ĐẶT VẤN ĐỀ Các nghiên cứu phân tích thị trƣờng cho thấy chế phẩm sinh học có khả năng tăng trƣởng đến 31,28 tỷ USD trong giai đoạn 2020-2024 với tốc độ CAGR là 10% trong giai đoạn dự báo. Thị trƣờng men vi sinh cho thấy xu hƣớng tăng cƣờng đầu tƣ và nghiên cứu vào các chế phẩm sinh học đem lại sự phát triển kinh tế cũng nhƣ sức khỏe ngƣời dùng [77]. Hiện nay các dạng chế phẩm probiotic dạng lỏng có thể sử dụng thuận tiện cho trẻ em trên thị trƣờng đa phần chứa dƣợc chất là dạng bào tử của chi Bacillus. Việc sản xuất các chế phẩm probiotic dạng lỏng yêu cầu quy trình sản xuất cần áp dụng điều kiện vô khuẩn, nguyên liệu sản xuất, bao bì phải tiệt khuẩn vô trùng.
Một điều quan trọng là việc giữ cho vi sinh vật tồn tại ở môi trƣờng lỏng là rất khó. Để giữ đƣợc tỉ lệ sống sót của vi sinh vật cần áp dụng một số công nghệ tiến tiến trong quá trình đóng gói nên các nhà SX hầu nhƣ không công bố quy trình sản xuất, do đó đây cũng là yếu tố dẫn đến giá thành các chế phẩm dạng uống nhỏ giọt chứa probiotic còn cao. Theo dữ liệu của Viện Khoa học sở hữu trí tuệ, có 25 bằng sáng chế liên quan tới cụm ―probiotic‖ nhƣng rất hiếm nói về ―Lactobacillus acidophilus‖[72]. Tại Việt Nam, chƣa có công ty Việt Nam nào công bố đã sản xuất chế phẩm probiotic dạng giọt uống.
Trong khi đó trên thị trƣờng dạng sản phẩm này rất phổ biến và đƣợc phân phối với giá rất cao. Chọn lọc một chủng vi sinh vật cần đảm bảo đƣợc tính an toàn thể hiện ở các khía cạnh nhƣ định danh, đặc điểm di truyền ổn định không mang gen đề kháng kháng sinh, không có khả năng gây bệnh ƣu tiên chủng phân lập từ đƣờng tiêu hóa khỏe mạnh. Để đa dạng các loại chế phẩm về probiotic, đáp ứng nhu cầu cho thị trƣờng cũng nhƣ tăng khả năng hấp thu nhanh hơn các dạng viên nén, viên nang, dễ sử dụng, do đó việc tiến hành đề tài nghiên cứu bƣớc đầu về chế phẩm giọt uống chứa probiotic là cần thiết để làm tiền đề cho phát triển các sản phẩm giọt uống probiotic sau này. 1 Vì vậy nhóm nghiên cứu thực hiện đề tài ―Nghiên cứu điều chế chế phẩm men vi sinh dạng giọt uống chứa vi khuẩn Lactobacilus acidophilus’’ với mục tiêu: - Nghiên cứu các thông số của quá trình tạo hỗn dịch probiotic dạng giọt uống và đánh giá khả năng sống sót của Lactobacilus acidophilus trong chế phẩm.
Đại cƣơng probiotic 1. Khái niệm Thuật ngữ probiotic có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp và có nghĩa là ―for life‖. Thuật ngữ này lần đầu tiên đƣợc Lilley và Stillwell đề xuất vào năm 1965 mô tả các chất đƣợc tiết ra bởi một vi sinh vật kích thích sự phát triển của vi sinh vật khác [24],[33]. Theo FAO và WHO, năm 2022 probiotic đƣợc định nghĩa là vi sinh vật sống, khi sử dụng với lƣợng vừa đủ sẽ mang lại lợi ích sức khỏe cho vật chủ [13].
Theo FDA, probiotic - còn đƣợc gọi là các sản phẩm trị liệu sinh học sống (live biotherapeutic products- LBP), là các sản phẩm có chứa các vi sinh vật sống, ví dụ nhƣ vi khuẩn, đƣợc tìm thấy tự nhiên trong cơ thể ngƣời. Phổ biến nhất là vi khuẩn thuộc các chi Lactobacillus và Bifidobacterium [14]. Tiêu chí để lựa chọn chế phẩm probiotics là các vi sinh vật dựa trên khả năng chịu đƣợc môi trƣờng tiêu hóa (acid dạ dày và dịch mật), khả năng bám dính vào niêm mạc và khả năng cạnh tranh loại trừ mầm bệnh [2][5], [8] [45]. Đƣờng tiêu hóa có diện tích bề mặt khoảng 260-300 m2, chứa vi khuẩn hiếu khí, vi khuẩn kỵ khí và nấm men [26].
