Université de Strasbourg ÉCOLE DOCTORALE DES SCIENCES CHIMIQUES Can graphene oxide be a suitable platform for the complexation with nucleic acids? by Ngoc Do Quyen CHAU Thesis submitted for the degree of Doctor of Philosophy in Chemistry 24th November 2017 Supervisor: Dr. BIANCO Alberto Members of the jury: Dr. PALERMO Vincenzo Dr. CAMPIDELLI Stéphane Dr.
BAATI Rachid UNIVERSITÉ DE STRASBOURG ÉCOLE DOCTORALE DES SCIENCES CHIMIQUES UPR 3572 THÈSE présentée par : Ngoc Do Quyen CHAU soutenue le : 24 Novembre 2017 pour obtenir le grade de : Docteur de l’université de Strasbourg Discipline/ Spécialité : Chimie L’oxyde de graphène peut-il devenir une plateforme appropriée pour la complexation d'acides nucléiques ? THÈSE dirigée par : M. BIANCO Alberto Directeur de recherche, CNRS RAPPORTEURS : M. PALERMO Vincenzo Senior Researcher, CNR, Italie M. CAMPIDELLI Stéphane Chercheur, CEA AUTRES MEMBRES DU JURY : M.
BAATI Rachid Directeur de recherche, CNRS INDEX Index. 6 Acronyms and Abbreviations. 9 RESUME DE THESE .2 Promise, facts and challenges of graphene oxide in biomedical applications .1 Non-covalent and covalent approaches .1 Non-covalent interactions and their driving forces .2 Graphene oxide based therapy.1 Drug and gene delivery .2 Photothermal therapy and photodynamic therapy .3 Biocompatibility and toxicity .3 Graphene oxide and nucleic acids interactions .1 Graphene oxide bio-interfacing with nucleic acids and biological effects of the graphene/nucleic acid complexes .2 Bioapplication in gene delivery .4 Future perspective of graphene oxide in cancer therapy .5 Thesis objectives and outline. 76 ELUCIDATION OF siRNA COMPLEXATION EFFICIENCY BY GRAPHENE OXIDE AND REDUCED GRAPHENE OXIDE.
106 Results and discussions. 133 4 5 ABSTRACT Doctoral Thesis By Ngoc Do Quyen CHAU In the last decades, graphene oxide (GO) has been predicted as a wonderful nanomaterial in myriad applications for its unique and outstanding properties. Intensive research is ongoing to scrutinize its potential role as a prominent vector in gene delivery, especially in gene silencing. The main aim of my Thesis is to design a graphene-based hybrid material as a non-viral vector for delivery of small interfering RNA (siRNA).
Hence, control of the oxygenated groups on the surface of GO can lead to different behavior in term functionalization ability and interaction with biomolecules. In this context, one of the first approach has been to develop various green and facile reduction and reepoxidation methods to obtain GO with different levels of oxygenated moieties. In the next step, the introduction of different amines and polymers on these prepared graphene materials via the epoxy ring opening reaction allowed to obtain a novel platform for better complexation with siRNA. I have figured out that the driving forces of the ability of complexing with siRNA are dependent on the functional groups conjugated to GO, either due to electrostatic interaction or to hydrogen bond interaction.
on the other hand, several works demonstrated the ability of GO to efficiently adsorb siRNA on its surface and to transport it into the cells. However, studies whether and how siRNA interacts with GO are still inconclusive. For this reason, the interactions between GO and siRNA molecules have been then systematically investigated. I have found that the siRNA secondary structure is clearly altered by the interaction with GO flakes.
Interestingly, GO functionalized with low molecular weight polyethyleneimine is able to protect siRNA from structural modifications and to improve the complexing with siRNA. Various techniques have been explored to characterize GO with various oxygen percentages, conjugation of cationic molecules with graphene materials, and the interaction of GO with siRNA. Besides, the preliminary biological tests proved the efficiency of our graphene derivatives as a vehicle for delivery of siRNA into the cells. I believed that this research effort will improve our understanding of the behavior of the GO/siRNA complexes, and thus facilitate the design of new appropriate and efficient gene silencing systems.
