Tổng quan luận án

Dịch bệnh truyền nhiễm do vi sinh vật gây ra là vấn đề y tế cộng đồng nghiêm trọng. Trong các tác nhân gây bệnh đường ruột, vi khuẩn Salmonella là nguyên nhân chính gây ra bệnh sốt thương hàn và tiêu chảy cấp ở người. Theo số liệu thống kê của Bộ Y tế Việt Nam, tỷ lệ mắc bệnh thương hàn tính trên 100.000 dân trong năm 2010 là 64,4; năm 2011 là 56,8 (tỷ lệ tử vong 0,02/100.000 dân); đến năm 2016 là 0,58. Đối với trẻ em, số ca mắc thương hàn do vi khuẩn Salmonella ghi nhận trong các năm 2012, 2013, 2014, 2015 và 2016 lần lượt là 613, 706, 469, 492 và 374 ca, trong đó năm 2014 ghi nhận 3 trường hợp tử vong.

Các phương pháp phân tích vi sinh vật truyền thống hiện nay gồm có nuôi cấy tế bào, xét nghiệm miễn dịch liên kết với enzym (ELISA) và phản ứng chuỗi polymerase (PCR). Phương pháp ELISA có giới hạn phát hiện Salmonella trong khoảng $10^4$ đến $10^5\text{ CFU/mL}$ với thời gian làm giàu mẫu kéo dài từ 16 đến 24 giờ. Kỹ thuật PCR cải thiện giới hạn phát hiện xuống mức $5\text{ CFU/mL}$ nhưng đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền, quy trình thao tác khắt khe và phải thực hiện trong phòng thí nghiệm đạt chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO). Do đó, việc nghiên cứu phát triển cảm biến sinh học ADN điện hóa có độ nhạy cao, thời gian phân tích nhanh và thao tác thuận tiện là yêu cầu thực tiễn nhằm bổ sung cho các phương pháp phân tích tiêu chuẩn.

Trong cấu trúc cảm biến sinh học, lớp vật liệu trung gian đóng vai trò gắn kết phân tử sinh học với bề mặt điện cực và chuyển điện tích từ dung dịch phân tích. Ceri đioxit ($\text{CeO}_2$) cấu trúc nano là vật liệu có độ bền hóa học cao, tương thích sinh học, không độc hại, diện tích bề mặt riêng lớn và đặc tính truyền điện tử thuận lợi. $\text{CeO}_2$ có năng lượng vùng cấm $E_g = 3,4\text{ eV}$ và điểm đẳng điện cao ($\text{IEP} = 9,2$), tạo điều kiện hấp phụ các phân tử sinh học có điểm đẳng điện thấp. Tuy nhiên, màng điện cực đơn pha từ hạt oxit kim loại thường gặp hiện tượng co cụm và suy giảm biên giới hạt, làm giảm diện tích tiếp xúc hiệu dụng. Để giải quyết vấn đề này, việc chế tạo vật liệu nano composit cấu trúc lõi-vỏ giữa thanh nano $\text{CeO}_2$ và polyme dẫn polypyrrole (Ppy) được đặt ra nhằm duy trì độ xốp cấu trúc, tăng cường diện tích bề mặt và nâng cao hiệu suất dẫn truyền điện tích.

Mục tiêu chung của luận án là phát triển cảm biến sinh học ADN trên cơ sở vật liệu $\text{CeO}_2$ có cấu trúc nano nhằm xác định vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy cấp Salmonella.

Mục tiêu cụ thể của luận án gồm hai nội dung:

  1. Tổng hợp được vật liệu nano một chiều $\text{CeO}_2$ và vật liệu nano composit $\text{CeO}_2\text{@Ppy}$ có cấu trúc lõi-vỏ.
  2. Phát triển được cảm biến ADN hiệu suất cao trên cơ sở vật liệu nano một chiều $\text{CeO}_2$ chế tạo được.

Nội dung nghiên cứu của luận án bao gồm:

  • Nghiên cứu tổng hợp vật liệu nano $\text{CeO}_2$ và vật liệu $\text{CeO}_2\text{@Ppy}$ cấu trúc lõi-vỏ.
  • Nghiên cứu cố định chuỗi ADN lên bề mặt cảm biến.
  • Phát triển cảm biến ADN trên cơ sở các vật liệu đã chế tạo được nhằm phát hiện đoạn ADN của vi khuẩn Salmonella gây bệnh tiêu chảy cấp.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Vật liệu thanh nano $\text{CeO}_2$ ($\text{CeO}_2\text{ NRs}$); vật liệu nano composit cấu trúc lõi-vỏ $\text{CeO}_2\text{@Ppy}$; các chuỗi đơn $\text{ssADN}$ dò và $\text{ssADN}$ đích đặc hiệu của vi khuẩn Salmonella; quá trình cố định và cơ chế lai hóa ADN trên bề mặt điện cực chuyển đổi tín hiệu điện hóa.
  • Phạm vi nghiên cứu: Quá trình tổng hợp vật liệu, khảo sát đặc trưng hóa lý và đo đạc phân tích điện hóa được tiến hành tại Viện Tiên tiến Khoa học và Công nghệ (AIST), Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội; công trình hoàn thành và bảo vệ năm 2020 trong khuôn khổ thời gian đào tạo tiến sĩ 3 năm.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã hệ thống hóa các hướng nghiên cứu về cảm biến sinh học ADN, các kỹ thuật cố định phân tử sinh học, các phương pháp phát hiện lai hóa và quy trình tổng hợp vật liệu nano:

