Nghiên cứu khả năng kháng vi khuẩn gram âm của chế phẩm chitosan nano bạc

Luận văn thạc sĩ phân tích nghiên cứu khả năng kháng vi khuẩn gram âm của chế phẩm phối hợp chitosan nano bạc, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề xuất giải pháp khả thi cho

• Tác giả: Trương Đức Hạnh
• Người hướng dẫn: Ths. Lương Hùng Tiến
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Khả Năng Kháng Vi Khuẩn Gram Âm Của Chế Phẩm Phối Hợp Chitosan – Nano Bạc
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục đích và yêu cầu của đề tài
• 1.2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
• 1.2.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.2.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Tổng quan về nano bạc
• 2.1.1. Giới thiệu về bạc kim loại
• 2.1.2. Giới thiệu về hạt nano bạc
• 2.1.3. Phương pháp phân tích hạt nano bạc
• 2.1.4. Đặc tính kháng khuẩn của nano bạc
• 2.1.5. Cơ chế kháng khuẩn của nano bạc
• 2.1.6. Ứng dụng nano bạc trong cuộc sống
• 2.2. Tổng quan về Chitosan
• 2.2.1. Nguồn gốc Chitin và Chitosan
• 2.2.2. Cấu trúc hóa học của Chitosan
• 2.2.3. Tính chất của Chitosan
• 2.2.3.1. Tính chất vật lý
• 2.2.4. Tính chất hóa học
• 2.2.5. Tính chất sinh học và độc tính của Chitosan
• 2.2.6. Đặc tính kháng khuẩn và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động kháng khuẩn của Chitosan
• 2.2.6.1. Đặc tính kháng khuẩn
• 2.2.6.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng kháng khuẩn của Chitosan
• 2.2.7. Ứng dụng của Chitosan
• 2.2.7.1. Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm
• 2.2.7.2. Ứng dụng trong y học
• 2.2.7.3. Ứng dụng trong mỹ phẩm
• 2.2.7.4. Ứng dụng trong môi trường
• 2.3. Tổng quan về vi khuẩn Gram âm
• 2.3.1. Vi khuẩn Escherichia coli
• 2.3.1.1. Đặc điểm hình thái
• 2.3.1.2. Độc tố của E. coli
• 2.3.1.3. Sức đề kháng
• 2.3.1.4. Khả năng gây bệnh của E. coli
• 2.3.2. Đặc điểm của vi khuẩn
• 2.3.2.1. Đặc điểm nuôi cấy
• 2.3.2.2. Đặc điểm hóa sinh
• 2.3.2.3. Cơ chế gây bệnh
• 2.3.3. Các chất có khả năng kháng vi khuẩn Gram âm
• 2.3.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
• 2.3.4.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
• 2.3.4.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
• 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Vật liệu nghiên cứu
• 3.1.1. Chủng vi sinh vật thí nghiệm
• 3.1.2. Môi trường nuôi cấy
• 3.1.3. Dụng cụ, thiết bị
• 3.1.4. Địa điểm, thời gian nghiên cứu
• 3.2. Nội dung nghiên cứu
• 3.3. Phương pháp nghiên cứu
• 3.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm
• 3.3.2. Phương pháp phân tích
• 3.3.3. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn
• 3.3.4. Phương pháp quan sát hình thái tế bào và xác định mật độ tế bào
• 3.3.5. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật
• 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu của nano bạc đối với vi khuẩn Gram âm
• 4.2. Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu của Chitosan đối với vi khuẩn Gram âm
• 4.3. Lựa chọn công thức phối trộn Chitosan với nano bạc kháng lại vi khuẩn Gram âm
• 4.3.1. Lựa chọn công thức phối trộn Chitosan với nano bạc kháng lại vi khuẩn E. coli
• 4.3.2. Lựa chọn công thức phối trộn Chitosan với nano bạc kháng lại vi khuẩn S. Typhimurium
• 4.4. Khả năng kháng vi khuẩn Gram âm của chế phẩm phối hợp Chitosan – nano bạc theo thời gian
• 4.4.1. Khả năng kháng vi khuẩn E. coli của chế phẩm phối hợp Chitosan – nano bạc theo thời gian
• 4.4.2. Khả năng kháng vi khuẩn S. Typhimurium của chế phẩm phối hợp Chitosan – nano bạc theo thời gian
• 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về khả năng kháng vi khuẩn gram âm

Khả năng kháng vi khuẩn gram âm của chế phẩm phối hợp Chitosan – nano bạc đã thu hút sự chú ý của nhiều nhà nghiên cứu. Vi khuẩn gram âm là nhóm vi khuẩn có cấu trúc màng tế bào phức tạp, khiến chúng kháng lại nhiều loại kháng sinh thông thường. Chitosan là một polysaccharide tự nhiên có khả năng kháng khuẩn, trong khi nano bạc được biết đến với tính năng kháng khuẩn mạnh mẽ. Sự kết hợp giữa hai thành phần này tạo ra một chế phẩm có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gram âm hiệu quả. Nghiên cứu cho thấy rằng nano bạc có thể tương tác với màng tế bào của vi khuẩn, làm giảm tính thấm và gây ra sự chết tế bào. Điều này mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các sản phẩm kháng khuẩn an toàn và hiệu quả cho ngành thực phẩm và y tế.

