Tài liệu Y tế: Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao giàu saponin của

Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao giàu saponin từ sâm vũ diệp Panax bipinnatifidus Seem, đánh giá chất lượng dược liệu quý hiếm Việt Nam.

• Tác giả: Cao Thị Phương Thảo
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Hữu Tùng
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội, Khoa Y Dược
• Chuyên ngành: Dược học
• Đề tài: Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao giàu saponin của dược liệu Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.)
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp đại học
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Khái niệm về tiêu chuẩn cơ sở cao dược liệu

Tiêu chuẩn cơ sở cao dược liệu là tập hợp các yêu cầu kỹ thuật chi tiết được xây dựng để đánh giá chất lượng của các sản phẩm cao chiết từ dược liệu. Đây là nền tảng quan trọng trong ngành dược học, đặc biệt đối với các cao thuốc giàu các hoạt chất sinh học như saponin. Việc xây dựng tiêu chuẩn này giúp đảm bảo tính nhất quán, an toàn và hiệu quả của các sản phẩm dược phẩm. Các tiêu chuẩn cơ sở bao gồm các thông số vật lý, hóa học và vi sinh vật học, được áp dụng trong kiểm nghiệm dược liệu và sản phẩm cao chiết. Sâm Vũ Diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) là một dược liệu quý giá cần có tiêu chuẩn cơ sở cao để kiểm soát chất lượng sản phẩm.

1.1. Định nghĩa cao dược liệu và vai trò

Cao dược liệu (cao thuốc) là sản phẩm chiết xuất đặc biệt từ các bộ phận của thực vật chứa các hoạt chất sinh học. Cao giàu saponin từ Sâm Vũ Diệp có công dụng hỗ trợ sức khỏe, tăng cường miễn dịch và chống oxy hóa. Vai trò của cao dược liệu là cung cấp một dạng thuốc đậm đặc với hàm lượng hoạt chất cao hơn so với dược liệu thô.

1.2. Tầm quan trọng của tiêu chuẩn chất lượng cao

Tiêu chuẩn chất lượng cao đảm bảo các sản phẩm dược phẩm có độ mặn, độ ẩm, hàm lượng hoạt chất và tạp chất được kiểm soát chặt chẽ. Điều này giúp bảo vệ sức khỏe người dùng và nâng cao hiệu quả điều trị bằng các sản phẩm từ dược liệu thiên nhiên.

II. Các bước xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao

Quá trình xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao là một công tác khoa học phức tạp, yêu cầu sự kết hợp giữa kinh nghiệm thực tế và nghiên cứu thực nghiệm. Các bước chính bao gồm: (1) thu thập và xác định danh pháp thực vật của dược liệu Sâm Vũ Diệp; (2) phân tích thành phần hóa học chính, đặc biệt là saponin; (3) phát triển và xác thực phương pháp phân tích bằng HPLC (High Performance Liquid Chromatography); (4) đánh giá các chỉ tiêu vật lý hóa học như độ ẩm, tro toàn phần; (5) xác định hàm lượng hoạt chất chuẩn (stipuleanosid R2); (6) kiểm tra độ lặp lại, độ thu hồi và tuyến tính của phương pháp. Mỗi bước đòi hỏi sự cẩn thận và tuân thủ các quy chuẩn quốc tế.

2.1. Phân tích thành phần saponin chính trong Sâm Vũ Diệp

Sâm Vũ Diệp chứa nhiều saponin có tác dụng sinh học mạnh mẽ. Trong đó, stipuleanosid R2 là hoạt chất đại diện được sử dụng làm chất chuẩn để kiểm soát chất lượng. Việc xác định chính xác hàm lượng saponin giúp đảm bảo hiệu quả dược lý của sản phẩm cao chiết.

2.2. Phương pháp HPLC trong kiểm nghiệm

HPLC là kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao giúp tách chiết và định lượng các hoạt chất trong cao dược liệu. Phương pháp này cho phép phát hiện được những hợp chất saponin ở nồng độ thấp với độ chính xác cao, từ đó xác lập tiêu chuẩn cơ sở cao có độ tin cậy.