Về phương pháp cố định chuỗi $\text{ssADN}$:

  • Hấp phụ vật lý: Dựa trên liên kết yếu như liên kết hydro, tương tác van der Waals hoặc lực hút tĩnh điện. Azek và cộng sự [21] phát triển cảm biến ADN xác định virus cytomegalo với giới hạn phát hiện $6 \times 10^{-7}\text{ nM}$. Nhóm W. Sun [22] cố định $\text{ssADN}$ dựa trên tương tác tĩnh điện để xác định gen biến đổi ở cây trồng bằng phương pháp quét thế xung vi phân (DPV), đạt giới hạn phát hiện $4,52 \times 10^{-12}\text{ mol/L}$. Bronder và cộng sự [23] sử dụng lớp màng poly(allylamine hydrochloride) tích điện dương để hấp phụ chuỗi $\text{ssADN}$ mang điện tích âm.
  • Liên kết cộng hóa trị: Nhóm nghiên cứu [26-28] cố định $\text{ssADN}$ qua liên kết giữa nhóm amin ($-\text{NH}_2$) trên chuỗi $\text{ssADN}$ và nhóm carboxyl ($-\text{COOH}$) trên bề mặt điện cực để phát hiện gen bar và vi khuẩn Salmonella. Q. Li và cộng sự (2016) [29] sử dụng dendrimer $\text{PANAM-Au}$ kết hợp với $\text{Ppy-streptavidin}$ trên điện cực vàng (Au), phát hiện lai hóa bằng DPV trong khoảng tuyến tính $0,1\text{ nM}$ đến $100\text{ nM}$ với giới hạn phát hiện $0,033\text{ nM}$. R. Nurmalasari và cộng sự (2015) [30] sử dụng liên kết thiol-kim loại trên điện cực Au biến tính bằng cysteamine và chất kết dính glutaraldehyde.
  • Tương tác Avidin/Streptavidin-Biotin: C. Crucifix (2004) [31] cố định $\text{ssADN}$ lên màng lipid thông qua tương tác streptavidin-biotin. Kỹ thuật này cũng được phát triển bởi A. Dupont-Filliard và cộng sự (2004) [32], D. Chung và cộng sự (2011) [33], D. Zauner và cộng sự (2016) [34].
  • Cố định bằng phương pháp điện hóa: J. Wang và cộng sự (1996) [35] áp thế $1,7\text{ V}$ trong 1 phút và $0,5\text{ V}$ trong 2 phút trên điện cực carbon dán để cố định $\text{ssADN}$. C. Hu và cộng sự (2004) [36] áp thế $1,7\text{ V}$ lên điện cực phủ cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) nồng độ $1 \times 10^{-2}\text{ M}$. S. Wu và cộng sự (2006) [37] lắng đọng hạt nano Ag lên điện cực glassy carbon bằng quét thế vòng (CV) để liên kết với nhóm phosphat của $\text{ssADN}$, chế tạo cảm biến phát hiện $\text{H}_2\text{O}_2$ (giới hạn phát hiện $0,6\text{ }\mu\text{M}$) và glucose ($9,0\text{ }\mu\text{M}$).

Về phương pháp phát hiện sự lai hóa ADN:

  • Phương pháp đánh dấu: L. Clark (1962) [13] chế tạo cảm biến sinh học enzym đầu tiên; Millan và Mikkelsen (1993) [43, 44, 71] lần đầu tiên nghiên cứu phát hiện điện hóa sự lai hóa ADN bằng chất chỉ thị oxy hóa khử. Các chất chỉ thị như $[\text{Fe(CN)}_6]^{3-/4-}$, $[\text{Ru(NH}_3)_6]^{3+}$, $[\text{Os(bpy)}_2\text{Cl}_2]$, $[\text{Co(phen)}_3]^{3+}$ liên kết với ADN qua tương tác tĩnh điện, liên kết xen kẽ hoặc liên kết rãnh [49-53]. Đánh dấu bằng enzym như horseradish peroxidase (HRP) trong nghiên cứu của Gang Liu [58] xúc tác khử $\text{H}_2\text{O}_2$. Đánh dấu bằng hạt nano kim loại (Au, Ag) kết hợp đo vôn-ampe anot hòa tan (ASV) trong nghiên cứu của H. Cai và cộng sự (2002) [61]. M. Daneshpour và cộng sự (2016) [62] sử dụng hạt nano lõi-vỏ $\text{Fe}_3\text{O}_4\text{/TMC/Au}$ phát hiện methyl hóa gen RASSF1A với giới hạn phát hiện $2 \times 10^{-15}\text{ M}$.
  • Phương pháp không đánh dấu: Paleček và cộng sự (1996) [63] báo cáo hoạt tính oxy hóa của guanine và adenine trên điện cực carbon và vàng. R. Nurmalasari và cộng sự (2015) [40] thay thế base guanine bằng inosine trong chuỗi dò để phát hiện pic oxy hóa của guanine trên chuỗi đích tại điện thế $0,21\text{ V}$ bằng DPV. Popovich và cộng sự [68] dùng đầu dò xúc tác $[\text{Ru(bpy)}3]^{2+}$. Phương pháp đo phổ tổng trở điện hóa (EIS) không đánh dấu theo dõi sự thay đổi điện trở chuyển điện tích ($R{et}$) với chất dò $[\text{Fe(CN)}_6]^{3-/4-}$ được nghiên cứu bởi các nhóm [28, 69, 70].

