MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Sâm Ngọc Linh là loài cây đặc hữu của Việt Nam và được định danh công bố quốc tế là một loài sâm mới với tên khoa học là Panax vietnamensis Ha et Grushv bởi tiến sỹ Hà Thị Dụng và giáo sư I. Sâm Việt Nam (P.vietnamensis) được phát hiện từ năm 1973 (Nguyễn Thượng Dong và cs.Thành phần hóa sinh và giá trị dược liệu của sâm Ngọc Linh được tiến hành phân tích bởi nhiều nhóm tác giả (Nguyễn Thị Tâm và cs., 1999 [58]; Yamasaki, K, 2000 [137]; Trịnh Thị Hương và cs. Kết quả từ các nhà khoa học chỉ ra rằng trong củ sâm Ngọc Linh có chứa 52 hoạt chất saponin, cao gấp đôi so với thành phần saponin trong nhân sâm Hàn Quốc (Nguyễn Thị Tâm và cs.
Tại hội nghị quốc tế về sâm, loài sâm này được xếp vào nhóm các loài sâm quý trên thế giới cùng với sâm Triều Tiên (Panax ginseng C.Mey), sâm Mỹ (Panaxquinquefolium L.) và Tam thất (Panax notoginseng Chen.) (Đặng Ngọc Phái và cs. Sâm Ngọc Linh được xác định là cây thuốc quý có giá trị sử dụng với rất nhiều công dụng tốt cho sức khỏe con người và giá trị kinh tế cao nên đã bị mua bán, khai thác cạn kiệt, gần như không còn trong tự nhiên. Trước tình hình đó, Chính phủ đã quyết định thành lập vùng cấm rừng quốc gia ở khu vực có sâm tập trung tại 2 tỉnh Kon Tum và Quảng Nam, đồng thời xếp sâm Ngọc Linh vào danh mục những cây thuốc quý, hiếm cần được ưu tiên bảo vệ theo Nghị định số 160/2013/NĐ-CP của Thủ tướng Chính phủ về tiêu chí xác định loài nguy cấp, quý, hiếm được ưu tiên bảo vệ. Định hướng phát triển sâm Việt Nam trở thành sản phẩm mang thương hiệu quốc gia, ngày 01/01/2021, Thủ tướng Chính phủ đã ký quyết định số 157/QĐ-TTg về việc ban hành 2 Chương trình phát triển sản phẩm Quốc gia “Sâm Việt Nam” đến năm 2030.
Mục tiêu phát triển cây sâm Ngọc Linh trở thành cây kinh tế mạnh xứng tầm là sản phẩm Quốc gia. Hiện nay, giá trị thương mại sâm Ngọc Linh rất cao từ 150-200 triệu đồng/kg, nên sâm Ngọc Linh đang bị giả mạo, trà trộn với các loài sâm khác không có giá trị. Diện tích trồng và phát triển sâm Ngọc Linh với quy mô nhỏ l , manh mún; hạt giống trôi nổi không có sự quản lý dẫn đến lẫn tạp và thoái hóa giống, việc sản xuất cây giống, trồng phát triển tạo vùng nguyên liệu sâm Ngọc Linh vẫn còn gặp rất nhiều khó khăn. Chưa có quá nhiều đề tài/dự án cho nghiên cứu sản xuất và phát triển cây giống sâm.
Việc nhân giống và trồng sâm hiện nay vẫn chủ yếu dựa theo kinh nghiệm truyền thống với hệ số nhân giống thấp, chưa có quy trình sản xuất, nhân giống và kỹ thuật canh tác chuẩn cho cây sâm Ngọc Linh (Kết quả khảo sát năm 2018). Để phát triển nhanh được cây sâm theo hướng công nghiệp, cần nhanh chóng nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống, quy trình canh tác để đáp ứng nhu cầu phát triển sâm Ngọc Linh tạo ra sản phẩm hàng hóa và xây dựng thương hiệu cho sâm Ngọc Linh. Một trong những mục tiêu quan trọng của đề tài là: (1) xây dựng quy trình xác định đúng giống sâm Ngọc Linh bằng mã vạch DNA phục vụ xây dựng được những vườn giống sâm đạt chuẩn. (2) hoàn thiện kỹ thuật sản xuất cây giống sâm Ngọc Linh bằng phương pháp nhân in vitro và hữu tính từ hạt.