III. Các chỉ tiêu kiểm nghiệm trong tiêu chuẩn cơ sở

Tiêu chuẩn cơ sở cao bao gồm nhiều chỉ tiêu kiểm nghiệm quan trọng để đánh giá toàn diện chất lượng sản phẩm. Các chỉ tiêu này được chia thành hai nhóm chính: chỉ tiêu vật lý hóa học và chỉ tiêu vi sinh vật học. Chỉ tiêu vật lý hóa học bao gồm: (1) độ ẩm của cao khô, cần đạt dưới 10%; (2) tro toàn phần, phản ánh tạp chất khoáng; (3) hàm lượng hoạt chất được đo bằng HPLC với độ lệch chuẩn tương đối (RSD) không vượt quá 5%; (4) giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp phân tích. Chỉ tiêu vi sinh vật học kiểm tra sự hiện diện của vi khuẩn gây hại. Tất cả các chỉ tiêu này phải tuân theo Dược điển Việt Nam (ĐDVN) và các tiêu chuẩn quốc tế.

3.1. Chỉ tiêu độ ẩm và tro toàn phần

Độ ẩm là tỷ lệ nước trong cao dược liệu, ảnh hưởng đến độ ổn định và bảo quản. Tro toàn phần cho biết hàm lượng chất khoáng và tạp chất vô cơ. Cả hai chỉ tiêu này đều cần phải nằm trong các khoảng giá trị quy định để đảm bảo chất lượng cao dược liệu.

3.2. Chỉ tiêu hàm lượng hoạt chất và độ chính xác

Hàm lượng hoạt chất là chỉ tiêu quan trọng nhất, được xác định bằng HPLC với chất chuẩn stipuleanosid R2. Độ chính xác được đánh giá qua độ thu hồi, độ lặp lại và RSD. Các thông số này phải đáp ứng các yêu cầu khắt khe của tiêu chuẩn quốc tế.

IV. Ý nghĩa và ứng dụng của tiêu chuẩn cơ sở cao

Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao giàu saponin của Sâm Vũ Diệp mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn sâu sắc. Trên phương diện khoa học, nó giúp các nhà nghiên cứu hiểu rõ hơn về thành phần hóa học và tính chất của dược liệu quý, từ đó phát triển các sản phẩm mới với hiệu quả tối ưu. Trên phương diện y tế, tiêu chuẩn cơ sở đảm bảo an toàn cho bệnh nhân bằng cách kiểm soát chất lượng và hiệu quả của các sản phẩm dược phẩm. Trên phương diện thương mại, nó tạo niềm tin cho người tiêu dùng và các nhà phân phối khi sử dụng hoặc cung cấp sản phẩm cao dược liệu. Ngoài ra, việc xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao còn giúp bảo vệ quyền lợi của nhân dân bằng cách ngăn chặn sản xuất và tiêu thụ những sản phẩm giả, không đạt chất lượng. Điều này là bước đi quan trọng trong việc phát triển bền vững các dược liệu thiên nhiên Việt Nam.

4.1. Lợi ích trong kiểm soát chất lượng sản phẩm

Tiêu chuẩn cơ sở cao cung cấp các tiêu chí rõ ràng để kiểm soát chất lượng trong quá trình sản xuất và kiểm nghiệm. Nhà sản xuất có thể đảm bảo mỗi lô sản phẩm đều đạt các yêu cầu kỹ thuật nhất định. Người tiêu dùng và cơ quan y tế có thể tin tưởng vào độ an toàn và hiệu quả của cao dược liệu từ Sâm Vũ Diệp.

4.2. Vai trò trong phát triển dược liệu quốc gia

Sâm Vũ Diệp là dược liệu bản địa quý giá của vùng Tây Bắc. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao góp phần phát triển ngành dược liệu quốc gia, tạo ra các sản phẩm mang tính cạnh tranh trên thị trường quốc tế. Đây là bước tiến quan trọng trong việc khai thác và bảo tồn tài nguyên thiên nhiên một cách bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Tổng quan về dược liệu Sâm Vũ Diệp 1. Danh pháp Tên khoa học: Panax bipinnatifidus Seem. Tên khác: Ngật đáp thất, Tam thất hoang, Tam thất xẻ lá, Trúc tiết nhân sâm, Vũ diệp tam thất [4].