1.1. Tính chất kháng khuẩn của Chitosan

Chitosan có khả năng kháng khuẩn nhờ vào cấu trúc hóa học của nó. Các ion dương trong Chitosan có thể tương tác với các ion âm trên bề mặt vi khuẩn, làm thay đổi tính thấm của màng tế bào. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng Chitosan có thể ức chế sự phát triển của nhiều loại vi khuẩn gram âm như Escherichia coli và Salmonella Typhimurium. Đặc biệt, Chitosan không chỉ có tác dụng kháng khuẩn mà còn có khả năng kháng nấm, làm cho nó trở thành một lựa chọn lý tưởng trong việc bảo quản thực phẩm. Việc sử dụng Chitosan trong các sản phẩm thực phẩm không chỉ giúp kéo dài thời gian bảo quản mà còn đảm bảo an toàn cho sức khỏe người tiêu dùng.

II. Đặc tính kháng khuẩn của nano bạc

Nano bạc đã được chứng minh là có khả năng kháng khuẩn vượt trội nhờ vào diện tích bề mặt lớn và khả năng giải phóng ion bạc. Các ion Ag+ từ nano bạc có khả năng liên kết với thành tế bào của vi khuẩn gram âm, gây ra sự ức chế quá trình hô hấp và làm tổn thương DNA của vi khuẩn. Điều này dẫn đến sự chết tế bào và ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn. Nghiên cứu cho thấy rằng nano bạc có thể tiêu diệt đến 99% vi khuẩn trong một số ứng dụng thực tế. Sự kết hợp giữa nano bạc và Chitosan không chỉ tăng cường khả năng kháng khuẩn mà còn tạo ra một sản phẩm an toàn cho sức khỏe con người. Việc ứng dụng nano bạc trong các sản phẩm như khẩu trang, đồ dùng y tế và thực phẩm đang ngày càng trở nên phổ biến.

2.1. Cơ chế tác động của nano bạc

Cơ chế tác động của nano bạc lên vi khuẩn gram âm rất phức tạp. Các ion bạc có khả năng xâm nhập vào tế bào vi khuẩn, nơi chúng tương tác với các enzyme và DNA, gây ra sự ức chế chức năng sinh lý của vi khuẩn. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng nano bạc có thể làm giảm khả năng sinh sản của vi khuẩn, từ đó ngăn chặn sự lây lan của các bệnh nhiễm trùng. Hơn nữa, nano bạc không gây độc cho tế bào động vật, điều này làm cho nó trở thành một lựa chọn an toàn cho các ứng dụng trong y học và thực phẩm. Sự kết hợp giữa nano bạc và Chitosan không chỉ nâng cao hiệu quả kháng khuẩn mà còn mở ra nhiều cơ hội mới trong nghiên cứu và phát triển sản phẩm.

III. Ứng dụng thực tiễn của chế phẩm Chitosan nano bạc

Chế phẩm phối hợp Chitosan và nano bạc đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là trong công nghệ thực phẩm và y học. Trong ngành thực phẩm, chế phẩm này giúp bảo quản thực phẩm lâu hơn, ngăn ngừa sự phát triển của vi khuẩn gram âm gây hại. Nghiên cứu cho thấy rằng việc sử dụng Chitosan và nano bạc trong bao bì thực phẩm có thể kéo dài thời gian bảo quản mà không làm ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm. Trong y học, chế phẩm này được sử dụng để phát triển các sản phẩm kháng khuẩn cho vết thương, giúp ngăn ngừa nhiễm trùng. Sự kết hợp này không chỉ mang lại hiệu quả cao mà còn đảm bảo an toàn cho người sử dụng, mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các sản phẩm y tế và thực phẩm an toàn.

3.1. Tương lai của nghiên cứu Chitosan nano bạc

Nghiên cứu về khả năng kháng vi khuẩn của chế phẩm Chitosan – nano bạc đang được tiếp tục mở rộng. Các nhà khoa học đang tìm kiếm các phương pháp tối ưu hóa quy trình sản xuất và ứng dụng của chế phẩm này. Việc phát triển các sản phẩm mới từ Chitosan và nano bạc có thể giúp giải quyết vấn đề kháng thuốc hiện nay, đồng thời cung cấp các giải pháp an toàn cho sức khỏe con người. Hướng nghiên cứu này không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn mang lại giá trị thực tiễn cao, góp phần vào sự phát triển bền vững của ngành công nghiệp thực phẩm và y tế.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong bảo quản thực phẩm, việc lạm dụng hóa chất tổng hợp tiềm ẩn nhiều nguy cơ đối với sức khỏe người tiêu dùng, đặt ra yêu cầu cấp thiết về việc nghiên cứu và ứng dụng các vật liệu sinh học, vật liệu nano có nguồn gốc tự nhiên, an toàn và có hoạt tính kháng vi sinh vật cao. Bạc kim loại đã được ghi nhận về đặc tính kháng khuẩn tự nhiên trong lịch sử y tế hơn 100 năm. Khi được chế tạo ở kích thước nano (1–100 nm), bạc gia tăng đột biến diện tích bề mặt tiếp xúc, giải phóng lượng lớn ion $\text{Ag}^+$ giúp nâng cao hiệu quả ức chế tế bào vi sinh vật mà không gây phản ứng phụ hay độc tính ở nồng độ diệt khuẩn thông thường (< 100 ppm). Bên cạnh đó, chitosan – một polysaccharide mạch thẳng sinh học thu nhận từ quá trình deacetyl hóa chitin có trong vỏ động vật giáp xác – sở hữu khả năng tự phân hủy sinh học, độ tương thích sinh học cao và mang điện tích dương tự nhiên, giúp biến đổi tính thấm màng tế bào của vi khuẩn.

