dấu. Trong quá trình phân cực thuận, điện thế quét tăng theo thời gian kéo theo sự tăng mật độ điện tích trong lớp kép thì cường độ dòng oxy hóa cũng tăng theo. Khi điện thế quét đạt đến điện thế oxy hóa (Epa) của các ion dò oxy hóa khử thì cường độ dòng oxy hóa sẽ đạt cực đại do lúc này có một lượng lớn ion có trong lớp kép tham gia quá trình oxy hóa.
Nếu chất dò oxy hóa khử trong trường hợp này là [Fe(CN)6]3-/4- thì phản ứng oxy hóa sẽ là: [Fe(CN)6]4- - 1e -> [Fe(CN)6]3- (1.1) Tiếp tục tăng phân cực về phía điện thế dương, cường độ dòng oxy hóa giảm do lúc này mật độ các ion trong lớp kép đã giảm đi đáng kể. Cường độ dòng oxy hóa lúc này phụ thuộc chủ yếu vào tốc độ khuếch tán các ion trong dung dịch. Quá trình phân cực ngược diễn ra ngay khi kết thúc quá trình phân cực thuận, điện thế quét sẽ giảm dần từ điện thế dương hơn về điện thế âm hơn. Tương ứng với mỗi giá trị Epa sẽ có một giá trị điện thế khử Epc đặc trưng cho mỗi loại cấu tử hóa học khác nhau, phụ thuộc vào tính chất bề mặt điện cực, thành phần cấu tử, nhiệt độ và nồng độ các ion có trong dung dịch đo.
Phản ứng khử xảy ra sẽ là: [Fe(CN)6]3- + 1e -> [Fe(CN)6]4- (1.2) Khi sự lai hóa các chuỗi ssADN xảy ra, hình thành nên chuỗi dsADN có cấu trúc xoắn kép sẽ làm tăng mật độ nhóm PO4- mang điện tích âm trên bề mặt điện cực. Do lực đẩy tĩnh điện giữa các nhóm PO4- mang điện tích âm và các ion dò oxy hóa khử (cũng mang điện tích âm) khiến cho các ion này khó tiếp cận với bề mặt điện cực hơn, phản ứng oxy hóa khử xảy ra khó khăn hơn dẫn tới cường độ dòng 10 luan an oxy hóa và cường độ dòng khử giảm, điện thế oxy hóa và điện thế khử tăng. Sự thay đổi vị trí cũng như chiều cao các cực đại dòng oxy hóa (Ipa) và dòng khử (Ipc) trên đồ thị CV (Hình 1.4) là cơ sở để nhận biết quá trình lai hóa các chuỗi ssADN.4: Đồ thị CV cảm biến ADN trước và sau khi lai hóa các chuỗi ssADN 1.2 Phương pháp quét thế xung vi phân (DPV) Quét thế xung vi phân cũng là một phương pháp nghiên cứu điện hóa trên cơ sở bình điện hóa 3 điện cực bằng phương pháp quét thế. Nguyên tắc của phương pháp này là điện cực làm việc được phân cực bằng điện áp một chiều biến thiên tuyến tính theo thời gian, cộng thêm một điện áp xoay chiều dưới dạng xung có biên độ nhỏ không đổi.