Về tổng hợp vật liệu $\text{CeO}_2$ và composit lõi-vỏ:

  • D. Zhang và cộng sự [97] tổng hợp thanh $\text{CeO}_2$ bằng siêu âm trong ethylene glycol (đường kính $5 \div 10\text{ nm}$, chiều dài $50 \div 150\text{ nm}$). T. Ravishankar [98] đốt cháy hỗn hợp $\text{Ce(NH}_4)_2\text{NO}_3$ và EDTA ở $450\text{ }^\circ\text{C}$ tạo hạt $\approx 35\text{ nm}$. Y. Liu [99] đồng kết tủa từ $\text{Ce}_2(\text{SO}_4)_3$ và $\text{C}_2\text{H}_2\text{O}_4$ tạo hạt $200 \div 300\text{ nm}$. A. Tok [100] thủy nhiệt tạo hạt $13 \div 25\text{ nm}$. V. Sabari Arul và cộng sự (2012) [102] thủy nhiệt $\text{Ce(NO}_3)_3\cdot 6\text{H}_2\text{O}$ trong môi trường $\text{NH}_4\text{OH}$ ở $180\text{ }^\circ\text{C}$ trong 24 giờ tạo thanh đường kính $40\text{ nm}$, chiều dài $270\text{ nm}$. Liyanage và cộng sự (2014) [103] thủy nhiệt trong dung dịch $\text{NaOH}$ ($\text{pH} = 14$) ở $110\text{ }^\circ\text{C}$ trong 24 giờ và nung ở $200\text{ }^\circ\text{C}$ tạo thanh đường kính $10,9 \pm 2,8\text{ nm}$, dài $100 \pm 37\text{ nm}$.
  • Về vật liệu composit: F. Chuang và cộng sự [104] tổng hợp $\text{CeO}_2\text{@PANi}$; Wang và cộng sự [105] tổng hợp $\text{CeO}_2\text{@Ppy}$ biến tính APTES và PABA; Kumar và cộng sự [106] tổng hợp $\text{CeO}_2\text{@PANi}$ bằng vi sóng; Zhang và cộng sự [107] tổng hợp $\text{Fe}_3\text{O}_4\text{@Ppy}$.

Khoảng trống nghiên cứu luận án lựa chọn giải quyết: Quy trình tổng hợp thanh nano $\text{CeO}_2$ trước đây thường sử dụng chất tạo kiềm ($\text{NaOH}$, $\text{NH}_4\text{OH}$) đòi hỏi nhiều công đoạn rửa và xử lý nhiệt độ cao. Luận án chọn phương pháp thủy nhiệt trực tiếp từ tiền chất $\text{Ce(NO}_3)_3\cdot 6\text{H}_2\text{O}$ kết hợp chất khoáng hóa $\text{Na}_3\text{PO}_4$ không dùng kiềm. Đồng thời, luận án giải quyết hiện tượng co cụm hạt của màng oxit kim loại đơn pha bằng cách tạo cấu trúc lõi-vỏ $\text{CeO}_2\text{@Ppy}$. Cấu trúc này khai thác sự chênh lệch hàm công giữa Ppy ($\approx 5,0\text{ eV}$) [11] và $\text{CeO}_2$ ($5,34\text{ eV}$) [12] để electron lẻ của Ppy chuyển sang orbital trống $3d^9 4f^0$ của Ce, hỗ trợ liên kết cộng hóa trị với mẫu dò $\text{ssADN}$ và tăng cường truyền điện tích trong phép đo EIS không đánh dấu.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết

  • Cấu trúc sinh học phân tử ADN: Phân tử ADN gồm 2 chuỗi polynucleotit liên kết xoắn kép. Bốn loại nucleobase gồm Adenine (A), Guanine (G) thuộc nhóm purin; Cytosine (C), Thymine (T) thuộc nhóm pyrimidin. A liên kết với T qua 2 liên kết hydro; G liên kết với C qua 3 liên kết hydro. Quá trình biến tính xảy ra khi gia nhiệt tới điểm chảy $T_m$ ($80 \div 90\text{ }^\circ\text{C}$) làm đứt các liên kết hydro; quá trình hồi tính xảy ra khi hạ nhiệt độ ($60 \div 70\text{ }^\circ\text{C}$). Hai base A và G có khả năng oxy hóa trên điện cực tại điện thế tương ứng $1,18\text{ V}$ và $1,05\text{ V}$ (so với điện cực calomen bão hòa SCE).
  • Các phương pháp phân tích điện hóa:
    • Vôn-ampe vòng (CV): Sử dụng hệ bình 3 điện cực (điện cực làm việc WE, điện cực đối CE bằng Pt hoặc carbon graphit, điện cực so sánh RE bằng $\text{Ag/AgCl}$). Quét thế phân cực thuận và phân cực nghịch để ghi nhận dòng oxy hóa ($I_{pa}$) và dòng khử ($I_{pc}$) của cặp oxy hóa khử $[\text{Fe(CN)}_6]^{3-/4-}$.
    • Quét thế xung vi phân (DPV) và quét thế sóng vuông (SWV): Đo dòng vi phân trước và sau các xung thế để nâng cao độ nhạy phát hiện dòng oxy hóa khử.
    • Phổ tổng trở điện hóa (EIS): Đặt điện thế xoay chiều biên độ nhỏ với dải tần số $\omega$ từ $0,1\text{ Hz}$ đến $100\text{ kHz}$. Mạch tương đương Randles gồm: điện trở dung dịch $R_s$, phần tử pha không đổi $\text{CPE}$ (hoặc điện dung lớp kép $C_{dl}$), điện trở chuyển điện tích $R_{et}$ và tổng trở khuếch tán Warburg $Z_w$. Giản đồ Nyquist gồm đường bán nguyệt ở vùng tần số cao (đặc trưng cho $R_{et}$ bị khống chế bởi động học truyền điện tích) và đường thẳng nghiêng ở vùng tần số thấp (khống chế bởi quá trình khuếch tán).
  • Cơ chế cảm biến ADN không đánh dấu: Khi chuỗi $\text{ssADN}$ dò được cố định và tiếp tục lai hóa với $\text{ssADN}$ đích tạo thành chuỗi xoắn kép $\text{dsADN}$, mật độ các nhóm $\text{PO}_4^-$ mang điện tích âm trên bề mặt điện cực tăng lên. Lực đẩy tĩnh điện giữa các nhóm $\text{PO}4^-$ và ion dò $[\text{Fe(CN)}6]^{3-/4-}$ làm cản trở quá trình trao đổi điện tử, dẫn đến sự gia tăng giá trị điện trở chuyển điện tích $R{et}$ (mở rộng bán kính đường bán nguyệt trên giản đồ Nyquist). Sự biến thiên của $R{et}$ là tín hiệu định lượng nồng độ chuỗi đích.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

  • Phương pháp chế tạo vật liệu:
    • Phương pháp thủy nhiệt tổng hợp thanh nano $\text{CeO}_2$ trong bình Teflon vỏ thép chịu áp suất.
    • Phương pháp trùng hợp hóa học tạo lớp vỏ polypyrrole trên lõi thanh nano $\text{CeO}_2$ với chất oxy hóa $\text{FeCl}_3$.
  • Phương pháp cố định sinh học: Sử dụng phương pháp liên kết cộng hóa trị để gắn chuỗi $\text{ssADN}$ dò lên bề mặt vật liệu cảm biến.
  • Phương pháp và thiết bị đặc trưng vật liệu:
    • Kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường (FESEM - JEOL/JSM-7600F).
    • Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM).
    • Phổ tán sắc năng lượng tia X (EDS).
    • Giản đồ nhiễu xạ tia X (XRD).
    • Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR).
    • Phân tích nhiệt trọng lượng (TGA) trên thiết bị Labsys TG/DSC (SETARAM - Pháp).
    • Quang phổ hấp thụ UV-Vis và kính hiển vi huỳnh quang.
  • Phương pháp phân tích điện hóa: Thực hiện các phép đo CV và EIS trên hệ đo điện hóa đa năng với phần mềm IM6-Thales tại Viện AIST, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội.
  • Phương pháp sinh học đối chứng: Thực hiện phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện vi khuẩn Salmonella và so sánh đối chứng với kết quả đo của cảm biến ADN.