Phân bố và sinh thái Ở Việt Nam, SVD là loài sâm tự nhiên được phát hiện tương đối sớm [2], chúng chủ yếu phân bố ở Lai Châu (Tả Phình), Lào Cai (Sa Pa, Bát Xát, Than Uyên: núi Hoàng Liên Sơn) [14,16]. Gần đây, SVD đã được thuần hóa và bước đầu được trồng thử nghiệm ở một số địa phương như Hà Giang và Lào Cai [17]. Trên thế giới, SVD được phát hiện và định tên khoa học từ năm 1868. Cây phân bố ở một số quốc gia như Trung Quốc, Ấn Độ, Nêpan (vùng cận Himalaya) [2].

SVD là cây thảo ưa bóng và đặc biệt ưa ẩm, thường mọc rải rác hay tập trung (vài chục khóm) dưới tán rừng ẩm, gần như quanh năm có sương mù ở độ cao từ 1. SVD còn là cây ưa khí hậu ẩm mát, chúng có thể tồn tại và phát triển vững bền trong điều kiện khí hậu có nền nhiệt độ khá thấp qua nhiều thế hệ [2,4].) SVD sinh trưởng, phát triển mạnh trong mùa mưa ẩm. Mùa hoa thường rơi vào tháng 4-5, quả thường ra vào tháng 5-9 (10). Gieo giống tự nhiên từ hạt.

Quả chín chim thường ăn (bỏ hạt), hạt rơi xuống lại bị một loại sóc nâu nhỏ ăn nhân hạt. Thân rễ bị gãy hoặc khai thác mất phần già, phần đầu thân rễ (có chồi ngủ) còn lại vẫn có khả năng tái sinh. Toàn bộ phần thân mang lá tàn lụi vào mùa đông, đến đầu mùa xuân năm sau từ đầu mầm thân rễ sẽ mọc lên các chồi thân mới [4]. Đặc điểm thực vật Cây thảo, sống lâu năm, cao 0,3 – 0,5 m.

Thân rễ mập, vặn vẹo, phân nhánh, có nhiều đốt và những vết sẹo to do thân cây rụng để lại, đầu rễ có hình con quay. Chúng thường nằm ngang và nổi trên mặt đất, đường kính 1,5 – 3,5 cm. Phần thân mang lá mảnh, thường đơn độc, mọc thẳng, rỗng giữa, có vạch dọc, đường kính thân từ 0,3 – 0,6 cm. Lá kép chân vịt gồm 2 – 3 cái mọc vòng ở ngọn, lá chét 5 – 7 (ít khi 3), thuôn, dài 2,5 – 14 cm, rộng 1,5 – 4 cm, gốc tròn, dài thuôn thành mũi nhọn, xẻ thùy lông chim không đều, mép khía răng, có lông [2,4].

Cụm hoa mọc ở ngọn thân thành tán đơn. Hoa màu trắng lục hoặc vàng xanh; 5 cánh hoa; 5 nhị; bầu 2 - 3 ô. Quả mọng, hình cầu hơi dẹt, đường kính 0,6-1,2 cm, khi chín màu đỏ, có chàm đen to ở đầu. Hạt 2 – 3, hình cầu hoặc gần giống hạt đậu; màu xám trắng; vỏ cứng, có rốn hạt [2,4].1: Cây Sâm vũ diệp – Panax bipinnatifidus Seem.

Thành phần hóa học Năm 2002, Trần Công Luận và các cộng sự đã chỉ ra được 2 nhóm chất chính trong thân rễ của SVD là polyacetylen và saponin cùng với các acid béo, acid amin. Các saponin này sau đó được thủy phân và kết tinh phần sapogenin thu được acid oleanolic [13]. Như vậy, rễ SVD có thành phần chính là các saponin triterpen thuộc nhóm oleanan, bao gồm những chất như: chikusetsusaponin IV, zingibrosid R1, ginsenosid Ro, Rb1, Rd, Re, Rg1 và Rg2 [2,23]. Chikusetsusaponin IV Zingibrosid R1 Ginsenosid Ro Ginsenosid Rd 5 Buoc.) R1 R2 Ginsenosid Re Glc-Rha Glc Ginsenosid Rg1 Glc Glc Ginsenosid Rg2 Glc-Rha H Hình 1.2: Các thành phần hóa học trong SVD Trong số các saponin khung oleanan đã được tìm thấy thì hợp chất quan trọng nhất là Stipuleanosid R2 [29,32].3: Công thức của Stipuleanosid R2 Năm 2011, một nhóm nghiên cứu hợp tác của Việt Nam – Hàn Quốc cũng đã tiến hành một phân tích trên mẫu dịch chiết methanol từ rễ của SVD thu hái ở dãy núi Hoàng Liên Sơn, Việt Nam.

