Luận văn: Cải tiến biểu hiện và tinh sạch 3-Chymotrypsin-like Protease từ SARS-CoV-2

Luận văn thạc sĩ trình bày phương pháp cải tiến biểu hiện và tinh sạch 3CL protease từ virus SARS-CoV-2, một enzyme quan trọng trong vòng đời virus.

• Tác giả: Lê Thế Thái
• Người hướng dẫn: Nguyễn Thị Hồng Loan
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Cải tiến sự biểu hiện và tinh sạch 3 chymotrypsin-like protease từ SARS-CoV-2
• Loại tài liệu: Luận văn Thạc sĩ Khoa học
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về 3CL Protease SARS CoV 2

3CL protease (3CLpro), còn gọi là chymotrypsin-like protease hay Mpro, là một trong những enzyme protease quan trọng nhất của virus SARS-CoV-2. Enzyme này đóng vai trò then chốt trong chu kỳ sinh sản của virus bằng cách cắt polyprotein thành các protein chức năng không cấu trúc (NSP). Cấu trúc của 3CLpro bao gồm hai domain chính với trung tâm hoạt động nằm ở vị trí ngăn cách giữa các domain này. Sự hiểu biết sâu sắc về cấu trúc và chức năng của protease SARS-CoV-2 là nền tảng cho việc phát triển các thuốc ức chế virus và các công cụ nghiên cứu hiệu quả.

1.1. Cấu trúc và chức năng của 3CLpro

3CL protease có cấu trúc gồm hai domain kết hợp với nhau, tạo thành trung tâm hoạt động chứa các residue xúc tác. Enzyme này cắt polyprotein pp1ab tại 11 vị trí cắt khác nhau để giải phóng các NSP cần thiết. Cơ chế xúc tác của protease này liên quan đến cặp Cys-His ở trung tâm hoạt động, cho phép phân cắp đặc hiệu các liên kết peptide.

1.2. Vai trò trong chu kỳ sống của SARS CoV 2

Trong quá trình vòng đời virus SARS-CoV-2, 3CLpro hoạt động ngay sau khi RNA virus được dịch mã. Bằng cách cắt polyprotein, enzyme này tạo ra các protein chức năng như RNA polymerase và các protein không cấu trúc khác, là điều kiện tiên quyết cho nhân lên virus và sự lây nhiễm.

II. Phương pháp cải tiến biểu hiện 3CL Protease

Cải tiến biểu hiện 3CLpro là một bước quan trọng để thu được lượng lớn enzyme protease cho các ứng dụng nghiên cứu và phát triển thuốc. Các nhà khoa học sử dụng vector biểu hiện và hệ thống vi khuẩn E. coli để tăng năng suất sản xuất enzyme này. Tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy, điều chỉnh nhiệt độ, và lựa chọn chủng vi khuẩn phù hợp đều góp phần nâng cao mức độ biểu hiện của protease SARS-CoV-2 trong các hệ thống sinh học.

2.1. Sử dụng vector biểu hiện pET và hệ thống E. coli

Vector pETM33 là lựa chọn phổ biến cho biểu hiện protein tái tổ hợp trong E. coli. Hệ thống này cho phép tạo ra protein fusion với các tag định vị như GST và His-tag để thuận tiện trong tinh sạch. Bằng cách cảm ứng bằng IPTG, vi khuẩn có thể sản xuất lượng lớn 3CLpro trong thời gian ngắn, tăng hiệu suất sản xuất đáng kể.

2.2. Tối ưu hóa điều kiện biểu hiện

Điều chỉnh nhiệt độ nuôi cấy từ 37°C xuống 20-25°C có thể giảm bao thể inclusion và tăng tỷ lệ protein hòa tan. Kiểm soát thời gian cảm ứng và nồng độ IPTG là những yếu tố then chốt ảnh hưởng đến năng suất biểu hiện 3CLpro. Các nghiên cứu cho thấy tối ưu hóa này có thể tăng mức độ biểu hiện lên 50-70% so với điều kiện tiêu chuẩn.