Nguồn tư liệu và dữ liệu

Hóa chất sử dụng có độ tinh khiết phân tích gồm $\text{Ce(NO}_3)_3\cdot 6\text{H}_2\text{O}$, $\text{Na}_3\text{PO}_4$, pyrrole ($\text{C}_6\text{H}_5\text{N}$), $\text{FeCl}_3\cdot 6\text{H}_2\text{O}$, $\text{H}_2\text{SO}_4$, $\text{C}_2\text{H}_5\text{OH}$, dung dịch đệm phosphat ($\text{PBS}$, $\text{pH} = 7,4$), $\text{K}_3[\text{Fe(CN)}_6]$ từ hãng Sigma Aldrich; các đoạn oligonucleotide tổng hợp đại diện cho chuỗi gen của vi khuẩn Salmonella và mẫu vi khuẩn thực tế.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Cảm biến ADN điện hóa

Chương 1 trình bày cơ sở lý thuyết tổng quan về cấu tạo chuỗi polynucleotit, cơ chế lai hóa, hiện tượng biến tính và hồi tính của ADN. Chương tổng quan chi tiết 4 phương pháp điện hóa chính (CV, DPV, SWV, EIS) và 4 nhóm kỹ thuật cố định chuỗi $\text{ssADN}$ dò (hấp phụ vật lý, liên kết cộng hóa trị, tương tác streptavidin-biotin, cố định điện hóa). Đồng thời, chương so sánh hai hướng phát hiện lai hóa là phương pháp đánh dấu (chất chỉ thị oxy hóa khử, enzym, hạt nano) và phương pháp không đánh dấu (oxy hóa trực tiếp base purin, đo phổ tổng trở EIS). Trên cơ sở phân tích ưu nhược điểm, tác giả lựa chọn phương pháp đo phổ tổng trở điện hóa EIS không đánh dấu dựa trên sự thay đổi điện trở chuyển điện tích $R_{et}$ của ion dò $[\text{Fe(CN)}_6]^{3-/4-}$ trong dung dịch đệm $\text{PBS}$ ($\text{pH} = 7,4$) để phát triển cảm biến phát hiện vi khuẩn Salmonella.

Chương 2: Nghiên cứu tổng hợp vật liệu thanh nano $\text{CeO}_2$ & nano composit $\text{CeO}_2\text{@Ppy}$

Chương 2 trình bày quy trình thực nghiệm và kết quả khảo sát các thông số công nghệ ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp thanh nano $\text{CeO}_2$ bằng phương pháp thủy nhiệt và vật liệu nano composit lõi-vỏ $\text{CeO}_2\text{@Ppy}$ bằng phương pháp trùng hợp hóa học.

Vật liệu Tiền chất và hóa chất chính Điều kiện tổng hợp tối ưu Đặc trưng hình thái và cấu trúc
Thanh nano $\text{CeO}_2$ ($\text{CeO}_2\text{ NRs}$) $\text{Ce(NO}_3)_3\cdot 6\text{H}_2\text{O}$, $\text{Na}_3\text{PO}_4$, $\text{H}_2\text{O}$ $[\text{Ce(NO}_3)_3] = 0,4\text{ M}$; $[\text{Na}_3\text{PO}_4] = 4%$; Nhiệt độ: $200\text{ }^\circ\text{C}$; Thời gian: $24\text{ h}$ Chiều dài $\approx 200\text{ nm}$, đường kính $\approx 20\text{ nm}$, dạng thanh đồng đều, cấu trúc tinh thể xác nhận qua XRD và EDS
Nano composit $\text{CeO}_2\text{@Ppy}$ $\text{CeO}_2\text{ NRs}$, pyrrole, tác nhân oxy hóa $\text{FeCl}_3$ ($50\text{ mg}$ trong $100\text{ mL}$) Tỷ lệ khối lượng $\text{CeO}_2\text{/Py} = 1/10$; Thời gian trùng hợp: $6\text{ h}$ Cấu trúc lõi-vỏ với lõi là thanh $\text{CeO}_2$ và vỏ là lớp màng polypyrrole mỏng, xác nhận qua FESEM, TEM, FTIR, XRD, TGA

Kết quả phân tích FESEM và XRD cho thấy nồng độ chất khoáng hóa $\text{Na}_3\text{PO}_4$, nhiệt độ và thời gian thủy nhiệt có tính quyết định đến hình thái thanh của $\text{CeO}_2$. Đối với nano composit, tỷ lệ $\text{CeO}_2\text{/Py} = 1/10$ trong 6 giờ đảm bảo lớp vỏ Ppy phủ đồng đều lên thanh $\text{CeO}_2$ mà không gây hiện tượng vón cục hạt polypyrrole tự do.

Chương 3: Phát triển cảm biến ADN trên cơ sở các thanh nano $\text{CeO}_2$

Chương 3 tập trung vào quy trình chế tạo cảm biến ADN sử dụng màng biến tính thanh nano $\text{CeO}_2$. Chuỗi $\text{ssADN}$ dò được cố định lên bề mặt điện cực thông qua liên kết cộng hóa trị. Quá trình cố định được kiểm chứng bằng phổ FTIR (xuất hiện các đỉnh hấp thụ đặc trưng của nhóm phosphat và nucleobase), phổ hấp thụ quang học UV-Vis và ảnh chụp kính hiển vi huỳnh quang.