Có hơn 2000 loài vi khuẩn sống trong cơ thể ngƣời, phần lớn trong ruột. Hệ vi sinh vật trong ruột ngƣời trƣởng thành có thể gấp 100 lần số lƣợng gen có trong bộ gen ngƣời. Vi khuẩn kỵ khí có lợi cho vật chủ vì chúng thực hiện trao đổi chất bao gồm lên men, cung cấp axit béo chuỗi ngắn, sản xuất vitamin, bổ sung dinh dƣỡng cho biểu mô và hỗ trợ sự phát triển của hệ thống miễn dịch [62]. Trong ống tiêu hóa, các vi khuẩn phân bố ở các vị trí với số lƣợng tƣơng ứng nhƣ hình sau [54]: 3 Hình 1.
Hình ảnh mô tả sự phân bố vi sinh vật trong ống tiêu hóa cơ thể ngƣời [54] 1. Phân loại và nguồn gốc Ngày nay, probiotic đƣợc sử dụng rộng rãi nhất thuộc các nhóm: vi khuẩn Lactic, vi khuẩn Bacillus và nấm men [19], [39], [42]. + Vi khuẩn lactic (LAB) là vi khuẩn hình que Gram (+), tế bào sinh dƣỡng không sinh bào tử, có trong sữa, thịt, thực vật, các sản phẩm lên men và trong hệ tiêu hóa của con ngƣời. Đây là vi khuẩn kỵ khí hoặc vi hiếu khí, nhiệt độ phát triền tối ƣu 37℃, không phát triển dƣới 20℃ hoặc hơn 45℃.
Vi khuẩn này sinh acid lactic nên chịu đƣợc pH acid 4,0-6,0 sinh bacteriocin, lactase cân bằng vi sinh vật đƣờng ruột và tiêu hóa lactose [38]. Các Bifidobacterium thuộc nhóm vi khuẩn lactic : là vi sinh vật kỵ khí, Gram dƣơng, không hình thành bào tử hình que hoặc đa hình nhƣ chữ Y. Vi khuẩn trong chi Bifidobacterium tạo ra axit lactic và axit axetic là sản phẩm phụ của việc sử dụng glucose. Bifidobacterium BB536 là một loại vi khuẩn probiotic, theo các nguồn thứ cấp, lần đầu tiên phân lập từ đƣờng ruột của trẻ sơ sinh khỏe mạnh.
Bifidobacteria, kết hợp với các loài Lactobacillus và men vi 4 sinh Saccharomyces boulardii, giảm tác dụng phụ tác dụng của liệu pháp Helicobacter [9]. Ngoài ra, Bifidobacterium infantis kết hợp với Lactobacillus acidophilus làm giảm tỷ lệ mắc NEC và tử vong liên quan đến NEC ở trẻ sơ sinh bị bệnh nặng [27]. + Vi khuẩn Bacillus là vi khuẩn Gram (+), sinh bào tử, không có mặt trong hệ tiêu hóa ngƣời, hô hấp kỵ khí hoặc hiếu khí. Nhiệt độ thích hợp để phát triển là 37℃, không phát triển ở dƣới 20-22℃ hoặc trên 48℃, chịu đƣợc pH acid, kháng nhiều dòng kháng sinh, chịu đƣợc nhiều hóa chất, sinh protease để tiêu hóa protein và sinh bacteriocin để ức chế vi sinh vật có hại phát triển.
Một số vi khuẩn bacillus sử dụng là Bacillus subtilis, Bacillus clausii, Bacillus coagulans [2]. + Nấm men là vi sinh vật nảy chồi, ít sinh bào tử, không có trong hệ tiêu hóa của con ngƣời, hô hấp kỵ khí hoặc hiếu khí, có khoảng giới hạn nhiệt rộng 0-50℃, tối ƣu nhất là 20-30℃ [41]. Nấm men có khả năng chịu đƣợc pH thấp, tối ƣu nhất là pH 4,0 [6], sinh enzym proteinase làm giảm độc tố do Clostridium difficile và enzym phosphatase làm bất hoạt các nội độc tố do E. coli tiết ra.
Nấm men kháng đƣợc một số kháng sinh và chịu đƣợc một số hóa chất. Các nấm men hay dùng nhƣ Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii. + Ngoài ra một số loài khác cũng đƣợc sử dụng nhƣ: Lactococcus, Pediococcus, Enterococcus…[6], [32] Một số probiotic thƣờng dùng đƣợc thể hiện trong bảng 1.1 Một số probiotic thƣờng dùng [31] Bifidobacterium Streptococcus Lactobacillus spp.animalis Nguồn vi sinh vật có thể từ sữa mẹ, thực phẩm lên men, hệ vi sinh đƣờng ruột [3]: + Sữa mẹ chứa: Staphylococci, Streptococci, Micrococci, Lactobacilli, Enterococci, Lactococci and Bifidobacterial [21], [36], [37], [43], [47], [57]. + Thực phẩm lên men: chủ yếu phân lập đƣợc các chủng LAB.
