Luận Văn Thạc Sĩ: Khả Năng Kháng Nấm Men Của Chế Phẩm Chitosan Nano Bạc

Luận văn Khả năng kháng nấm men của chitosan nano bạc trong đánh giá thực trạng, đề xuất mô hình cải tiến phù hợp thực tế công nghệ thông tin Việt Nam

• Tác giả: Nguyễn Thị Hồng Linh
• Người hướng dẫn: ThS. Lương Hùng Tiến
• Trường học: Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu khả năng kháng nấm men của chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp đại học
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Đặt vấn đề
• 1.2. Mục đích nghiên cứu
• 1.3. Yêu cầu
• 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
• 1.4.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Tổng quan về chitosan
• 2.2. Nguồn gốc của Chitin và chitosan
• 2.3. Cấu trúc hóa học của chitosan
• 2.4. Tính chất cơ bản của chitosan
• 2.4.1. Tính chất vật lý của chitosan
• 2.4.1.1. Đặc tính bề ngoài
• 2.4.1.2. Mức độ acetyl hóa
• 2.4.1.3. Trọng lượng phân tử
• 2.4.1.4. Độ nhớt
• 2.4.1.5. Tính tan
• 2.4.1.6. Tỷ trọng
• 2.4.1.7. Khả năng kết hợp với nước (WBC) và khả năng kết hợp với chất béo (FBC)
• 2.4.2. Tính chất hóa học
• 2.4.3. Tính chất sinh học
• 2.4.4. Độc tính của chitosan
• 2.5. Đặc tính kháng vi sinh vật của chitosan và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động kháng khuẩn của chitosan
• 2.5.1. Đặc tính kháng vi sinh vật
• 2.5.1.1. Khả năng kháng virus, kháng nấm
• 2.5.1.2. Khả năng kháng vi khuẩn
• 3. PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Vật liệu nghiên cứu
• 3.2. Chủng nấm men. Môi trường nuôi cấy. Dụng cụ, thiết bị
• 3.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 3.4. Nội dung nghiên cứu
• 3.5. Phương pháp nghiên cứu. Phương pháp bố trí thí nghiệm
• 3.6. Phương pháp phân tích
• 3.7. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BIỆN LUẬN
• 4.1. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của nano bạc đối với nấm men
• 4.2. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của nano bạc đối với S.
• 4.3. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của nano bạc đối với Pichia
• 4.4. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của chitosan đối với nấm men
• 4.5. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của chitosan đối với S.
• 4.6. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của chitosan đối với Pichia
• 4.7. Lựa chọn công thức phối trộn nano bạc với chitosan kháng lại nấm men
• 4.8. Xác định khả năng kháng S. cerevisiae của phức chất chitosan - nano bạc
• 4.9. Xác định khả năng kháng Pichia của phức hợp chitosan - nano bạc
• 4.10. Khả năng kháng nấm men của chế phẩm chitosan kết hợp nano bạc theo thời gian
• 4.11. Khả năng kháng S. cerevisiae của chế phẩm chitosan kết hợp nano bạc theo thời gian
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về chitosan và nano bạc

Chitosan là một polysaccharide tự nhiên, được chiết xuất từ chitin, có khả năng kháng nấm men đáng kể. Kháng nấm men của chitosan được xác định qua nhiều nghiên cứu, cho thấy khả năng ức chế sự phát triển của các loại nấm men như Saccharomyces cerevisiae và Pichia. Nano bạc, với kích thước nhỏ và diện tích bề mặt lớn, có khả năng kháng khuẩn mạnh mẽ. Sự kết hợp giữa chitosan nano bạc tạo ra một chế phẩm có tiềm năng ứng dụng cao trong y học và công nghệ thực phẩm. Nghiên cứu này nhằm xác định khả năng kháng nấm men của chế phẩm phối hợp này, từ đó mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các sản phẩm kháng khuẩn hiệu quả.