Các điều kiện thực nghiệm được khảo sát và tối ưu hóa bao gồm: giá trị pH dung dịch đo, nồng độ ion chất điện ly trong đệm, nồng độ $\text{ssADN}$ dò cố định và thời gian lai hóa với chuỗi $\text{ssADN}$ đích. Hiệu suất phân tích của cảm biến trên cơ sở $\text{CeO}_2\text{ NRs}$ được xác định qua phép đo phổ tổng trở điện hóa EIS:

  • Khoảng tuyến tính phát hiện: $0,01\text{ }\mu\text{M} \div 2\text{ }\mu\text{M}$.
  • Độ nhạy cảm biến: $3362,1\text{ }\Omega\cdot\mu\text{M}^{-1}\cdot\text{cm}^{-2}$.
  • Giới hạn phát hiện (LOD): $0,01\text{ }\mu\text{M}$.
  • Cảm biến thể hiện độ lặp lại tín hiệu tốt, độ ổn định theo thời gian, tính chọn lọc đối với chuỗi ADN đích của vi khuẩn Salmonella và khả năng tái sử dụng.

Chương 4: Cảm biến sinh học ADN trên cơ sở vật liệu nano composit $\text{CeO}_2\text{@Ppy}$

Chương 4 nghiên cứu phát triển cảm biến sinh học ADN trên cơ sở vật liệu nano composit cấu trúc lõi-vỏ $\text{CeO}_2\text{ NR@Ppy}$. Lớp vỏ Ppy làm tăng mật độ liên kết với chuỗi $\text{ssADN}$ dò và cải thiện tốc độ truyền điện tích giữa chất chỉ thị $[\text{Fe(CN)}_6]^{3-/4-}$ và bề mặt điện cực. Bề mặt cảm biến được đặc trưng qua ảnh huỳnh quang, phổ FTIR, đường cong CV và giản đồ Nyquist EIS.

Sau khi tối ưu hóa các điều kiện thực nghiệm, cảm biến trên cơ sở $\text{CeO}_2\text{ NR@Ppy}$ cho thấy các thông số phân tích vượt trội:

  • Khoảng tuyến tính phát hiện: $0,01\text{ nM} \div 0,4\text{ nM}$.
  • Độ nhạy cảm biến: $593,7\text{ }\Omega\cdot\text{nM}^{-1}\cdot\text{cm}^{-2}$.
  • Giới hạn phát hiện (LOD): $0,084\text{ nM}$.
  • Giới hạn định lượng (LOQ): $0,28\text{ nM}$.
  • Cảm biến có độ chọn lọc cao khi phân biệt chuỗi ADN đích với các chuỗi không tương thích hoặc chứa bazo lỗi, độ lặp lại và độ ổn định lưu trữ cao.

Chương 4 cũng thực hiện thử nghiệm phát hiện vi khuẩn Salmonella thực tế bằng cảm biến ADN và so sánh đối chứng với kết quả của phương pháp PCR truyền thống, cho thấy sự tương đồng về khả năng phát hiện mẫu vi khuẩn.

Thông số phân tích Cảm biến nền thanh nano $\text{CeO}_2$ (Chương 3) Cảm biến nền nano composit lõi-vỏ $\text{CeO}_2\text{@Ppy}$ (Chương 4)
Vật liệu biến tính Thanh nano $\text{CeO}_2$ ($\text{CeO}_2\text{ NRs}$) Nano composit lõi-vỏ $\text{CeO}_2\text{ NR@Ppy}$
Phương pháp đo Phổ tổng trở điện hóa (EIS) không đánh dấu Phổ tổng trở điện hóa (EIS) không đánh dấu
Chất dò điện hóa $[\text{Fe(CN)}_6]^{3-/4-}$ trong đệm $\text{PBS}$ ($\text{pH} = 7,4$) $[\text{Fe(CN)}_6]^{3-/4-}$ trong đệm $\text{PBS}$ ($\text{pH} = 7,4$)
Khoảng tuyến tính $0,01\text{ }\mu\text{M} \div 2\text{ }\mu\text{M}$ ($10\text{ nM} \div 2000\text{ nM}$) $0,01\text{ nM} \div 0,4\text{ nM}$
Độ nhạy $3362,1\text{ }\Omega\cdot\mu\text{M}^{-1}\cdot\text{cm}^{-2}$ $593,7\text{ }\Omega\cdot\text{nM}^{-1}\cdot\text{cm}^{-2}$
Giới hạn phát hiện (LOD) $0,01\text{ }\mu\text{M}$ ($10\text{ nM}$) $0,084\text{ nM}$
Giới hạn định lượng (LOQ) Không nêu cụ thể $0,28\text{ nM}$
Đối chứng sinh học Khảo sát tính chọn lọc với chuỗi oligonucleotide Kiểm chứng so sánh trực tiếp với phương pháp PCR

Kết quả và những đóng góp mới

Các kết quả nghiên cứu của luận án mang lại những đóng góp mới cụ thể như sau:

  1. Đã tổng hợp được vật liệu thanh nano $\text{CeO}_2$ có chiều dài $\approx 200\text{ nm}$ và đường kính $\approx 20\text{ nm}$ bằng phương pháp thủy nhiệt với tiền chất ban đầu là $\text{Ce(NO}_3)_3\cdot 6\text{H}_2\text{O}$ và chất khoáng hóa $\text{Na}_3\text{PO}_4$ ở nhiệt độ $200\text{ }^\circ\text{C}$ trong thời gian thủy nhiệt 24 giờ.
  2. Đã chế tạo được vật liệu nano composit có cấu trúc lõi-vỏ $\text{CeO}_2\text{/Ppy}$ bằng phương pháp trùng hợp hóa học với tỷ lệ tiền chất $\text{CeO}_2\text{/Py} = 1/10$, thời gian tổng hợp 6 giờ trong dung dịch chứa $\text{FeCl}_3$.
  3. Đã phát triển được cảm biến ADN điện hóa trên cơ sở vật liệu thanh nano $\text{CeO}_2$ nhằm xác định vi khuẩn Salmonella với khoảng phát hiện tuyến tính từ $0,01\text{ }\mu\text{M}$ đến $2\text{ }\mu\text{M}$, độ nhạy $3362,1\text{ }\Omega\cdot\mu\text{M}^{-1}\cdot\text{cm}^{-2}$ và giới hạn phát hiện đạt $0,01\text{ }\mu\text{M}$.
  4. Đã phát triển được cảm biến sinh học ADN dựa trên vật liệu nano composit cấu trúc lõi-vỏ $\text{CeO}_2\text{-NR@Ppy}$ nhằm phát hiện vi khuẩn Salmonella với khoảng tuyến tính là $0,01 \div 0,4\text{ nM}$, độ nhạy $593,7\text{ }\Omega\cdot\text{nM}^{-1}\cdot\text{cm}^{-2}$, giới hạn phát hiện đạt $0,084\text{ nM}$ và giới hạn định lượng đạt $0,28\text{ nM}$.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất từ nghiên cứu: Cần tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện quy trình công nghệ chế tạo màng cảm biến trên các cấu trúc điện cực in màng mỏng (screen-printed electrodes), hướng tới tích hợp vào các thiết bị đo điện hóa cầm tay phục vụ chẩn đoán nhanh tại hiện trường.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế của nghiên cứu: Các thử nghiệm phân tích chủ yếu được tiến hành trong môi trường dung dịch đệm nhân tạo và đối chứng với kỹ thuật PCR trong điều kiện phòng thí nghiệm tiêu chuẩn; chưa thực hiện khảo sát trên phổ rộng các mẫu bệnh phẩm lâm sàng hoặc mẫu thực phẩm thực tế phức tạp có nền mẫu chứa nhiều tạp chất sinh hóa cạnh tranh.
  • Hướng nghiên cứu tiếp theo: Tiếp tục tối ưu hóa quy trình chế tạo màng vật liệu nano composit trên các hệ điện cực vi lưu (microfluidics) hoặc hệ thống Lab-on-a-Chip nhằm giảm thể tích mẫu phân tích, tự động hóa quy trình đo và mở rộng khả năng phát hiện đồng thời nhiều chủng vi sinh vật gây bệnh truyền nhiễm khác nhau.

Giá trị tham khảo

  • Đối tượng thụ hưởng: Cán bộ nghiên cứu, giảng viên, nghiên cứu sinh và học viên cao học thuộc các chuyên ngành Khoa học vật liệu, Vật liệu bán dẫn nano, Hóa học phân tích điện hóa, Kỹ thuật y sinh và Công nghệ sinh học.
  • Nội dung tham khảo giá trị:
    • Quy trình công nghệ thủy nhiệt tổng hợp thanh nano $\text{CeO}_2$ sử dụng chất tạo mầm $\text{Na}_3\text{PO}_4$ không dùng kiềm.
    • Phương pháp trùng hợp hóa học tạo màng bọc polypyrrole trên lõi oxit kim loại tạo cấu trúc nano composit lõi-vỏ.
    • Quy trình cố định chuỗi $\text{ssADN}$ cộng hóa trị và kỹ thuật phân tích phổ tổng trở điện hóa EIS không đánh dấu ứng dụng trong cảm biến sinh học.

Câu hỏi thường gặp

1. Vì sao $\text{CeO}_2$ cấu trúc nano được lựa chọn làm vật liệu trung gian cho cảm biến sinh học điện hóa?

$\text{CeO}_2$ cấu trúc nano có độ bền hóa học cao, tương thích sinh học, không độc hại, diện tích bề mặt riêng lớn, độ dẫn điện và khả năng vận chuyển electron thuận lợi. Vật liệu có năng lượng vùng cấm rộng $E_g = 3,4\text{ eV}$ và điểm đẳng điện cao $\text{IEP} = 9,2$, cho phép hấp phụ các phân tử sinh học có điểm đẳng điện thấp mà không cần xử lý hóa học phức tạp.