III. Quá trình tinh sạch 3CL Protease

Tinh sạch 3CLpro là bước then chốt để thu được enzyme với độ tinh sạch cao phục vụ cho các phân tích hoạt độ và ứng dụng trong nghiên cứu. Quá trình tinh sạch thường bao gồm nhiều bước như ly tâm tế bào, chiết xuất protein, sắc ký ái lực sử dụng His-tag hoặc GST-tag, và sắc ký cơ sở ion hoán. Các kỹ thuật điện di SDS-PAGE được sử dụng để đánh giá độ tinh sạch và độ homogenous của protease SARS-CoV-2 sau mỗi bước tinh sạch.

3.1. Các bước tinh sạch sơ cấp

Sắc ký ái lực sử dụng cột Ni-NTA là phương pháp hiệu quả nhất để tách 3CLpro từ các protein khác trong dịch chiết. His-tag trên protease tái tổ hợp cho phép kết dính cụ thể với nickel tree trên cột, từ đó loại bỏ được phần lớn protein lạ. Sau bước này, độ tinh sạch có thể đạt 80-90%, được xác nhận bằng phân tích SDS-PAGE.

3.2. Tinh sạch chuyên sâu và kiểm tra chất lượng

Sắc ký trao đổi ion thêm vào sau sắc ký ái lực giúp loại bỏ hoàn toàn các tạp chất còn lại. Thẩm tách miễn dịch western blot được sử dụng để xác minh danh tính của protease 3CL thông qua các kháng thể đặc hiệu. Kiểm tra độ tinh sạch cuối cùng bằng SDS-PAGE và phân tích khối lượng phân tử đảm bảo chất lượng protein đạt tiêu chuẩn cao.

IV. Đánh giá hoạt độ và ứng dụng 3CLpro

Đánh giá hoạt độ catalytic của 3CL protease là bước essential trong việc xác nhận rằng enzyme đã tinh sạch vẫn giữ được khả năng cắt cơ chất tối ưu. Các assay dựa trên huỳnh quang sử dụng cơ chất peptide huỳnh quang cho phép đo lường tốc độ phản ứng một cách chính xác và nhạy cảm cao. Protease SARS-CoV-2 được biểu hiện và tinh sạch thành công có thể ứng dụng trong phát triển thuốc ức chế, screening hợp chất sinh học, và các nghiên cứu về cơ chế virus trong tương lai.

4.1. Phương pháp đánh giá hoạt độ huỳnh quang

Assay huỳnh quang sử dụng cơ chất peptide có nhóm huỳnh quang và nhóm dập tắt để phát hiện hoạt động cắt của 3CLpro. Khi protease cắt cơ chất, nhóm huỳnh quang được giải phóng, tạo ra tín hiệu huỳnh quang có thể đo lường được. Phương pháp này cho phép xác định Km và Vmax của enzyme, cũng như độ ức chế của các ứng cử viên thuốc.

4.2. Ứng dụng trong phát triển thuốc chống virus

3CL protease là mục tiêu thuốc hàng đầu cho các thuốc chống COVID-19 bởi vì vai trò quan trọng của nó trong nhân lên virus. Enzyme được tinh sạch từ hệ thống biểu hiện tái tổ hợp có thể dùng để screening hợp chất ức chế hoạt động catalytic của protease. Các ứng cử viên thuốc như Paxlovid đã được phát triển dựa trên hiểu biết sâu về cơ chế hoạt động của enzyme protease này.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về SARS-CoV-2 1.1 Tình hình nhiễm SARS-CoV-2 và triệu chứng của bệnh COVID-19 Cuối năm 2019, tại Vũ Hán, Trung Quốc đã xuất hiện một loại virus mới nổi gây ra hội chứng hô hấp cấp tính có khả năng truyền nhiễm, khởi nguồn từ chợ buôn bán động vật và hải sản tươi sống Hoa Nam [54]. Virus mới này lây lan nhanh và trở thành tác nhân gây nên đại dịch toàn cầu. Phân tích trình tự gen của virus cho thấy nó có sự tương đồng lên tới 96% với trình tự gen của chủng Coronavirus (CoV) gây ra hội chứng hô hấp cấp tính nặng (Sever acute respiratory sydrome coronavirus - SARS-CoV) [9] nên được đặt tên là SARS-CoV-2. Bệnh gây ra bởi SARS-CoV-2 xuất hiện vào năm 2019 nên cũng được đặt tên là bệnh COVID-19.