Acronyms and abbreviations ACRONYMS AND ABBREVIATIONS 5-FU 5- fluorouracil 6-FAM 6-carboxyfluorescein A549 cells human lung carcinoma cells AA siRNA with one strand labeled at 5’ position with Alexa Fluor(donor) and another strand labeled at 5’ position with Alexa Fluor647 (acceptor) ADR Adriamycin AFM atomic force microscopy Boc2O di-tert-butyl dicarbonate BPEI branched PEI CC siRNA with one strand labeled at 5’ position with Cy(donor) and another strand labeled at 3’ position with Cy5 (acceptor) CD circular dichroism Ce6 chlorin e6 CMG magnetic rGO CNTs carbon nanotubes 9 Acronyms and abbreviations CS chitosan D1 dendron first generation D2 dendron second generation DAPI fluorescent stain, 4',6-Diamidino-2-phenylindole DCM dichloromethane DIEA N,N-Diisopropylethylamine DLS dynamic light scattering DMA/c N, N-dimethylacetamide DMDO dimethyldioxirane DMF N,N-Dimethylformamide DMSO Dimethyl sulfoxide DNA deoxyribonucleic acid DOX doxorubicin dsDNA double strand DNA dsRNA double strand RNA E FRET efficiency EDC 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide FA folic acid 10 Acronyms and abbreviations FAM fluorescein-based dye FRET fluorescence resonance energy transfer FT-IR Fourier-transform infrared spectroscopy GFP green fluorescent protein GIC Graphite intercalated compound GO Graphene oxide GOL large GO, commercial, size distribution 3±1 m GOM medium GO, academic, size distribution 600±300 nm GOS small GO, academic, size distribution 300±200 nm HA hyaluronic acid H-bonding hydrogen bonding HMW-PEI high molecular weight PEI HOBt 1-hydroxybenzotriazole hydrate LMW low molecular weight MAS magic angle spinning mCPBA m-chloroperbenzoic acid MD molecular dynamic MMP-9 matrix metallopeptidase-9 11 Acronyms and abbreviations MRI magnetic resonance imaging mRNA messenger RNA MUA 11-mercaptoundecanoic acid MWCNTs multi-walled carbon nanotubes NA nucleic acids NHS N-hydroxylsuccinimide NIR near-infrared NMP N-Methyl-2-pyrrolidone PAMAM polyamidoamne dendrimer pDNA plasmid DNA PDT photodynamic therapy PEG Polyethylene glycol PEI polyethylenimine PLL-rGO poly(L-lysine) conjugates with reduced GO PNP 4-(1-pyrenylvinyl)-N-butylpyridinium PPG PEI conjugated on GO-PEG PPG-FA Folic acid conjugated with PPG PS photosensitizers 12 Acronyms and abbreviations PTT photothermal therapy Q quaternary amine QD quantum dots R FRET distance RGD arginine–glycine–aspartic acid rGO reduced graphene oxide RISC RNA induced silencing complex RNA ribonucleic acid RNAi RNA interference ROS reactive oxygen species SEM scanning electron microscopy shRNA short hairpin RNA siRNA small interfering RNA SPIONs Superparamagnetic Fe3O4 nanoparticles ssDNA single strand DNA ssNMR solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy ssRNA single strand RNA SWCNTs single-walled carbon nanotubes 13 Acronyms and abbreviations T1 spin-lattice (longitudinal) relaxation time T2 spin–spin (transversal) relaxation time TEG 2,2’-ethylenedioxybisethylamine TEM transmission electron microscopy TFA trifluoroacetic acid TGA thermogravimetric analysis UV-Vis ultraviolet–visible spectroscopy XPS X-ray photoelectron spectroscopy XRD X-ray diffraction YY Yakima yellow dye potential zeta potential 14 Acronyms and abbreviations 15 Résumé de Thèse RESUME DE THESE 1) Introduction Depuis son isolement en 2004, le graphène est apparu comme un nanomatériau fascinant avec des propriétés physiques uniques.1 Des recherches intensives sont en cours pour étudier les applications potentielles du graphène et de son dérivé, l'oxyde de graphène (GO), dans de nombreux domaines, y compris la biomédecine et la nanomédecine.2–7 Néanmoins, la faible dispersabilité du graphène dans des solutions aqueuses gêne l'exploitation complète de ses propriétés. Pour surmonter ce problème, une chimie de fonctionnalisation rationnelle est nécessaire afin d'améliorer la processabilité et transmettre au graphène de nouvelles propriétés. Dans ce contexte, le GO est une plateforme utile pour la conception de matériaux hybrides à base de graphène (Figure 1).8 Le GO est composé d'une seule couche d'oxyde de graphène et il est habituellement produit par oxydation du graphite à l'aide de solutions d'acides forts.9,10 Les groupes fonctionnels contenant de l'oxygène (i. hydroxyles, époxydes, carboxylates, cétones, etc.) le rendent hautement hydrophile, entraînant une bonne dispersion dans l'eau et de nombreux autres solvants.