2. Luận án khắc phục hiện tượng co cụm hạt của màng $\text{CeO}_2$ đơn pha bằng giải pháp nào?

Tác giả bao phủ các thanh nano $\text{CeO}_2$ bằng lớp màng polypyrrole (Ppy) mỏng để tạo vật liệu nano composit cấu trúc lõi-vỏ $\text{CeO}_2\text{@Ppy}$. Sự chênh lệch hàm công giữa Ppy ($\approx 5,0\text{ eV}$) và $\text{CeO}_2$ ($5,34\text{ eV}$) tạo điều kiện cho các electron lẻ của Ppy chuyển sang orbital trống $3d^9 4f^0$ của Ce, duy trì độ xốp cấu trúc, tăng khả năng cố định mẫu dò $\text{ssADN}$ và hỗ trợ chuyển dịch điện tích.

3. Điều kiện công nghệ tối ưu để tổng hợp thanh nano $\text{CeO}_2$ và composit $\text{CeO}_2\text{@Ppy}$ là gì?

  • Thanh nano $\text{CeO}_2$: Phương pháp thủy nhiệt với nồng độ tiền chất $\text{Ce(NO}_3)_3\cdot 6\text{H}_2\text{O} = 0,4\text{ M}$, chất khoáng hóa $\text{Na}_3\text{PO}_4 = 4%$, nhiệt độ $200\text{ }^\circ\text{C}$, thời gian 24 giờ.
  • Nano composit $\text{CeO}_2\text{@Ppy}$: Phương pháp trùng hợp hóa học với tỷ lệ tiền chất $\text{CeO}_2\text{/Py} = 1/10$, thời gian phản ứng 6 giờ trong $100\text{ mL}$ dung dịch chứa tác nhân oxy hóa $\text{FeCl}_3$.

4. Cơ chế phát hiện lai hóa ADN không đánh dấu bằng phương pháp đo phổ tổng trở điện hóa (EIS) diễn ra như thế nào?

Phương pháp đo lường sự thay đổi điện trở chuyển điện tích $R_{et}$ của đầu dò oxy hóa khử $[\text{Fe(CN)}_6]^{3-/4-}$ tại bề mặt điện cực. Khi chuỗi $\text{ssADN}$ dò lai hóa với $\text{ssADN}$ đích tạo chuỗi xoắn kép $\text{dsADN}$, số lượng nhóm phosphat $\text{PO}_4^-$ tích điện âm tăng lên, tạo lực đẩy tĩnh điện cản trở các ion $[\text{Fe(CN)}6]^{3-/4-}$ tiếp cận bề mặt điện cực, làm tăng giá trị $R{et}$ (tăng bán kính đường bán nguyệt trên giản đồ Nyquist).

5. Sự khác biệt về hiệu năng phát hiện vi khuẩn Salmonella giữa cảm biến nền $\text{CeO}_2\text{ NRs}$ và $\text{CeO}_2\text{ NR@Ppy}$?

Cảm biến trên nền thanh nano $\text{CeO}_2$ có khoảng tuyến tính $0,01 \div 2\text{ }\mu\text{M}$ ($10 \div 2000\text{ nM}$) và giới hạn phát hiện $0,01\text{ }\mu\text{M}$ ($10\text{ nM}$). Khi sử dụng nano composit lõi-vỏ $\text{CeO}_2\text{ NR@Ppy}$, giới hạn phát hiện được hạ thấp đáng kể xuống $0,084\text{ nM}$ (giới hạn định lượng $0,28\text{ nM}$), với khoảng tuyến tính từ $0,01\text{ nM}$ đến $0,4\text{ nM}$, nâng cao độ nhạy phát hiện vi khuẩn ở nồng độ vết.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Nguyễn Thị Nguyệt đã tổng hợp thành công vật liệu thanh nano $\text{CeO}_2$ bằng phương pháp thủy nhiệt và vật liệu nano composit cấu trúc lõi-vỏ $\text{CeO}_2\text{@Ppy}$ bằng phương pháp trùng hợp hóa học. Trên cơ sở các vật liệu chế tạo được, tác giả đã phát triển hệ cảm biến sinh học ADN điện hóa không đánh dấu sử dụng kỹ thuật đo phổ tổng trở điện hóa EIS để phát hiện đoạn gen đặc hiệu của vi khuẩn Salmonella. Cảm biến dựa trên vật liệu nano composit $\text{CeO}_2\text{ NR@Ppy}$ đạt giới hạn phát hiện $0,084\text{ nM}$ trong khoảng tuyến tính $0,01 \div 0,4\text{ nM}$, có độ chọn lọc cao và cho kết quả tương đồng khi đối chứng với phương pháp PCR truyền thống. Công trình cung cấp quy trình công nghệ chế tạo vật liệu nano và đóng góp giải pháp kỹ thuật bổ trợ cho công tác kiểm nghiệm vi sinh vật gây bệnh đường ruột.