1.1. Nguồn gốc và cấu trúc của chitosan

Chitosan được chiết xuất từ chitin, một polysaccharide có mặt trong vỏ của nhiều loài động vật giáp xác. Cấu trúc hóa học của chitosan cho phép nó tương tác với các vi sinh vật, tạo ra khả năng kháng khuẩn và kháng nấm. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng chitosan có thể ức chế sự phát triển của nhiều loại nấm men, nhờ vào khả năng tương tác với màng tế bào của chúng. Điều này làm cho chitosan trở thành một ứng viên lý tưởng cho việc phát triển các sản phẩm kháng khuẩn trong thực phẩm và y tế.

1.2. Tính chất và ứng dụng của nano bạc

Nano bạc được biết đến với khả năng kháng khuẩn mạnh mẽ, nhờ vào kích thước nhỏ và tính chất hóa học đặc biệt. Các nghiên cứu cho thấy nano bạc có thể tiêu diệt vi khuẩn và nấm men hiệu quả mà không gây hại cho tế bào người. Ứng dụng của nano bạc trong y học, đặc biệt là trong việc chế tạo các vật liệu kháng khuẩn, đang ngày càng được mở rộng. Sự kết hợp giữa nano bạc và chitosan không chỉ tăng cường khả năng kháng nấm mà còn tạo ra các sản phẩm an toàn và hiệu quả cho sức khỏe con người.

II. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện thông qua các thí nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chế phẩm chitosan nano bạc đối với các chủng nấm men. Các phương pháp phân tích hiện đại như quang phổ UV-VIS và sắc ký đã được sử dụng để đánh giá hiệu quả kháng nấm. Kết quả cho thấy chế phẩm này có khả năng kháng nấm men tốt, với nồng độ ức chế tối thiểu thấp hơn so với các chất kháng khuẩn truyền thống. Điều này chứng tỏ rằng khả năng kháng nấm của chế phẩm phối hợp này có thể được ứng dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp thực phẩm và y tế.

2.1. Thiết kế thí nghiệm

Thí nghiệm được thiết kế để xác định nồng độ ức chế tối thiểu của chế phẩm chitosan nano bạc đối với các chủng nấm men. Các mẫu thử nghiệm được chuẩn bị với nhiều nồng độ khác nhau của chế phẩm, sau đó được nuôi cấy trong môi trường thích hợp. Kết quả được phân tích để xác định nồng độ tối thiểu cần thiết để ức chế sự phát triển của nấm men. Phương pháp này giúp đánh giá chính xác hiệu quả kháng nấm của chế phẩm.

2.2. Phân tích kết quả

Kết quả phân tích cho thấy chế phẩm chitosan nano bạc có khả năng kháng nấm men vượt trội. Nồng độ ức chế tối thiểu được xác định cho từng chủng nấm men, cho thấy sự khác biệt rõ rệt giữa các nồng độ chế phẩm. Điều này cho thấy rằng việc tối ưu hóa nồng độ chế phẩm có thể mang lại hiệu quả kháng nấm tốt hơn, mở ra hướng đi mới cho việc phát triển các sản phẩm kháng khuẩn trong thực phẩm và y tế.

III. Kết luận và ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng chế phẩm chitosan nano bạc có khả năng kháng nấm men hiệu quả, với nồng độ ức chế tối thiểu thấp. Kết quả này không chỉ khẳng định giá trị khoa học của nghiên cứu mà còn mở ra nhiều ứng dụng thực tiễn trong ngành công nghiệp thực phẩm và y tế. Việc phát triển các sản phẩm kháng khuẩn từ chế phẩm này có thể giúp cải thiện chất lượng sản phẩm và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng. Hơn nữa, nghiên cứu này cũng góp phần vào việc phát triển các công nghệ mới trong lĩnh vực sinh học và công nghệ thực phẩm.

3.1. Ý nghĩa khoa học

Nghiên cứu này cung cấp những hiểu biết mới về cơ chế kháng nấm của chitosan và nano bạc, từ đó mở ra hướng nghiên cứu mới trong lĩnh vực kháng khuẩn. Kết quả nghiên cứu có thể được sử dụng làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo về ứng dụng của chitosan và nano bạc trong các lĩnh vực khác nhau.