En outre, la dérivatisation de ces fonctions oxygénées est une méthode polyvalente et efficace pour fonctionnaliser chimiquement le graphène pour une large gamme d'applications.9 16 Résumé de Thèse Figure 1 : Modèle structurel du GO. La thérapie génique a suscité un intérêt considérable en tant que méthode prometteuse pour le traitement de dysfonctions liés aux gènes et d'autres maladies comme le cancer.11,12 À ce jour, parmi de nombreux types de nanomatériaux, ceux à base de carbone, notamment le graphène et ses dérivés, ont été largement développés, permettant leur exploitation en biomédecine, en particulier pour l'administration de gènes, grâce à leurs propriétés intrinsèques uniques. En effet, en raison de sa grande surface, sa haute biocompatibilité, sa chimie de surface ajustable, et sa dispersabilité élevée dans l'eau, le GO est un candidat potentiel vis-à-vis d'autres nano-vecteurs en termes d'interaction avec des biomolécules telles que l'ADN, les peptides ou les protéines.13,14 17 Résumé de Thèse 2) Objectifs de la Thèse L'objectif principal de ma thèse était de fonctionnaliser de manière covalente le GO avec des amines. Cette approche m’a permis de développer une nouvelle plateforme complexant des molécules biologiquement actives pour la délivrance de gènes, en particulier pour l’inhibition de gènes spécifiques à l'aide de petits ARN interférents (siRNA) (Figure 2).
Figure 2 : Fonctionnalisation covalente du GO avec des groupes ammonium et complexation du GO fonctionnalisé avec du siRNA. En particulier, nous nous sommes concentrés d'abord sur la conception, la synthèse et l'étude d’échantillons de GO avec différents degrés d'oxydation en utilisant des protocoles divers. Afin d'augmenter la quantité de groupes ammonium qui conduisent à une meilleure complexation du siRNA, une ré-époxydation du GO, ayant subi une réduction préalable, a été réalisée suivie d'une ouverture du cycle époxy avec des dérivés aminés. Ensuite, une série d'amines a été synthétisée pour la fonctionnalisation covalente du GO.
Enfin, la capacité de chaque GO fonctionnalisé et non- fonctionnalisé à interagir avec le siRNA a été étudiée par différentes techniques comme la spectroscopie UV-Vis, le gel d’électrophorèse, le dichroïsme circulaire et le transfert d'énergie par résonance de type Förster (FRET). Grâce à ces nouvelles 18 Résumé de Thèse méthodes et à la caractérisation précise de la surface, nous avons pu mieux comprendre l'interaction du siRNA avec le GO initial et fonctionnalisé. Finalement, les expériences biologiques ont été effectuées pour évaluer la capacité du GO comme plate-forme pour la délivrance de siRNA dans les cellules. Dans les paragraphes suivants, les résultats sont présentés en détail.
19 Résumé de Thèse 3) Résultats et discussion 3.1 Synthèse des GO réduits avec des pourcentages d’oxygène divers Des propriétés très prometteuses et potentiellement applicables du GO lui permettent d’être exploré dans une grande variété de domaines. Il est bien connu que le GO a plusieurs groupements oxygénés chimiquement réactifs à sa surface, qui permettent de contrôler sa fonctionnalisation.15 Le comportement de ces fonctions oxygénées vis-à- vis de l’interaction du GO avec des acides nucléiques n’a pas encore été étudié de manière systématique. Par conséquent, dans mon étude, la première étape a consisté à obtenir des GO avec un pourcentage d’oxygène variable selon l’utilisation de différents procédés de réduction faciles et « verts ». Nous avons initialement testé et adapté différentes conditions de réduction sur mes échantillons d’oxyde de graphène en utilisant deux GO avec des tailles différentes: l’un provenant d’une source commerciale de petite taille, nommé GOS et l’autre d’une source académique de grande taille, nommé GOL (Figure 3).
20 Résumé de Thèse Figure 3 : a) Distribution de la taille latérale du GOS. Dans l’encart: image MET (microscopie électronique à transmission) du GOS, la barre d’échelle correspond à 500 nm. B) Distribution de la taille latérale du GOL. Dans l’encart: image MEB (microscopie éléctronique à balayage) de GOL, la barre d’échelle correspond à 5 m.
Diverses conditions et plusieurs agents réducteurs ont été évalués tels que la désoxygénation hydrothermique et solvothermique (conditions douces dans l’eau et le DMSO, respectivement), l’utilisation des micro-ondes (conditions plus fortes), et la vitamine C qui a été employée comme alternative verte à l’hydrazine. Le but de la réduction du GO était d’éliminer une fraction des groupes oxygénés (qui peuvent entraver la complexation des siRNA), tout en conservant les cycles époxydes afin de permettre l’introduction de charges positives par l’ouverture des époxydes avec différents dérivés d’amines. En outre, j'ai exploré la ré-époxydation du GO réduit en utilisant l’ozone. La réduction et la re-époxydation ont été réalisées d’abord sur le GO commercial avant de traiter le GO d’origine académique dans des conditions 21 Résumé de Thèse appropriées.
Ces nanomatériaux ont été caractérisés par des techniques analytiques complémentaires telles que la spectroscopie photoélectronique par rayons X (XPS) (Figure 4), l’analyse thermogravimétrique (ATG), la spectroscopie FT-IR, et la spectroscopie RMN du solide.