Trước SARS-CoV-2, đã xuất hiện hai chủng Coronavirus lây nhiễm trên người có độc lực cao bao gồm SARS-CoV và MERS-CoV (Middle East respiratory syndrome coronavirus - virus gây hội chứng hô hấp cấp Trung Đông). SARS-CoV lần đầu tiên xuất hiện tại Quảng Đông, Trung Quốc vào năm 2002, lan ra toàn cầu và gần như trở thành một đại dịch với 8.422 trường hợp mắc và tỉ lệ tử vong là 10% [29]. MERS-CoV xuất hiện ở Trung Đông năm 2012 gây viêm phổi và suy thận nặng với tỷ lệ tử vong lên tới 30% [50]. SARS-CoV-2, từ khi xuất hiện đến nay đã gây ra hậu quả nặng nề nhất kể từ sau đợt đại dịch cúm Tây Ban Nha năm 1918 [30].

Về dịch tễ học của SARS-CoV-2, so sánh với MERS-CoV và SARS-CoV, SARS- CoV-2 là virus có khả năng lây nhiễm cao, có thể tồn tại trong không khí khoảng 2 giờ. Thời gian ủ bệnh của SARS-CoV-2 là khoảng 4-8 ngày sau khi nhiễm bệnh [31]. Mặc dù mọi người ở mọi lứa tuổi đều dễ bị nhiễm SARS-CoV-2, nhưng những người lớn tuổi có bệnh nền sẽ có nguy cơ cao hơn. Những người bị nhiễm nhưng không có triệu chứng hoặc đang trong thời kỳ ủ bệnh của virus đóng vai trò là người mang virus [53].

Nhóm bệnh nhân này khó phát hiện và xác định vị trí hơn dẫn đến việc họ trở thành nhân tố quan trọng trong việc lây lan COVID-19 trong cộng đồng. Người bệnh nhiễm COVID-19 thường có các triệu chứng như sốt (> 90% trường hợp), khó chịu, ho khan (80%), khó thở, đau ngực, mất khứu giác và vị giác (20%), suy hô hấp (15%), các triệu chứng khác ít gặp hơn như đau họng, đau đầu, tiêu chảy, da nổi mẩn, mắt đỏ hoặc ngứa. Người lớn tuổi và những người mắc các bệnh nền như bệnh tim mạch, tiểu đường, bệnh 2 1 hô hấp mãn tính hoặc ung thư có nhiều khả năng mắc bệnh nghiêm trọng hơn. Theo các nghiên cứu hiện có, các giọt bắn từ đường hô hấp và tiếp xúc gần với người bị nhiễm bệnh được coi là con đường lây truyền chính của SARS-CoV-2 [5, 21].

Một cách lây truyền khác có thể xảy ra là qua kết mạc vì biểu mô kết mạc có thể dễ dàng bị nhiễm bẩn [29]. Theo WHO, tính đến ngày 21 tháng 04 năm 2024, số người chết do COVID-19 trên toàn cầu lên tới 7.261 trường hợp được xác nhận nhiễm COVID-19 được báo cáo cho WHO. Tại Việt Nam đã có khoảng 11.000 các trường hợp mắc bệnh với 43.206 ca tử vong. Những người mắc các bệnh nền như bệnh tim mạch, tiểu đường, bệnh hô hấp mãn tính hoặc ung thư có nhiều khả năng mắc bệnh nghiêm trọng hơn [64].2 Đặc điểm hình thái, cấu trúc và quá trình xâm nhiễm của SARS-CoV-2 Về hình thái và cấu trúc bên ngoài (Hình 1), SARS-CoV-2 có dạng hình cầu với đường kính khoảng 125 nm [61].