3.2. Ứng dụng trong thực tiễn

Chế phẩm chitosan nano bạc có thể được ứng dụng trong việc phát triển các sản phẩm kháng khuẩn cho thực phẩm, dược phẩm và các lĩnh vực khác. Việc sử dụng chế phẩm này không chỉ giúp bảo quản thực phẩm tốt hơn mà còn đảm bảo an toàn cho sức khỏe người tiêu dùng. Điều này cho thấy tiềm năng lớn của chế phẩm trong việc cải thiện chất lượng sản phẩm và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong tự nhiên, chitin là nguồn polysaccharide dồi dào thứ hai chỉ sau cellulose, hiện diện chủ yếu trong cấu trúc vỏ của các loài động vật giáp xác (như tôm, cua, mực) và thành tế bào của một số loài nấm. Chitosan—dẫn xuất deacetyl hóa của chitin—đã thu hút sự quan tâm lớn trong nghiên cứu khoa học nhờ các đặc tính sinh học quý giá như khả năng kháng nấm, kháng khuẩn, không độc tính (với chỉ số $LD_{50} = 16\text{ g/kg}$ thể trọng), có khả năng phân hủy sinh học và tính hòa hợp sinh học cao. Bên cạnh đó, bạc kim loại từ lâu đã được công nhận là một chất sát trùng hiệu quả. Với sự phát triển của công nghệ nano, các hạt nano bạc (kích thước từ 1 đến 100 nm) thể hiện diện tích bề mặt riêng tăng vọt, giúp tăng hoạt tính sát khuẩn lên gấp khoảng 50.000 lần so với bạc dạng khối mà không gây độc hại cho cơ thể người và động vật ở nồng độ diệt khuẩn ($< 100\text{ ppm}$).

Sự hư hỏng thực phẩm do các loài nấm men như Saccharomyces cerevisiae và Pichia sp. gây ra là một thách thức lớn trong công nghệ chế biến và bảo quản thực phẩm, đặc biệt là trong sản xuất đồ uống lên men (rượu vang, bia), nước quả và các sản phẩm chứa đường. Nấm men Pichia phát triển tạo váng màng, làm vẩn đục, oxy hóa rượu thành axit hữu cơ và sinh ra các este bay hơi làm biến đổi nghiêm trọng hương vị của vang và bia. Việc nghiên cứu kết hợp giữa polymer sinh học chitosan và hạt nano bạc nhằm tạo ra một chế phẩm phối hợp có hoạt tính ức chế nấm men vượt trội là một hướng tiếp cận giàu tiềm năng ứng dụng.

Đề tài khóa luận tốt nghiệp: "Nghiên cứu khả năng kháng nấm men của chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc" do sinh viên Nguyễn Thị Hồng Linh thực hiện tại Trường Đại học Nông Lâm – Đại học Thái Nguyên, dưới sự hướng dẫn của ThS. Lương Hùng Tiến và ThS. Nguyễn Thị Đoàn, tập trung giải quyết các mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu sau:

1. Mục tiêu nghiên cứu:

   • Đưa ra phương pháp thích hợp để xác định khả năng kháng nấm men của chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc.
   • Xác định được nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc đối với nấm men.
   • Đánh giá được khả năng kháng nấm men của chế phẩm chitosan – nano bạc theo thời gian.

2. Yêu cầu nghiên cứu:

   • Xác định chính xác khả năng kháng nấm men của chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc trên hai chủng nấm men mục tiêu.

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn:

   • Ý nghĩa khoa học: Làm sáng tỏ nồng độ ức chế tối thiểu và đóng góp thêm dữ liệu về cơ chế tương tác, ức chế nấm men của chitosan và nano bạc dạng đơn lẻ cũng như dạng phức hợp phối hợp.
   • Ý nghĩa thực tiễn: Cung cấp cơ sở dữ liệu thực nghiệm cho việc phát triển và ứng dụng chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc trong sản xuất vật liệu kháng khuẩn, màng bao gói bảo quản nông sản và thực phẩm.