Vi khuẩn Gram âm, đặc biệt là Escherichia coli và Salmonella Typhimurium, là hai tác nhân phổ biến gây hư hỏng thực phẩm, nhiễm độc đường tiêu hóa và nhiễm trùng huyết nguy hiểm ở người và động vật. Việc phối hợp giữa chitosan và nano bạc nhằm tạo ra một hệ chế phẩm phức hợp ổn định, phát huy đồng thời cơ chế tương tác tĩnh điện và giải phóng ion diệt khuẩn, là cơ sở khoa học quan trọng phục vụ công nghệ bảo quản thực phẩm và công nghệ sinh học.

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu:

1. Mục tiêu tổng quát: Xác định khả năng kháng vi khuẩn Gram âm của chế phẩm phối hợp Chitosan – nano bạc.
2. Nhiệm vụ cụ thể:
   • Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của nano bạc đơn lẻ đối với hai chủng vi khuẩn Gram âm (E. coli và S. Typhimurium).
   • Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chitosan đơn lẻ đối với hai chủng vi khuẩn Gram âm nghiên cứu.
   • Khảo sát các công thức phối hợp giữa chitosan và nano bạc ở các nồng độ dựa trên giá trị MIC để tìm ra công thức tối ưu nhằm ức chế vi khuẩn Gram âm.
   • Theo dõi động thái kháng vi khuẩn Gram âm của chế phẩm phối hợp tối ưu theo thời gian tiếp xúc (từ 0 đến 24 giờ).

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Hoạt tính kháng khuẩn của hạt nano bạc (nồng độ gốc 100 ppm), chế phẩm chitosan, và chế phẩm phối hợp Chitosan – nano bạc đối với hai chủng vi sinh vật kiểm định là Escherichia coli ATCC 25922™ và Salmonella enterica subsp enterica serovar Typhimurium ATCC® 14028™.
• Phạm vi không gian: Phòng thí nghiệm Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học – Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm – Đại học Thái Nguyên.
• Phạm vi thời gian: Từ tháng 12/2013 đến tháng 05/2014.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận dựa trên nền tảng lý thuyết về hóa học polymer sinh học, vật liệu nano vô cơ và vi sinh vật học ứng dụng:

• Hạt nano bạc (Silver nanoparticles): Hạt có kích thước từ 1–100 nm, diện tích bề mặt riêng lớn, thể hiện hiệu ứng cộng hưởng plasmon bề mặt đặc trưng (tạo phổ hấp thụ cực đại đơn đỉnh trên phổ UV-VIS khi kích thước hạt < 20 nm). Cơ chế kháng khuẩn chủ yếu do giải phóng ion $\text{Ag}^+$; các ion này liên kết mạnh với peptidoglycan ở thành tế bào, tương tác với nhóm hydrosunfua (–SH) của enzyme chuyển hóa oxy làm tê liệt quá trình hô hấp tế bào, đồng thời liên kết với các base nitơ của DNA và trung hòa gốc phosphate nhằm ngăn chặn sự sao chép vật chất di truyền.
• Chitosan: Dẫn xuất deacetyl hóa từ chitin $(\text{C}6\text{H}{11}\text{O}_4\text{N})_n$, có mắt xích liên kết $\beta\text{-(1-4)-D-glucosamine}$. Ở môi trường pH acid loãng (đệm acetate), nhóm amin $(-\text{NH}_2)$ bị proton hóa thành $-\text{NH}_3^+$, tạo điện tích dương liên kết tĩnh điện với màng tế bào vi khuẩn tích điện âm, làm giải phóng các cation, phá vỡ cấu trúc lipopolysaccharide (LPS) ở màng ngoài của vi khuẩn Gram âm và làm rò rỉ các thành phần nội bào (ATP, ion $\text{K}^+$). Ngoài ra, chitosan có khả năng tạo phức chelate với ion kim loại chuyển tiếp nhờ các cặp electron tự do trên nguyên tử oxy và nitơ.
• Hai chủng vi khuẩn Gram âm đích: Escherichia coli (trực khuẩn Gram âm, ưa nhiệt, kỵ khí tùy nghi, kích thước 2–3 $\mu\text{m} \times 5\ \mu\text{m}$, sinh nội độc tố enterotoxin) và Salmonella Typhimurium (trực khuẩn Gram âm, kích thước 0,4–0,6 $\mu\text{m} \times 1\text{--}3\ \mu\text{m}$, có 7–12 lông mao, sinh $\text{H}_2\text{S}$, gây bệnh thương hàn và viêm ruột).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm:

• Nguồn vật liệu: Chitosan do Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội cung cấp; dung dịch nano bạc nồng độ 100 ppm do Viện Nghiên cứu tiên tiến về Công nghệ Vật liệu cung cấp.
• Môi trường nuôi cấy: Môi trường MP lỏng (Cao thịt 3 g, Pepton 10 g, NaCl 5 g, nước cất vừa đủ 1000 ml, hấp khử trùng ở 121°C trong 15–20 phút) và môi trường MP rắn (thêm 20 g Agar).
• Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC): Thử nghiệm vi sinh với mật độ vi khuẩn chuẩn $10^5\text{ CFU/ml}$. Nano bạc được pha loãng bậc 2 trong dung dịch khử ion (DI) tạo dải nồng độ từ 25 ppm đến 0,390625 ppm (đối chứng là nước DI). Chitosan được hòa tan trong đệm acetate tạo dải nồng độ hỗn hợp sau phối trộn từ 4000 ppm đến 250 ppm (đối chứng là đệm acetate). Đánh giá sự phát triển của khuẩn lạc sau 24 giờ nuôi cấy ở 37°C bằng phương pháp nhỏ giọt lên đĩa thạch MP.
• Phương pháp thử nghiệm phối hợp: Bố trí 4 công thức phối trộn giữa Chitosan và nano bạc theo tổ hợp các nồng độ $\text{MIC}$ và $\text{MIC}/2$ gồm: $\text{CT1}\ (\text{MIC}/2 + \text{MIC}/2)$, $\text{CT2}\ (\text{MIC}/2 + \text{MIC})$, $\text{CT3}\ (\text{MIC} + \text{MIC}/2)$, $\text{CT4}\ (\text{MIC} + \text{MIC})$.
• Phương pháp xác định mật độ tế bào theo thời gian: Thu mẫu tại các thời điểm 0, 4, 8, 12, 16, 20, 24 giờ; pha loãng liên tiếp thập phân trong nước muối sinh lý 0,85%; cấy trang trên đĩa petri chứa thạch MP lặp lại 2 lần cho mỗi độ pha loãng; đếm số lượng khuẩn lạc (30–300 khuẩn lạc/đĩa) và tính mật độ tế bào ($N$, đơn vị $\text{CFU/ml}$) theo công thức tiêu chuẩn:

$$N = \frac{\sum C}{(n_1 + 0{,}1n_2) \cdot v \cdot f_1}$$

Trong đó: $\sum C$ là tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa chọn; $n_1, n_2$ là số đĩa ở độ pha loãng thứ nhất và thứ hai; $v$ là thể tích dịch cấy trên mỗi đĩa (ml); $f_1$ là hệ số pha loãng thứ nhất.

---

Nội dung chính theo từng chương

Phần 1: Mở đầu

Trình bày tính cấp thiết của đề tài xuất phát từ nhu cầu thực tiễn về an toàn vệ sinh thực phẩm, xu hướng thay thế các chất bảo quản hóa học bằng vật liệu có hoạt tính sinh học an toàn. Tổng hợp mục đích, yêu cầu, ý nghĩa khoa học (rèn luyện kỹ năng thực nghiệm, kiểm chứng lý thuyết) và ý nghĩa thực tiễn (tiền đề tạo chế phẩm sinh học ứng dụng trong bảo quản nông sản, thực phẩm) của đề tài.

Phần 2: Tổng quan tài liệu

Hệ thống hóa toàn diện các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến 4 mảng kiến thức chính:

• Tổng quan về nano bạc: Cấu tạo nguyên tử, kích thước hạt (1–100 nm), hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt xác định qua phổ UV-VIS, cơ chế tương tác với enzyme hô hấp chứa nhóm –SH và DNA của vi khuẩn, các ứng dụng thực tế trong dụng cụ chứa thực phẩm, vải kháng khuẩn, màng lọc, sơn phủ.
• Tổng quan về Chitosan: Lịch sử phát hiện từ chitin (Braconnot năm 1811, Karrer năm 1929), cấu trúc hóa học poly $\beta\text{-(1-4)-D-glucosamine}$, mức độ deacetyl hóa (DDA), các tính chất lý học (độ nhớt, độ tan trong acid loãng, khả năng tạo màng), hóa học (tạo phức kim loại, phản ứng màu), tính an toàn sinh học (thử nghiệm $\text{LD}_{50}$ trên chuột nhắt không gây độc ở liều 9 g/kg thể trọng) và cơ chế kháng khuẩn phụ thuộc điện tích màng.
• Tổng quan về vi khuẩn Gram âm: Lịch sử phân lập, đặc điểm hình thái, sinh hóa, độc tố (nội độc tố LPS, ngoại độc tố), khả năng đề kháng và cơ chế gây bệnh đường ruột của E. coli và S. Typhimurium.
• Tình hình nghiên cứu Chitosan phối hợp nano bạc: Điểm lại các nghiên cứu màng bao bọc thực phẩm, bảo quản quả tươi (chế phẩm BQ-1 của Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên), bảo quản cá ngừ (Đại học Cần Thơ), thịt bò tươi (Đại học Thủy sản Nha Trang) và các công bố quốc tế về phức hợp Chitosan/Ag-NPs.

Phần 3: Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết danh mục trang thiết bị (nồi hấp thanh trùng, tủ cấy vô trùng, kính hiển vi, máy đo pH, cân điện tử), nguyên vật liệu, chủng vi sinh vật đạt chuẩn quốc tế ATCC. Mô tả quy trình thực nghiệm chuẩn hóa từng bước cho 4 nội dung nghiên cứu: quy trình thử nghiệm dải nồng độ MIC của từng chất, thiết kế ma trận phối trộn 4 công thức đối kháng, quy trình nhuộm soi Gram kiểm tra hình thái tế bào và phương pháp xác định mật độ tế bào sống sót qua thời gian bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc.

Phần 4: Kết quả và thảo luận

Phân tích chi tiết số liệu thực nghiệm thu được từ các đĩa thạch và đồ thị sinh trưởng:

• Phân tích ngưỡng ức chế của nano bạc: Nồng độ từ 25 ppm đến 6,25 ppm ức chế hoàn toàn E. coli; nồng độ từ 25 ppm đến 3,125 ppm ức chế hoàn toàn S. Typhimurium.
• Phân tích ngưỡng ức chế của Chitosan: Dải nồng độ từ 4000 ppm đến 500 ppm ức chế hoàn toàn cả hai loại vi khuẩn; nồng độ 250 ppm không còn khả năng ức chế.
• Đánh giá hiệu quả của các công thức phối hợp: Xác định vai trò quyết định của nồng độ nano bạc trong phức hợp Chitosan – nano bạc. Giải thích bản chất tạo phức polymer–ion kim loại làm suy giảm nồng độ chitosan tự do.
• Động thái diệt khuẩn theo thời gian: Phân tích tốc độ giảm logarit của mật độ tế bào vi khuẩn trong 4 giờ đầu và thời điểm tiêu diệt hoàn toàn vi khuẩn sau 16–20 giờ tiếp xúc.