148 chủng LAB (chủ yếu chứa L. delbrueckii bulgaricus và Streptococcus thermophilus) đƣợc phân lập từ Kurut – sữa lên men tự nhiên truyền thống của Trung Quốc [59]. Ngoài ra còn có chủng L. + Hệ vi sinh đƣờng ruột ngƣời: nhiều chủng ngày nay đƣợc sử dụng phân lập từ nguồn này nhƣ L.
Ngoài ra, chủng L. fermentum, đƣợc phân lập từ niêm mạc ruột kết ở ngƣời, có hoạt động kháng khuẩn chống lại các mầm bệnh lây truyền qua thực phẩm [66]. + Các nguồn khác: từ thịt (L. curvatus and Staphylococcus carnosus), hoa quả (L.
Vai trò của probiotic Các tác động có lợi của probiotic đối với sức khỏe bao gồm: điều hòa hệ vi sinh vật, kích thích và tăng cƣờng chức năng của hàng rào bảo vệ đƣờng ruột, tác dụng có lợi trên sinh khả dụng của các chất dinh dƣỡng, giảm bớt triệu chứng không dung nạp lactose [7], [63]. Sơ đồ minh họa cơ chế tác động của probiotics [31]. Ghi chú: IEC : intraepithelial cells (tế bào biểu mô) DC: dendritic cells (tế bào đuôi gai) T: T-cells (tế bào T) Cơ chế tác động của probiotic phần lớn chƣa đƣợc nghiên cứu rõ ràng. Một số cơ chế cơ bản có thể kể đến là: giảm pH màng tế bào; cạnh tranh vị trí gắn và nguồn dinh dƣỡng; tiết ra các chất kháng khuẩn, chất khử độc tố và tăng cƣờng miễn dịch [15], [44], [49], [53].
Vai trò của probiotic trong một số bệnh đƣợc tổng hợp trong bảng 1. Vai trò của probiotic trong một số bệnh [3] Bệnh lý Một số probiotic hỗ trợ điều trị Escherichia coli Bifidobacterium bifidum Eczema Bifidobacterium lactic Lactococcus lactic Dị ứng thực phẩm Escherichia coli Bacillus circulans Miễn dịch Lactobacillus plantarum Enterococcus mundtii Rối loạn tiêu hóa do kháng sinh Lactobacillus plantarum Lactobacillus brevis Viêm dạ dày ruột Lactobacillus casei Bifidobacterium infantis Escherichia coli Tiêu chảy Lactobacillus plantarum Lactobacillus casei Nhiễm nấm Candida âm đạo, tƣa Lactobacillus rhamnosus miệng Lactobacillus reuteri Lactobacillus rhamnosus Nhiễm trùng đƣờng tiết niệu Lactobacillus reuteri Không dung nạp lactose Lactobacillus acidophilus Lactobacillus acidophilus Viêm đại tràng Escherichia coli Bifidobacterium 8 1. Giới thiệu Lactobacilus acidophilus 1. Phân loại và nguồn gốc của Lactobacilus acidophilus Theo khóa phân loại Bergey năm 2004, Lactobacilus acidophilus đƣợc phân loại nhƣ sau [17]: Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Lactobacillales Họ: Lactobacillaceae Giống: Lactobacillus Loài: Lactobacillus acidophilus Lactobacillus acidophilus lần đầu tiên đƣợc Moro phân lập từ phân trẻ sơ sinh năm 1900.
Sau này, vi khuẩn L. Đặc điểm hình thái, sinh lí, điều kiện nuôi cấy, bảo quản L. acidophilus là vi khuẩn Gram (+), hình que, không sinh bào tử, đứng riêng lẻ hay tập trung thành sợi ngắn, có khả năng sinh acid lactic. acidophilus màu trắng đục, tròn, nhô cao, đƣờng kính khuẩn lạc 0,9 – 1,2 mm, rìa khuẩn lạc trơn và bề mặt khuẩn lạc khô.
acidophilus phát triển tối ƣu ở nhiệt độ 37 - 42 và pH 5,5 - 6,0 không phát triển trong khoảng 20 - 22℃, dừng tăng trƣởng ở pH dƣới 4,0 có thể phát triển ở nhiệt độ cao lên đến 45℃ [38]. Điều kiện nuôi cấy: L. acidophilus nuôi cấy ở 37℃, nhân giống và lên men thu sinh khối ở môi trƣờng vi hiếu khí (5% CO2), môi trƣờng dinh dƣỡng dạng lỏng, giàu dinh dƣỡng, khoáng, nhân giống hoặc lên men thu sinh khối trong thời gian khoảng 24h vì đây là lúc vi khuẩn đang ở pha sinh trƣởng và khỏe mạnh nhất [23]. Vai trò của Lactobacillus acidophilus với sức khỏe 1.
Đối với hệ tiêu hóa - L.