4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

   • Đối tượng nghiên cứu: Dung dịch hạt nano bạc (nồng độ gốc 100 ppm), dung dịch chitosan (pha trong đệm acetat), và hai chủng nấm men kiểm nghiệm gồm Pichia sp. và Saccharomyces cerevisiae.
   • Không gian nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Vi sinh, Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm – Đại học Thái Nguyên.
   • Thời gian thực hiện: Từ ngày 07/12/2013 đến ngày 01/06/2014.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận được xây dựng trên nền tảng lý thuyết về hóa sinh polymer tự nhiên, vật lý – hóa học vật liệu nano và vi sinh vật học thực phẩm:

• Hóa sinh Chitosan: Chitosan là poly($1\rightarrow4$)-$2$-amino-$2$-deoxy-$\beta$-D-glucopyranose, công thức phân tử $(\text{C}6\text{H}{11}\text{O}_4\text{N})_n$, thu được từ quá trình deacetyl hóa chitin loại bỏ nhóm acetyl ở vị trí C2 để thay bằng nhóm amin ($-\text{NH}_2$). Khi độ deacetyl hóa (DD) $> 50%$, hợp chất mang tên chitosan. Nhóm amin tự do mang điện tích dương khi hòa tan trong môi trường axit ($\text{pH} < 6$), tạo khả năng tương tác tĩnh điện với màng tế bào vi sinh vật tích điện âm, làm biến đổi tính thấm, rò rỉ dịch bào và ức chế các quá trình sinh lý của tế bào vi nấm.
• Tính chất vật liệu Nano Bạc: Các hạt nano bạc có kích thước từ 1 đến 100 nm, diện tích tiếp xúc bề mặt lớn và thể hiện hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt (Surface Plasmon Resonance - SPR) đặc trưng với đỉnh hấp thụ quang học trong dải bước sóng 400 – 460 nm trên phổ UV-VIS. Nhờ kích thước siêu nhỏ, nano bạc dễ dàng giải phóng ion $\text{Ag}^+$ và xâm nhập màng tế bào vi sinh vật, làm rối loạn chức năng màng và ức chế enzyme.
• Phương pháp thực nghiệm vi sinh:
  • Môi trường nuôi cấy: Sử dụng môi trường Hansen lỏng (Glucose: 50 g, Peptone: 10 g, $\text{KH}_2\text{PO}_4$: 3 g, $\text{MgSO}_4\cdot7\text{H}_2\text{O}$: 3 g, Nước cất: 1000 ml, pH = 6,0) và môi trường Hansen rắn (bổ sung thêm 20 g Agar).
  • Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC): Thử nghiệm đối kháng trực tiếp trong pha dịch lỏng (ống eppendorf). Nấm men được hoạt hóa 16 giờ, pha loãng liên tiếp về mật độ $10^5\text{ CFU/ml}$. Hỗn hợp phản ứng gồm 0,5 ml môi trường Hansen lỏng + 0,4 ml dung dịch chất kháng khuẩn (ở các dải nồng độ khảo sát) + 0,1 ml dịch nấm men (tổng thể tích 1,0 ml). Sau 24 giờ ủ tĩnh ở 30°C, hút 15 µl dịch cấy nhỏ điểm lên đĩa thạch Hansen, tiếp tục ủ 24 – 48 giờ ở 30°C để quan sát sự xuất hiện hay không xuất hiện khuẩn lạc.
  • Phương pháp xác định mật độ tế bào sống sót: Sử dụng phương pháp đếm khuẩn lạc (CFU) trên bề mặt đĩa thạch theo công thức chuẩn: $$N = \frac{\sum C}{(n_1 + 0,1 n_2) \cdot f_1 \cdot v}$$ (Trong đó: $\sum C$ là tổng số khuẩn lạc đếm được; $n_1, n_2$ là số đĩa đếm ở hai độ pha loãng liên tiếp; $f_1$ là độ pha loãng thứ nhất; $v$ là thể tích mẫu cấy trên mỗi đĩa).
  • Phương pháp bảo quản giống: Cấy chuyển và giữ giống nấm men trên môi trường thạch nghiêng Hansen ở 37°C trong 24 giờ, lưu trữ trong tủ lạnh và cấy truyền định kỳ 2 tuần một lần.

---

Nội dung chính theo từng chương

Phần 1: Mở đầu

Tác giả trình bày tính cấp thiết của đề tài xuất phát từ nhu cầu bảo quản nông sản, thực phẩm an toàn sinh học. Chitin/chitosan và nano bạc được lựa chọn nhờ những ưu điểm vượt trội về hoạt tính kháng vi sinh vật và độ an toàn. Chương này xác định rõ mục đích chế tạo và đánh giá hoạt tính kháng nấm men của chế phẩm phối hợp, đặt ra 3 mục tiêu cụ thể, 1 yêu cầu kỹ thuật và phân tích chi tiết ý nghĩa khoa học, thực tiễn của nghiên cứu.