---

Kết quả và đóng góp

1. Kết quả thực nghiệm chính

Khóa luận đã xác định được các chỉ số nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của từng thành phần đơn lẻ và hiệu quả của các công thức phối hợp đối với hai chủng vi khuẩn Gram âm:

Đối tượng thử nghiệm	MIC của Nano Bạc (ppm)	MIC của Chitosan (ppm)	Công thức phối hợp tối ưu (Chitosan / Nano bạc)
Escherichia coli ATCC 25922	6,25	500	250 ppm Chitosan + 6,25 ppm Nano bạc
Salmonella Typhimurium ATCC 14028	3,125	500	250 ppm Chitosan + 3,125 ppm Nano bạc

Chi tiết hiệu quả kháng khuẩn của các công thức phối hợp thử nghiệm:

• Đối với Escherichia coli:
  • $\text{CT1}$ (Chitosan 250 ppm / Nano bạc 3,125 ppm): Vi khuẩn vẫn mọc (+).
  • $\text{CT2}$ (Chitosan 250 ppm / Nano bạc 6,25 ppm): Ức chế hoàn toàn vi khuẩn (-).
  • $\text{CT3}$ (Chitosan 500 ppm / Nano bạc 3,125 ppm): Vi khuẩn vẫn mọc (+).
  • $\text{CT4}$ (Chitosan 500 ppm / Nano bạc 6,25 ppm): Ức chế hoàn toàn vi khuẩn (-).
• Đối với Salmonella Typhimurium:
  • $\text{CT1}$ (Chitosan 250 ppm / Nano bạc 1,5625 ppm): Vi khuẩn vẫn mọc (+).
  • $\text{CT2}$ (Chitosan 250 ppm / Nano bạc 3,125 ppm): Ức chế hoàn toàn vi khuẩn (-).
  • $\text{CT3}$ (Chitosan 500 ppm / Nano bạc 1,5625 ppm): Vi khuẩn vẫn mọc (+).
  • $\text{CT4}$ (Chitosan 500 ppm / Nano bạc 3,125 ppm): Ức chế hoàn toàn vi khuẩn (-).

Động học ức chế vi khuẩn E. coli theo thời gian: Khi xử lý bằng chế phẩm phối hợp Chitosan 250 ppm + Nano bạc 6,25 ppm:

• Tại thời điểm 0 giờ: Mật độ vi khuẩn ban đầu đạt $7{,}15\ \log(\text{CFU/ml})$.
• Sau 4 giờ tiếp xúc: Mật độ giảm mạnh xuống còn $3{,}62\ \log(\text{CFU/ml})$ (giảm hơn $3{,}5\ \log$).
• Sau 16 giờ: Chế phẩm gần như ức chế hoàn toàn sự phát triển.
• Từ 20 giờ đến 24 giờ: Vi khuẩn bị tiêu diệt triệt để, không còn phát hiện khuẩn lạc sống sót trên môi trường nuôi cấy ($0\ \text{CFU/ml}$), trong khi ở mẫu đối chứng đệm acetate vi khuẩn vẫn tăng trưởng liên tục.

2. Phát hiện và đóng góp khoa học

• Cơ chế tương tác phức hợp: Tác giả chỉ ra rằng mức độ kháng vi khuẩn Gram âm của phức hợp phụ thuộc chủ yếu vào sự thay đổi nồng độ của nano bạc thay vì nồng độ chitosan. Nguyên nhân là do các chuỗi polymer chitosan trong dung dịch tạo phức chelate giữ lại một phần ion bạc, làm giảm lượng chitosan tự do; trong khi đó, số lượng nguyên tử/ion bạc giải phóng từ các hạt nano rất lớn (hàng trăm nghìn nguyên tử/hạt) nên lượng ion bạc còn lại trong dung dịch vẫn đủ nồng độ để phá hủy màng và vô hiệu hóa vi khuẩn.
• Giá trị kinh tế và kỹ thuật: Việc kết hợp cho phép giảm 50% nồng độ chitosan cần dùng (từ 500 ppm xuống còn 250 ppm) mà vẫn đạt hiệu quả diệt khuẩn hoàn toàn nhờ duy trì nồng độ nano bạc tương đương giá trị MIC.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận được thực hiện trong khuôn khổ nghiên cứu tốt nghiệp đại học nên còn một số phạm vi giới hạn được ghi nhận:

• Thử nghiệm kháng khuẩn mới dừng lại ở quy mô in vitro trong môi trường dinh dưỡng nhân tạo (MP), chưa tiến hành thử nghiệm ứng dụng trực tiếp trên các đối tượng nền mẫu nông sản hoặc thực phẩm thực tế (thịt tươi, rau củ quả, phi lê thủy sản).
• Nghiên cứu chỉ tập trung đánh giá trên 2 chủng vi khuẩn Gram âm chuẩn (E. coli và S. Typhimurium), chưa mở rộng khảo sát trên các chủng vi khuẩn Gram dương phổ biến gây hư hỏng thực phẩm (Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes) hoặc các chủng nấm men, nấm mốc.
• Chưa khảo sát sâu sự biến đổi hình thái và cấu trúc siêu vi của màng tế bào vi khuẩn dưới kính hiển vi điện tử quét/truyền qua (SEM/TEM) sau khi tiếp xúc với chế phẩm phối hợp.