Sản xuất cây giống sâm đúng phương pháp, áp dụng công nghệ hiện đại trong sinh học phân tử để xác định chính xác đúng cây giống sâm Ngọc Linh sẽ đáp ứng yêu cầu phát triển bền vững, cung cấp nguyên liệu dược liệu chất lượng cao một cách bền vững, phục vụ nhu cầu trong nước và xuất khẩu; đem lại công ăn việc làm, nâng cao thu nhập và ổn định đời sống xã hội cho đồng bào dân tộc ở vùng khó khăn là một việc làm rất có ý nghĩa. Vì vậy, đề tài “Hoàn 3 thiện biện pháp kỹ thuật sản xuất cây giống sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)” sẽ có ý nghĩa khoa học và thực tiễn, tính ứng dụng cao, hữu ích với người dân và các nhà sản xuất sâm. Mục đích và yêu cầu 2. Mục đích - Xây dựng quy trình xác định đúng giống sâm Ngọc Linh bằng phương pháp chỉ thị phân tử, nhằm phục vụ phát triển các vườn giống sâm gốc chuẩn đảm bảo chất lượng giống.
- Hoàn thiện biện pháp kỹ thuật sản xuất cây giống sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào đáp ứng nhu cầu về cây giống sâm Ngọc Linh hiện nay. - Hoàn thiện biện pháp kỹ thuật sản xuất cây giống sâm Ngọc Linh bằng hạt đạt tỷ lệ nảy mầm cao, chất lượng cây con tốt. Yêu cầu - Thiết kế chỉ thị phân tử và xác định các chỉ thị đặc hiệu để kiểm định xác định đúng cây giống sâm Ngọc Linh. - Xác định được thời gian xử lý mẫu cấy thích hợp để giảm tỷ lệ nhiễm vi khuẩn/nấm; môi trường nuôi cấy thích hợp cho sự hình thành và phát triển phôi vô tính, tỷ lệ sống sót và đặc điểm sinh trưởng của cây con in vitro sâm Ngọc Linh.
- Hoàn thiện biện pháp kỹ thuật nhân giống hữu tính trong điều kiện hạt sâm Ngọc Linh được xử lý, phương pháp bảo quản; nghiên cứu các thành phần giá thể khác nhau để đảm bảo tiêu chuẩn cây con xuất vườn cao và xác định được một số biện pháp kỹ thuật chính (mật độ, liều lượng phân bón) để trồng và phát triển cây sâm. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3. Ý nghĩa khoa học Sử dụng chỉ thị phân tử để đánh giá đúng nguồn cây giống sâm Ngọc Linh là phương pháp mới, đã được áp dụng trên nhiều đối tượng cây trồng, nhờ đó rút ngắn được thời gian; có độ chính xác và hiệu quả cao trong chọn lọc. Đề tài nghiên cứu đã góp thêm cơ sở lý luận cho việc sản xuất cây giống sâm Ngọc Linh bằng phương pháp nuôi cấy mô thông qua con đường phát sinh phôi vô tính có ưu điểm vượt trội là hệ số nhân giống cao, tạo ra phôi hoàn chỉnh (rễ, thân lá, củ) và ít chịu biến dị trong quá trình nuôi cấy; phương pháp nhân giống hữu tính từ hạt là xử lý khả năng ngủ nghỉ của hạt để nâng cao hiệu quả sản xuất cây giống.
Hoàn thiện biện pháp kỹ thuật sản xuất cây giống sâm Ngọc Linh (nhân giống in vitro và nhân giống hữu tính từ hạt) và các dữ liệu khoa học thu được có thể làm tài liệu tham khảo có giá trị cho giảng dạy và nghiên cứu khoa học trên đối tượng cây dược liệu này. Ý nghĩa thực tiễn - Phương pháp xác định đúng giống sâm Ngọc Linh bằng các chỉ thị phân tử đặc hiệu giúp xây dựng được vườn sâm đúng giống, minh bạch thương mại và bảo tồn nguồn gen. - Nghiên cứu hoàn thiện biện pháp kỹ thuật nhân giống in vitro là tiền đề cho một bước phát triển trong việc sản xuất số lượng lớn cây giống sâm Ngọc Linh chất lượng cao ở quy mô hàng hóa. - Thành công trong việc nhân giống hữu tính bằng việc xử lý ngủ nghỉ hạt (bóc vỏ, phơi âm can và xử lý GA3), phương pháp bảo quản; gieo hạt đã nứt nanh trên thành phần giá thể khác nhau để đảm bảo cây giống đồng đều có tỷ lệ xuất vườn cao là một định hướng an toàn cho việc sản xuất cây giống 5 ở quy mô hàng hóa, góp phần tăng cường mở rộng diện tích trồng cây sâm Ngọc Linh đại trà.
Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu của đề tài - Đối tượng nghiên cứu là biện pháp kỹ thuật sản xuất giống (nhân giống in vitro, nhân giống hữu tính từ hạt) sâm Ngọc Linh (P.vietnamensis) - Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu hoàn thiện biện pháp kỹ thuật sản xuất cây giống in vitro (nhân phôi, tạo củ và nuôi dưỡng củ; tạo rễ và hoàn thiện cây con) .Nhân giống hữu tính từ hạt (hạt được xử lý phá ngủ nghỉ; tạo hạt nứt nanh) sâm Ngọc Linh (P. Địa điểm và thời gian nghiên cứu - Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn Sinh học phân tử thuộc Viện Di truyền Nông nghiệp (Từ Liêm, Hà Nội); vùng trồng sâm Ngọc Linh tại núi Ngọc Linh tỉnh Kon Tum. - Thời gian nghiên cứu: Năm 2017 - 2021. Những đóng góp mới của luận án - Xây dựng được phương pháp xác định đúng giống sâm Ngọc Linh bằng chỉ thị phân tử DNA mã vạch.
Đây là phương pháp hiện đại, chính xác, hiệu quả giúp xây dựng được vườn sâm giống thuần chủng, minh bạch thương mại và bảo tồn nguồn gen. - Hoàn thiện các biện pháp kỹ thuật trong quá trình sản xuất công nghiệp cây giống sâm Ngọc Linh bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào cho tỷ lệ cây giống sâm Ngọc Linh in vitro sống cao. - Hoàn thiện được các biện pháp kỹ thuật sản xuất cây giống sâm Ngọc Linh từ hạt. Xác định hạt sâm Ngọc Linh phơi âm can, xử lý ngâm trong dung dịch GA3 100 ppm trong vòng 45 phút có khả năng phá ngủ nghỉ của hạt.
6 CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI IỆU 1. Nguồn gốc chi Panax Nhân sâm (Ginseng) thuộc họ Ngũ gia bì (Araliacaea). Họ Ngũ gia bì bao gồm khoảng 700 loài thực vật. Cà rốt, cần tây và củ cải cũng thuộc họ này.
700 loài này được chia thành 70 chi, một trong số đó là chi Panax. Có 5- 13 loài của chi Panax (Persons, W. Nhưng trong số đó chỉ có 5 loài đã được đăng ký chính thức (Bảng 1. Panax japonicum được phát hiện mọc tự nhiên tại miền núi của Nhật Bản từ thời cổ đại.
Người Nhật đã trồng nhân sâm Panax và xuất khẩu sang Trung Quốc và Hồng Kông (Persons, W. Panax notoginseng có phẩm chất dược lý tương tự như những nhân sâm của 02 loài có giá trị nhất (P. ginseng) và nó ngày càng trở nên phổ biến như một loại dược thảo. Panax trifolium, còn gọi là sâm lùn hoặc lạc, được tìm thấy ở Mỹ (Persons, W.
Những loài sâm đƣợc xác định hiện nay STT Tên latin Tên thƣờng gọi Nguồn gốc 1 Panax ginseng Asian or Korean Siberia,Korea, China ginseng 2 Panax japonicum Japanese ginseng Japan 3 Panax notoginseng China 4 Panax trifolium Dwarf ginseng, ground North America nut 5 Panax American ginseng North America, quinquefolium Canada Nguồn: Persons and Davis, 2007 [109] 7 Theo các tác giả (Lee, F.M,1997 [120]) chi Panax bao gồm 11 loài và 1 thứ. Dựa vào nguồn gốc địa lý hay trồng thương mại sâm chia thành hai thứ chính đó là sâm Châu Á (Panax ginseng Asian) và sâm Mỹ (Panax quinquefolium American).