Phần 2: Tổng quan tài liệu

Tác giả hệ thống hóa toàn diện các tài liệu khoa học liên quan:

• Nguồn gốc, cấu trúc phân tử, tính chất vật lý (trọng lượng phân tử thương phẩm khoảng 100.000 Da, độ nhớt, khả năng giữ nước WBC 581 – 1150%, giữ chất béo FBC 370,2 – 665,4%), tính chất hóa học và sinh học của chitosan.
• Lý thuyết công nghệ nano, đặc tính lý học của nano bạc (quang phổ hấp thụ 400 – 460 nm, hiệu ứng chắn Coulomb, hiệu ứng bề mặt, năng lượng bề mặt hạt nano theo kích thước), cơ chế kháng khuẩn và mức độ an toàn với sức khỏe con người.
• Đặc điểm sinh thái, hình thái, khả năng đồng hóa đường và cơ chế gây hư hỏng thực phẩm (rượu vang, bia, sản phẩm nước quả) của hai chi nấm men Pichia và Saccharomyces cerevisiae.
• Tổng quan tình hình nghiên cứu trong nước và quốc tế về màng chitosan, hạt nano bạc và các phức hệ nanocomposite trong kháng khuẩn thực phẩm (như chế phẩm BQ-1 của Viện Hóa học các hợp chất tự nhiên, nghiên cứu màng chitosan bao gói thịt bò tại Đại học Thủy sản Nha Trang).

Phần 3: Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết về nguồn gốc chủng giống vi sinh vật (Pichia sp. và S. cerevisiae từ Bộ môn CNTP, Đại học Nông Lâm Thái Nguyên), hóa chất, thành phần dinh dưỡng môi trường Hansen lỏng và rắn. Thiết lập quy trình bố trí 4 nội dung thí nghiệm:

• Thí nghiệm 1: Xác định MIC của nano bạc đơn lẻ qua dải nồng độ pha loãng 25; 12,5; 6,25; 3,125; 1,5625; 0,781 ppm.
• Thí nghiệm 2: Xác định MIC của chitosan đơn lẻ qua dải nồng độ 4000, 3000, 2000, 1500, 1000, 500, 250 ppm (pha trong đệm acetat).
• Thí nghiệm 3: Thiết kế 4 công thức phối hợp chitosan – nano bạc (CT1: $\text{MIC}/2 + \text{MIC}/2$; CT2: $\text{MIC}/2 + \text{MIC}$; CT3: $\text{MIC} + \text{MIC}/2$; CT4: $\text{MIC} + \text{MIC}$) để đánh giá hoạt tính phức hợp.
• Thí nghiệm 4: Theo dõi động học ức chế nấm men sống sót theo các mốc thời gian 4, 8/10, 12, 24 và 36 giờ.

Phần 4: Kết quả nghiên cứu và biện luận

Tác giả phân tích dữ liệu thực nghiệm qua hệ thống bảng biểu và hình ảnh đĩa thạch đối kháng:

• Nano bạc thể hiện khả năng ức chế nấm men mạnh ở nồng độ thấp: giá trị MIC đối với S. cerevisiae là 6,25 ppm và đối với Pichia sp. là 3,125 ppm.
• Chitosan có độ nhớt cao, giá trị MIC xác định được đối với cả hai chủng S. cerevisiae và Pichia sp. đều là 1000 ppm.
• Phân tích tương tác phối hợp cho thấy hiệu lực kháng nấm men của phức hợp phụ thuộc chủ yếu vào sự biến thiên nồng độ của nano bạc thay vì chitosan. Nguyên nhân được biện luận là do mạch polymer chitosan tạo phức chelat giữ một phần ion bạc, làm giảm lượng chitosan tự do; trong khi đó mật độ hạt và ion bạc giải phóng từ nano bạc vẫn đủ áp đảo để gây độc tế bào nấm.
• Khảo sát theo thời gian chứng minh chế phẩm phối hợp tiêu diệt triệt để nấm men mục tiêu sau 10 giờ nuôi cấy.