---

Giá trị tham khảo

Khóa luận là nguồn tài liệu tham khảo có giá trị chuyên môn cao đối với:

• Sinh viên, học viên chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Công nghệ Thực phẩm, Vi sinh vật học: Cung cấp quy trình thực nghiệm chi tiết về phương pháp pha loãng xác định nồng độ MIC của vật liệu nano và polymer sinh học; phương pháp đếm khuẩn lạc CFU chuẩn hóa; phương pháp thiết kế công thức phối hợp kháng khuẩn.
• Các nhóm nghiên cứu về bao bì hoạt tính và bảo quản nông sản - thực phẩm: Cung cấp thông số nồng độ định lượng chính xác (250 ppm Chitosan kết hợp 6,25 ppm Nano bạc cho E. coli; 250 ppm Chitosan kết hợp 3,125 ppm Nano bạc cho S. Typhimurium) làm căn cứ xây dựng công thức màng bao sinh học kháng khuẩn (edible coating/film).
• Phần đáng tham khảo nhất trong văn bản: Chương 3 (phương pháp bố trí thí nghiệm phối trộn và công thức tính mật độ vi sinh vật) và Chương 4 (các bảng số liệu thực nghiệm MIC, biểu đồ động thái diệt khuẩn theo thời gian).

---

Câu hỏi thường gặp

1. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của nano bạc đơn lẻ đối với vi khuẩn E. coli và S. Typhimurium là bao nhiêu?
Trả lời: Theo kết quả thực nghiệm tại Bảng 4.1 của khóa luận, nồng độ MIC của nano bạc đối với Escherichia coli là 6,25 ppm, còn đối với Salmonella Typhimurium là 3,125 ppm.

2. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chitosan đơn lẻ đối với hai chủng vi khuẩn nghiên cứu là bao nhiêu?
Trả lời: Theo kết quả tại Bảng 4.2 của khóa luận, nồng độ MIC của chitosan đối với cả hai chủng vi khuẩn E. coli và S. Typhimurium đều là 500 ppm (ở nồng độ 250 ppm vi khuẩn vẫn mọc khuẩn lạc).

3. Công thức phối hợp Chitosan – nano bạc tối ưu được lựa chọn cho từng loại vi khuẩn là gì?
Trả lời:

• Đối với E. coli: Công thức tối ưu được chọn là 250 ppm Chitosan + 6,25 ppm Nano bạc (tương ứng tỉ lệ $\text{MIC}/2$ của Chitosan và $\text{MIC}$ của Nano bạc).
• Đối với S. Typhimurium: Công thức tối ưu được chọn là 250 ppm Chitosan + 3,125 ppm Nano bạc (tương ứng tỉ lệ $\text{MIC}/2$ của Chitosan và $\text{MIC}$ của Nano bạc).

4. Tại sao trong phức hợp phối hợp, nồng độ nano bạc lại đóng vai trò chi phối hiệu quả kháng khuẩn hơn chitosan?
Trả lời: Do chitosan khi hòa tan có thể tạo phức chelate với ion bạc, làm tiêu hao một lượng chitosan tự do trong dung dịch. Trong khi đó, mỗi hạt nano bạc giải phóng lượng lớn ion $\text{Ag}^+$; dù có một phần ion liên kết tạo phức với chitosan, số lượng ion bạc tự do còn lại vẫn đủ cao để tấn công tế bào và quyết định hoạt tính kháng khuẩn của toàn hệ.

5. Động thái tiêu diệt vi khuẩn E. coli của chế phẩm phối hợp tối ưu diễn ra như thế nào theo thời gian?
Trả lời: Tại nồng độ 250 ppm Chitosan + 6,25 ppm Nano bạc, mật độ tế bào E. coli giảm mạnh từ $7{,}15\ \log(\text{CFU/ml})$ xuống còn $3{,}62\ \log(\text{CFU/ml})$ sau 4 giờ đầu; ức chế gần hoàn toàn sau 16 giờ và tiêu diệt hoàn toàn vi khuẩn ($0\ \text{CFU/ml}$) từ thời điểm 20 giờ trở đi.

---

Kết luận

Khóa luận của tác giả Trương Đức Hạnh đã xác định thành công nồng độ ức chế tối thiểu của nano bạc và chitosan đơn lẻ, đồng thời xây dựng được công thức phối hợp tối ưu kháng hai chủng vi khuẩn Gram âm nguy hiểm gồm Escherichia coli (250 ppm Chitosan + 6,25 ppm Nano bạc) và Salmonella Typhimurium (250 ppm Chitosan + 3,125 ppm Nano bạc). Nghiên cứu chứng minh chế phẩm phối hợp có khả năng tiêu diệt hoàn toàn vi khuẩn E. coli sau 20 giờ tiếp xúc nhờ tác động chi phối của các ion bạc tự do kết hợp với chuỗi polymer chitosan. Các kết quả thực nghiệm thu được cung cấp cơ sở dữ liệu định lượng tin cậy cho việc phát triển các chế phẩm và màng bao sinh học ứng dụng trong công nghệ sinh học và bảo quản an toàn thực phẩm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Xã hội ngày càng phát triển, những mối quan tâm của con người về vấn đề sức khỏe ngày càng cao thì vấn đề thực phẩm được con người rất chú trọng. Vấn đề được đặt ra đòi hỏi thực phẩm phải đảm bảo an toàn vệ sinh khi sử dụng, thay vì những hóa chất bảo quản từ đó việc tìm ra các vật liệu hay các chất bảo quản đảm bảo an toàn khi sử dụng thực phẩm là rất cần thiết. Bạc đã được sử dụng để điều trị bệnh y tế trong hơn 100 năm do thuộc tính kháng khuẩn tự nhiên của nó. Từ khi công nghệ Nano ra đời thì ứng dụng của bạc mới phát triển lên một tầm cao mới.