Ở dạng thể virus (virion), RNA được đóng gói bởi các protein nucleocapsid (N) tạo thành một phức hợp ribonucleoprotein (RNP) lớn và được bao bọc bởi một màng bao có lipid và protein S (protein bề mặt hoặc gai), M (protein màng) và E (protein vỏ) (Hình 2). Thuật ngữ “coronavirus” được sử dụng dựa trên đặc điểm hình thái điển hình của họ virus này khi được quan sát dưới kính hiển vi điện tử, trong đó các gai nhọn nhô ra từ lớp vỏ ngoài tạo ra hình dạng giống như vương miện (“corona” có nghĩa là vương miện trong tiếng La-tinh). Các gai này có độ dài khoảng 17 – 20 nm tính từ bề mặt hạt virus và được mô tả có dạng hình chùy, hình quả lê hoặc hình cánh hoa [25]. Hình 1: Hình thái thể coronavirus với các protein cấu trúc hình thành nên hạt virus và bộ gen RNA sợi đơn SARS-CoV-2 [46] 3 1 Cụ thể, cấu trúc của protein S là một glycoprotein gồm 2 tiểu đơn vị chức năng S1 và S2, trong đó tiểu đơn vị S1 chứa miền liên kết thụ thể (receptor binding domain - RBD) có vai trò trong việc gắn với thụ thể tế bào chủ, còn tiểu đơn vị S2 chịu trách nhiệm dung hợp màng tế bào và virus.

Thụ thể của SARS-CoV-2 trên tế bào người được xác định là enzyme chuyển hóa angiotensin 2 (Angiotensin-converting enzyme 2, ACE2), đây là enzyme có mặt nhiều nhất trong các tế bào phế nang của phổi, nơi diễn ra hoat động trao đổi khí của tế bào và cơ thể. Bề mặt của tế bào vật chủ cũng chứa TMPRSS2, một loại serine protease có chức năng kích hoạt protein S, tạo điều kiện thuận lợi cho SARS-CoV-2 xâm nhập vào tế bào vật chủ (Hình 2) [24]. Hình 2: Vị trí và cấu tạo glycoprotein gai (S) của SARS-CoV-2 [24] Về cấu trúc bên trong, với bộ gen RNA đơn dương (+ssRNA - single-stranded positive-sense RNA), tức là chuỗi RNA này mang thông tin tương tự như một chuỗi RNA thông tin (message RNA – mRNA) (Hình 3). Kích thước bộ gen của SARS-CoV- 2 là khoảng 29,9 kb với ~78% trình tự tương đồng với SARS-CoV.

RNA bộ gen của SARS-CoV-2 bao gồm hai khung đọc mở chính (open reading frame-ORF) là ORF1a và ORF1b mã hóa cho 2/3 bộ gen của virus và được dịch mã sang protein pp1a và pp1b. Bộ khung ORF1a và ORF1b mã hóa nhiều loại protein phi cấu trúc (non-structural protein –NSP), trong đó có 2 protease cysteine chính, bao gồm papain-like protease (PLpro) hoặc nsp3 và 3-chymotrypsin-like protease (3CLpro) hoặc nsp5 (hay còn gọi là protease chính-Mpro). Các protease này phân cắt các polypeptide pp1a và pp1b thành 16 protein phi cấu trúc. Các NSP được mã hóa bởi ORF1a và ORF1b đóng vai trò quan 4 1 trọng trong chu trình sống của RNA virus.

Trong đó, 3CLpro có vai trò quan trọng trong sao chép và đóng gói tạo virus hoàn chỉnh [35]. Một phần ba còn lại của bộ gen có các ORF gối lên nhau, mã hóa bốn protein cấu trúc chính, bao gồm protein S, protein nucleocapsid, protein màng, protein vỏ và một số protein phụ [62]. Từ khi được phát hiện cho đến nay, trình tự gen của SARS-CoV-2 có nhiều đột biến dẫn đến sự xuất hiện của nhiều biến chủng SARS-CoV-2 khác nhau. Các đột biến làm SARS-CoV-2 có thể dễ dàng lây lan, giảm hiệu quả của thuốc điều trị và công cụ chẩn đoán [25].