Phần 5: Kết luận và đề nghị

Đưa ra kết luận tổng hợp về các giá trị MIC đơn lẻ và tỷ lệ phối hợp tối ưu, cùng mốc thời gian ức chế hoàn toàn tế bào nấm men; đồng thời đề xuất hướng tiếp tục mở rộng thử nghiệm trên các đối tượng vi sinh vật khác.

---

Kết quả và đóng góp

1. Kết quả thực nghiệm chính

Khóa luận đã xác định chính xác các thông số ức chế vi sinh vật thông qua các bảng số liệu thực nghiệm sau:

Đối tượng vi sinh vật	MIC Nano bạc đơn lẻ (ppm)	MIC Chitosan đơn lẻ (ppm)	Tỷ lệ phối hợp tối ưu Chitosan / Nano bạc (ppm/ppm)	Thời gian tiêu diệt hoàn toàn (Giờ)
Saccharomyces cerevisiae	6,25	1000	500 / 6,25 (hoặc 500 / 3,125 ở mức ức chế)	10
Pichia sp.	3,125	1000	500 / 3,125 (hoặc 500 / 1,5625 ở mức ức chế)	10

• Động học kháng nấm men theo thời gian:
  • Ở mẫu đối chứng (nước DI và đệm acetat), mật độ tế bào S. cerevisiae và Pichia sp. tăng trưởng liên tục trong 0 – 24 giờ đầu và đạt trạng thái ổn định/chững lại ở 36 giờ.
  • Khi bổ sung chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc ở nồng độ 500/6,25 ppm/ppm đối với S. cerevisiae, mật độ tế bào giảm dần và bị ức chế hoàn toàn sau 10 giờ nuôi cấy.
  • Đối với Pichia sp., ở nồng độ 500/6,25 ppm/ppm nấm men bị tiêu diệt hoàn toàn sau 8 giờ; ở nồng độ 500/3,125 ppm/ppm, nấm men bị tiêu diệt hoàn toàn sau 10 giờ.

2. Đóng góp và giải pháp đề xuất

• Đóng góp khoa học: Đề tài đã chuẩn hóa được quy trình thử nghiệm đối kháng trong môi trường lỏng kết hợp nhỏ giọt thạch đĩa phù hợp với đặc tính có độ nhớt cao của dung dịch chitosan. Khóa luận chứng minh được rằng khi kết hợp hai vật liệu, nano bạc đóng vai trò quyết định chính đến hiệu lực diệt nấm men của chế phẩm.
• Giải pháp và đề xuất thực tiễn: Việc phối hợp chitosan với nano bạc cho phép giảm một nửa nồng độ chitosan cần dùng (từ 1000 ppm xuống 500 ppm) mà vẫn đạt hiệu quả ức chế nấm men triệt để, mở ra khả năng ứng dụng chế phẩm này trong sản xuất màng phủ bảo quản sinh học nhằm ngăn ngừa hư hỏng trên các sản phẩm đồ uống lên men và quả tươi.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế của nghiên cứu:
  • Phạm vi khảo sát thực nghiệm mới chỉ dừng lại ở hai chủng nấm men thuần khiết (Saccharomyces cerevisiae và Pichia sp.) trong điều kiện phòng thí nghiệm (in vitro), chưa mở rộng trên các hệ vi sinh vật hỗn hợp thực tế.
  • Khóa luận chưa triển khai thử nghiệm ứng dụng trực tiếp chế phẩm phối hợp lên các mô hình bảo quản sản phẩm thực phẩm cụ thể (như bảo quản bề mặt rượu vang, nước trái cây hoặc màng bao gói quả tươi) để đánh giá tác động cảm quan và độ bền hóa lý trong điều kiện bảo quản thực tế.
• Hướng nghiên cứu tiếp theo (theo đề nghị của tác giả):
  • Tiếp tục nghiên cứu mở rộng khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc trên các đối tượng vi sinh vật gây bệnh và gây hư hại thực phẩm khác (các chủng vi khuẩn Gram âm, vi khuẩn Gram dương và nấm mốc).