Sở dĩ nano bạc được nghiên cứu ứng dụng vào việc kháng khuẩn vì bạc là kháng sinh tự nhiên và không gây tác dụng phụ. Nano bạc không gây phản ứng phụ, không gây độc cho con người và vật nuôi khi nhiễm lượng nano bạc bằng nồng độ diệt khuẩn (khoảng nồng độ < 100ppm). Các hạt Nano bạc có diện tích mặt rất lớn, gia tăng tiếp xúc của chúng với vi khuẩn, và nâng cao hiệu quả diệt khuẩn. Khả năng kháng khuẩn của nano bạc là nhờ vào các ion Ag+, ion này có khả năng liên kết mạnh với peptidoglican, thành phần cấu tạo nên thành tế bào của vi khuẩn và ức chế khả năng vận chuyển oxy vào bên trong tế bào dẫn đến làm tê liệt vi khuẩn.

Nếu các ion bạc được lấy ra khỏi tế bào ngay sau đó, khả năng hoặt động của vi khuẩn lại có thể được phục hồi. Do động vật không có thành tế bào, vì vậy chúng ta không bị tổn thương khi tiếp xúc với các ion này [4]. Chitosan là một polysaccharide tuyến tính là sự kết hợp ngẫu nhiên gồm β(1- 4)-D glucosamine và N-acetyl-D glucosamine. Chitosan thương mại có nguồn gốc từ vỏ tôm và động vật giáp xác biển khác [18].

Nó có khả năng tự hòa hợp và tự phân hủy sinh học, độc tính thấp, hoạt tính sinh học cao và đa dạng như kháng khuẩn, kháng nấm. Chitosan ức chế vi khuẩn là do liên kết giữa chuỗi polymer của Chitosan với các ion trên bề mặt vi khuẩn làm thay đổi tính thấm của màng tế bào vi khuẩn [26]. Các đặc tính này đã thu hút được sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu trong thời gian gần đây. n 2 Vi khuẩn là tác nhân chính gây hư hỏng thực phẩm và độc tố của chúng ảnh hưởng đến sức khỏe của con người.

Dựa trên các đặc tính của nano bạc và Chitosan, nhóm nghiên cứu nhận thấy, hai vật liệu này có khả năng kết hợp để tạo ra một chế phẩm kháng vi sinh vật ổn định, hiệu quả cao. Chính vì vậy, nhóm nghiên cứu tiến hành đề tài “Nghiên cứu khả năng kháng vi khuẩn Gram âm của chế phẩm phối hợp Chitosan – nano bạc”. Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ là cơ sở dữ liệu cho việc nghiên cứu tạo ra một chế phẩm phối hợp kháng vi sinh vật hoàn thiện giữa Chitosan – nano bạc ứng dụng trong công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm. Mục đích và yêu cầu của đề tài 1.

Mục đích Xác định được khả năng kháng vi khuẩn Gram âm của chế phẩm phối hợp Chitosan – nano bạc. Yêu cầu - Tìm ra các điều kiện cho sự kết hợp tối ưu cho sự kháng vi khuẩn Gram âm của chế phẩm phối hợp Chitosan – nano bạc. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 1. Ý nghĩa khoa học - Giúp sinh viên có cơ hội tiếp cận với các thao tác kỹ thuật trong thực tế.

Qua đó kết hợp với các kiến thức lý thuyết đã được học sinh viên sẽ có những hiểu biết chuyên sâu và cái nhìn tổng quát hơn. Ý nghĩa thực tiễn - Chế phẩm phối hợp Chitosan – nano bạc ứng dụng trong bảo quản thực phẩm. n 3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Tổng quan về nano bạc 2.

Giới thiệu về bạc kim loại Cấu hình electron của bạc: 1s22s22p63s23p63d104s24p64d105s1 Bán kính nguyên tử Ag: 0,288 nm Bán kính ion bạc: 0,23 nm Bảng 2.1: Số nguyên tử bạc trong một đơn vị thể tích. Kích thước của hạt nano Ag (nm) Số nguyên tử chứa trong đó 1 31 5 3900 20 250000 Bạc nano là vật liệu có diện tích bề mặt riêng rất lớn, có những đặc tính độc đáo sau [6]: - Tính khử khuẩn, chống nấm, khử mùi, có khả năng phát xạ tia hồng ngoại đi xa, chống tĩnh. - Có khả năng phân tán ổn định trong các loại dung môi khác nhau (trong các dung môi phân cực như nước và trong các dung môi không phân cực như benzene, toluene). - Độ bền hóa học cao, không bị biến đổi dưới tác dụng của ánh sáng và các tác nhân oxy hóa khử thông thường.

- Chi phí cho quá trình sản xuất thấp. - Ổn định ở nhiệt độ cao. Giới thiệu về hạt nano bạc Hạt nano bạc là các hạt bạc có kích thước từ 1 nm đến 100 nm [4]. Do có diện tích bề mặt lớn nên hạt nano bạc có khả năng kháng khuẩn tốt hơn so với các vật liệu khối do khả năng giải phóng nhiều ion Ag+ hơn.

n 4 Các hạt nano bạc có hiện tượng cộng hưởng Plasmon bề mặt. Hiện tượng này tạo nên màu sắc từ vàng nhạt đến đen cho các dung dịch có chứa hạt nano bạc với các màu sắc phụ thuộc vào nồng độ và kích thước hạt nano. Phương pháp phân tích hạt nano bạc Sử dụng phương pháp phân tích phổ UV-VIS UV-VIS (Ultraviolet–visible spectroscopy) là phương pháp phân tích sử dụng phổ hấp thụ hoặc phản xạ trong phạm vi vùng cực tím cho tới vùng ánh sáng nhìn thấy được. Do các thuộc tính quang học của dung dịch chứa hạt nano phụ thuộc vào hình dạng, kích thước và nồng độ của hạt, nên ta có thể sử dụng UV-VIS để xác định các thuộc tính trên.1: Ảnh UV-VIS của các hạt nano bạc.