̀ h 3: Cấu trúc hệ gen của SARS-CoV-2 [62] Hin Chú thích: ORF1a, ORF1b, ORF3, OF6, ORF7 (7a, 7b), ORF8, ORF9b: khung đọc mở; nsp1-11, 12-16: protein phi cấu trúc; Plpro: papain-like protease; 3CLpro: 3C-like protease; RdRp: RNA polymerase phụ thuộc RNA; Hel: helicase; NTD: miền đầu N; RBD: miền liên kết thụ thể; SD1, SD2: miền phụ 1, 2 của protein S; HR1, HR2: vùng lặp lại 1, 2; TM: miền xuyên màng; TMPRSS2: serine protease kích hoạt protein S Quá trình xâm nhiễm và vòng đời của SARS-CoV-2 (Hình 4) có thể được miêu tả như sau: Virus liên kết với màng tế bào vật chủ bằng sự liên kết với RBD trong tiểu đơn vị S1 của protein S với enzyme ACE2. Sau đó virus xâm nhập vào tế bào vật chủ bằng cách hợp nhất trực tiếp giữa tế bào vật chủ và màng virus và/hoặc nội bào bằng cách sử dụng tiểu đơn vị S2 của protein S. Khi xâm nhập vào trong tế bào vật chủ, hệ gen RNA của virus được giải phóng. RNA virus trong tế bào chất của các tế bào bị nhiễm bệnh có thể được dịch mã thành hai polyprotein là pp1a và pp1ab, được cắt bởi hai protease virus là 3CLpro và PLpro, để tạo ra 16 protein phi cấu trúc trưởng thành (NSP).

Trong số đó, NSP12, còn được gọi là RNA polymerase phụ thuộc RNA (RNA- dependent RNA polymerase - RdRp), phức hợp sao chép và phiên mã (replication and 5 1 transcription complex - RTC) nằm trên các túi màng đôi (double-membrane vesicles - DMV), chịu trách nhiệm sao chép và phiên mã bộ gen của virus. Các sản phẩm RNA của virus được định vị trong DMV và được vận chuyển đến bào tương. Sau đó, các protein cấu trúc bao gồm protein gai (S), protein vỏ (E), màng (M) được dịch mã trong mạng lưới nội chất (ER) và vận chuyển đến bộ máy Golgi để lắp ráp virion. RNA của virus và protein cấu trúc N được sinh tổng hợp và tập hợp thành nucleocapsid trong tế bào chất, sau đó liên kết với các protein cấu trúc của virus để tạo ra virion mới.

Cuối cùng, các thể virus được giải phóng khỏi tế bào bị nhiễm thông qua quá trình ngoại bào [15]. ̀ h xâm nhập và vòng đời của SARS-CoV-2 [15] Hình 4: Quá trin 1.2 3-chymotrypsin like protease của SARS-CoV-2 1.1 Cấu trúc, chức năng và hoạt tính phân cắt cơ chất của 3-chymotrypsin-like protease 3CLpro của SARS-CoV-2 là một protein có 306 gốc acid amin với khối lượng phân tử (KLPT) là 33,8 kDa. Các nghiên cứu đã cho thấy trình tự gen 3CLpro của SARS-CoV-2 giống đến 96% với SARS-CoV, enzyme khá bảo thủ chỉ có 12 gốc acid amin khác biệt giữa SARS-CoV-2 và SARS-CoV [37]. Về cấu trúc, 3CLpro là một homodimer, mỗi monomer gồm 3 domain.

Cụ thể, Domain I và II có vai trò quan trọng mang bộ đôi bảo thủ His41và Cys145 của trung tâm hoạt động, trực tiếp gắn với cơ chất. Domain III có vai trò trong hình thành cấu trúc 6 1 dimer của 3CLpro, cùng với đó sự liên kết cộng hóa trị giữa đầu N và đầu C là một trong những điều kiện chính để hình thành cấu trúc này, đặc biệt là cầu nối giữa Arg4 và Arg298, từ đó quyết định enzyme có hoạt tính hay không [28, 43, 45]. Do đó, bất kỳ sai lệch nào của domain III tại đầu C cũng sẽ ảnh hưởng đến hoạt động của 3CLpro. Ví dụ đột biến R298A của SARS-CoV 3CLpro khiến domain III xoay 33° làm gián đoạn quá trình hình thành dimer và làm giảm hoạt động xúc tác [22].

Hình 5: Cấu trúc domain của 3CLpro [12] Chú thích: (a) cấu trúc 3 domain của 3CLpro. Domain I hiển thị màu vàng, domain II hiển thị màu xanh lá cây, domain III hiển thị màu hồng.