---

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận tốt nghiệp này có giá trị tham khảo hữu ích đối với:

• Sinh viên và học viên chuyên ngành Công nghệ sinh học, Công nghệ thực phẩm, Kỹ thuật hóa học và Khoa học vật liệu: Là tài liệu tham khảo cụ thể về quy trình bố trí thí nghiệm vi sinh xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cho các hợp chất có độ nhớt và khó tan như chitosan.
• Các nghiên cứu về vật liệu nanocomposite kháng khuẩn: Cung cấp số liệu định lượng về dải nồng độ MIC, tỷ lệ phối trộn phức hợp polymer – kim loại và động học tiêu diệt tế bào vi nấm theo thời gian.
• Phần đáng tham khảo nhất: Quy trình phối trộn và đánh giá đối kháng vi sinh vật trong ống eppendorf (Mục 3.4.1 và 3.4.2) cùng các bảng dữ liệu thực nghiệm so sánh hoạt tính kháng nấm men ở Phần 4.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của nano bạc đơn lẻ đối với từng chủng nấm men là bao nhiêu?

Theo kết quả thực nghiệm ở Bảng 4.1 và Bảng 4.2 của khóa luận, nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của nano bạc đơn lẻ đối với nấm men Saccharomyces cerevisiae là 6,25 ppm, và đối với nấm men Pichia sp. là 3,125 ppm.

2. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chitosan đơn lẻ đối với hai chủng nấm men thử nghiệm là bao nhiêu?

Kết quả khảo sát ở Bảng 4.3 và Bảng 4.4 cho thấy, nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chitosan đơn lẻ (pha trong đệm acetat chuẩn về pH = 6) đối với cả Saccharomyces cerevisiae và Pichia sp. đều đạt giá trị 1000 ppm (trong dải nồng độ thử nghiệm từ 250 đến 4000 ppm).

3. Trong chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc, yếu tố nào đóng vai trò chi phối hoạt tính kháng nấm men?

Theo biện luận của tác giả ở Mục 4.3, mức độ kháng nấm men phụ thuộc chủ yếu vào sự thay đổi nồng độ của nano bạc hơn là nồng độ của chitosan. Nguyên nhân là khi hòa tan, mạch polymer chitosan tạo phức chelat với ion kim loại chuyển tiếp (bạc), làm giảm lượng chitosan tự do trong dung dịch; trong khi đó, số lượng hạt và ion bạc giải phóng từ nano bạc vẫn đủ lớn để duy trì tác động ức chế sinh trưởng mạnh mẽ lên nấm men.

4. Tỷ lệ phối hợp chitosan – nano bạc nào tiêu diệt hoàn toàn nấm men và sau thời gian bao lâu?

Khóa luận xác định:

• Đối với Saccharomyces cerevisiae, tỷ lệ phối hợp chitosan/nano bạc là 500/6,25 (ppm/ppm) tiêu diệt hoàn toàn nấm men sau 10 giờ nuôi cấy.
• Đối với Pichia sp., tỷ lệ phối hợp 500/6,25 (ppm/ppm) tiêu diệt hoàn toàn sau 8 giờ, và tỷ lệ 500/3,125 (ppm/ppm) tiêu diệt hoàn toàn sau 10 giờ.