Do hạt nano bạc có kích thước nhỏ hơn 20 nm chỉ có một bề mặt Plasmon duy nhất nên trong phổ UV-VIS của chúng chỉ xuất hiện 1 đỉnh duy nhất. Người ta xử dụng tính chất này để xác định hình dạng của hạt nano bạc [17]. Đặc tính kháng khuẩn của nano bạc Bạc và các hợp chất của bạc thể hiện tính độc đối với vi khuẩn, virus, tảo và nấm. Tuy nhiên, khác với các kim loại nặng khác (chì, thủy ngân…) bạc không thể hiện tính độc với con người [24].

n 5 Từ xa xưa, người ta đã sử dụng đặc tính này của bạc để phòng bệnh. Người cổ đại sử dụng các bình bằng bạc để lưu trữ nước, rượu dấm. Trong thế kỷ 20, người ta thường đặt một đồng bạc trong chai sữa để kéo dài độ tươi của sữa. Bạc và các hợp chất của bạc được sử dụng rộng rãi từ đầu thế kỷ XIX đến giữa thế kỷ XX để điều trị các vết bỏng và khử trùng [6].

Sau khi thuốc kháng sinh được phát minh và đưa vào ứng dụng với hiệu quả cao người ta không còn quan tâm đến tác dụng kháng khuẩn của bạc nữa. Tuy nhiên, từ những năm gần đây, do hiện tượng các chủng vi sinh ngày càng trở nên kháng thuốc, người ta lại quan tâm trở lại đối với việc ứng dụng khả năng diệt khuẩn và các ứng dụng khác của bạc, đặc biệt là dưới dạng hạt có kích thước nano. Cơ chế kháng khuẩn của nano bạc Các đặc tính kháng khuẩn của bạc bắt nguồn từ tính chất hóa học của các ion + Ag. Ion này có khả năng liên kết mạnh với peptidoglican, thành phần cấu tạo nên thành tế bào của vi khuẩn và ức chế khả năng vận chuyển oxy vào bên trong tế bào dẫn đến làm tê liệt vi khuẩn.

Nếu các ion bạc được lấy ra khỏi tế bào ngay sau đó, khả năng hoặt động của vi khuẩn lại có thể được phục hồi. Do động vật không có thành tế bào, vì vậy chúng ta không bị tổn thương khi tiếp xúc với các ion này. Có một cơ chế tác động của các ion bạc lên vi khuẩn đáng chú ý được mô tả như sau: Sau khi Ag+ tác động lên lớp màng bảo vệ của tế bào vi khuẩn gây bệnh nó sẽ đi vào bên trong tế bào và phản ứng với nhóm hydrosunfua–SH của phân tử enzyme chuyển hóa oxy và vô hiệu hóa enzyme này dẫn đến ức chế quá trình hô hấp của tế bào vi khuẩn [24].2: Ion bạc vô hiệu hóa enzyme chuyển hóa oxy của vi khuẩn Ngoài ra các ion bạc còn có khả năng liên kết với các base của DNA và trung hòa điện tích của gốc phosphate do đó ngăn chặn quá trình sao chép DNA [18]. Ứng dụng nano bạc trong cuộc sống Do thể hiện tính kháng khuẩn tốt nên nano bạc thường được sử dụng để làm chất khử trùng, kháng khuẩn, khử mùi… Có thể kể một vài sản phẩm chứa hạt nano bạc như: Các dụng cụ chứa thực phẩm: Những đồ dùng bằng nhựa có pha thêm hạt nano bạc có tác dụng khử trùng.

Qua kiểm tra cho thấy chúng có khả năng diệt 99. Đồ may mặc: hạt nano bạc được tẩm vào các loại sợi để diệt khuẩn và khử mùi. Khẩu trang nano bạc: Được thiết kế với 3-4 lớp gồm 2 lớp vải, một lớp vật liệu tẩm nano bạc và than hoạt tính ở giữa, loại khẩu trang này có khả năng diệt khuẩn, diệt virus, lọc không khí rất tốt. Lớp vải tẩm nano bạc có chức năng diệt vi khuẩn, virus, nấm bị giữ lại trên khẩu trang đồng thời có tác dụng khử mùi.

Màng hô hấp: Đó là một tấm màng mỏng có thể cho khí và hơi nước qua nhưng không thể cho chất lỏng đi qua, có vô số những lỗ khí nhỏ tồn tại trong tấm film. Các hạt nano bạc gần đây đã được kết hợp với film polyolefin với đặc tính kháng khuẩn rất tốt. Sơn kháng khuẩn: Bột nano bạc được trộn với sơn và phủ lên các phím điện thoại di động, tường nhà và các bề mặt cần được bảo vệ. Với khả năng kháng khuẩn tuyệt vời nano bạc sẽ giữ cho bề mặt không bị nhiễm khuẩn cũng như tiêu diệt nấm mốc làm tăng tính thẩm mỹ và tuổi thọ công trình.

Thiết bị điện tử: Các nhà khoa học cũng đang nghiên cứu ứng dụng nano bạc để sản xuất linh kiện điện tử phục vụ nhu cầu ngày càng cao của người tiêu dùng. Các thiết bị điện tử ứng dụng công nghệ nano sẽ có kích thước nhỏ gọn hơn nhưng lại có tốc độ xử lý và tuổi thọ cao hơn các thiết bị sử dụng các công nghệ truyền thống. Tổng quan về Chitosan 2.