5. Thành phần môi trường nuôi cấy Hansen được tác giả sử dụng trong nghiên cứu gồm những gì?

Môi trường nuôi cấy Hansen chuẩn được pha chế với công thức: Glucose 50 g, Peptone 10 g, $\text{KH}_2\text{PO}_4$ 3 g, $\text{MgSO}_4\cdot7\text{H}_2\text{O}$ 3 g, Nước cất 1000 ml, điều chỉnh $\text{pH} = 6,0$. Đối với môi trường Hansen rắn, tác giả bổ sung thêm 20 g Agar.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Thị Hồng Linh đã hoàn thành đầy đủ các mục tiêu đề ra khi xác định chính xác nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đơn lẻ và phối hợp của chitosan cùng hạt nano bạc đối với hai chủng nấm men gây hỏng thực phẩm Saccharomyces cerevisiae và Pichia sp. Kết quả nghiên cứu chứng minh việc kết hợp chitosan (500 ppm) với nano bạc (3,125 – 6,25 ppm) giúp tiêu diệt hoàn toàn các chủng nấm men mục tiêu chỉ sau 10 giờ nuôi cấy. Toàn bộ quy trình thực nghiệm, số liệu định lượng và biện luận cơ chế trong công trình là nguồn tài liệu tham khảo tin cậy cho các nghiên cứu ứng dụng vật liệu nano sinh học trong bảo quản thực phẩm và công nghệ sinh học.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Chitin là polysacharid thứ hai sau cellulose tìm thấy trong tự nhiên. Sản phẩm chitin – chitosan đã có nhiều công trình nghiên cứu và ứng dụng trong thực tế. Chitin có ứng dụng làm da nhân tạo và là nguyên liệu trung gian cho các chất quan trọng như chitosan, glucosamin và các chất có giá trị khác. Chitosan có nhiều ứng dụng trong các ngành công nghiệp, nông nghiệp, y dược và bảo vệ môi trường như: sản xuất glucosamin, chỉ khâu phẫu thuật, thuốc kem, vải, sơn, chất bảo vệ hoa quả, bảo vệ môi trường… Với khả năng ứng dụng rộng rãi của chitin – chitosan mà nhiều nước trên thế giới và cả Việt Nam đã nghiên cứu sản xuất các sản phẩm này.

Bạc từ lâu đã được biết tới là một chất diệt khuẩn hiệu quả và được sử dụng để làm các dụng cụ sinh hoạt. Tuy nhiên, trước đây đồ dùng bằng bạc không được sử dụng rộng rãi do giá thành cao. Từ khi công nghệ Nano ra đời thì ứng dụng của bạc mới phát triển lên một tầm cao mới. Sở dĩ nano bạc được nghiên cứu ứng dụng vào việc kháng khuẩn vì bạc là kháng sinh tự nhiên và không gây tác dụng phụ.

Nano bạc không gây phản ứng phụ, không gây độc cho người và vật nuôi khi nhiễm lượng nano bạc bằng nồng độ diệt khuẩn (khoảng nồng độ < 100ppm). Dạng phân tán với kích thước nanomet thì khả năng diệt khuẩn của bạc được tăng lên gấp bội nhờ diện tích bề mặt riêng (m2/g) tăng nhanh. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng khi ở kích thước nano (từ 1 – 100 nm), hoạt tính sát khuẩn của bạc tăng lên khoảng 50000 lần so với bạc dạng khối, như vậy 1 g bạc Nano có thể sát khuẩn cho hàng trăm m2 chất nền. Điều này sẽ giúp cho khối lượng bạc sử dụng trong các sản phẩm sẽ giảm rất mạnh nên tỷ trọng của bạc trong giá thành trở nên không đáng kể [3].

Với những ứng dụng trong thực tiễn của chitosan và nano bạc chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu luận văn với tiêu đề: “Nghiên cứu khả năng kháng nấm men của chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc”. Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ là cơ sở dữ liệu cho việc nghiên cứu tạo ra một chế phẩm phối hợp kháng vi sinh vật hoàn thiện giữa chitosan – nano bạc ứng dụng trong công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm. Mục đích nghiên cứu - Đưa ra phương pháp thích hợp để xác định khả năng kháng nấm men của chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc. - Xác định được nồng độ ức chế tối thiểu của chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc đối với nấm men.

- Đánh giá được khả năng kháng nấm men của chế phẩm chitosan – nano bạc theo thời gian. Yêu cầu - Xác định khả năng kháng nấm men của chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 1. Ý nghĩa khoa học - Đưa ra cơ chế kháng nấm men của chitosan, nano bạc.

- Đưa ra nồng độ tối thiểu của chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc để ức chế nấm men. - Giúp sinh viên có cơ hội tiếp cận với các quy trình, các thao tác kỹ thuật trong thực tế. Qua đó kết hợp với các kiến thức lý thuyết đã được học, sinh viên sẽ có những hiểu biết chuyên sâu và cái nhìn tổng quát hơn. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài - Ứng dụng sử dụng chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc trong việc chế tạo vật liệu kháng khuẩn, bảo quản.

n 3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.Tổng quan về chitosan 2.