Kết quả đã phân lập thêm được 3 saponin loại oleanan mới là bifinoside A – C (1-3) trong tổng số 10 saponin có khung oleanan được phát hiện [29]. R1 R2 R3 R4 R5 1: Ara(p) H H Me H 2: H Xyl (1→ 6) glc H Me H 3: Xyl Ara(p) H Me Glc 4: H H Ara(p) Me H 5: H H H Me Glc 6: Xyl H H Me H 7: H Glc Ara(f) H H 8: Xyl H H Me Glc 9: Xyl Ara(p) H H Glc 10: H Glc Ara(f) Me Glc Me : methyl Ara(f) : α-L-arabinofuranosyl Ara(p) : α-L-arabinopyranosyl Glc : β-D-glucopyranosyl Xyl : β-D-xylopyranosyl Hình 1.4: 10 hợp chất saponin tách từ rễ của cây SVD 7 Buoc.) Năm 2017, một nhóm sinh viên nghiên cứu cũng đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa học của 3 hợp chất β-sitosterol, oleanolic acid và daucosterol từ phân đoạn ethyl acetat từ thân rễ SVD [9,10]. Tiến hành thí nghiệm trên lá SVD, một nhóm nghiên cứu Trung Quốc đã phân lập được 13 saponins có khung dammaran vào năm 1989, trong đó bao gồm ginsenoside F1, F2, F3, Rb, Rb3, Rd, Re, Rg2 [27]. Tác dụng dược lý Các thành phần chính trong rễ của SVD đã được chỉ ra có các tác dụng chính là gây động dục, hướng sinh dục, tăng sức dẻo dai của động vật thí nghiệm, tăng cường sức đề kháng chung của cơ thể [2,8].

Năm 2016, nhóm nghiên cứu Trung Quốc đã công bố SVD là một trong số những loài trong cơ sở dược liệu của Trung Quốc thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư [26]. Năm 2017, một nghiên cứu về SVD chỉ ra chúng có tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu trên in vitro ở các phân đoạn và các mức liều: phân đoạn tổng, phân đoạn n-butanol, phân đoạn ethylacetat có tác dụng ở các mức liều: 0,5 - 1 - 2 - 5 mg/mL, phân đoạn ether ở các mức liều 1-2-5 mg/mL [15]. Năm 2018, một nhóm nghiên cứu người Trung Quốc khác đã xác định SVD cũng có tác dụng cầm máu giống với nhiều loài sâm khác trong chi Panax [24]. Các nghiên cứu mới đây cũng chỉ ra SVD có khả năng ảnh hưởng đối với hệ thần kinh trung ương, có tác dụng chống stress [18,19], chống trầm cảm, có tác dụng bảo vệ gan và kích thích tăng miễn dịch [11,12].

Về độc tính cấp, SVD dùng đường uống có độ độc tính cấp rất thấp [2]. Công dụng SVD là nguồn gen đặc biệt quý hiếm của Việt Nam và thế giới. Tất cả các bộ phận của cây đều được sử dụng để làm thuốc. Thân rễ (củ) làm thuốc bổ huyết (nhất là cho phụ nữ sau sinh và người cao tuổi); cầm máu, tán ứ tiêu sưng; tăng cường sinh dục, chống stress.

Lá, thân, nụ hoa làm trà uống kích thích tiêu hóa, an thần và chữa bệnh thận. Ở Trung Quốc, SVD là thuốc chữa hư lao, thổ huyết, chảy máu cam, đòn ngã tổn thương. Tuy nhiên cho đến nay chưa tìm 8 Buoc.) thấy nghiên cứu nào ở cả Việt Nam và thế giới công bố về tác dụng sinh học của SVD chứng minh cho các công dụng này [2,4]. Tổng quan về thành phần Saponin [20,21] 1.

Khái niệm Saponin hay saponosid là một nhóm các glycoside với phần genin có cấu trúc triterpen hay steroid 27 carbon, gặp rộng rãi trong thực vật, cũng được tìm thấy trong động vật thân mềm như Hải sâm, Sao biển. Cấu trúc hóa học Cấu trúc của Saponin gồm có hai phần là phần đường và phần aglycon (hay genin) [30]. Phần aglycon thường được gọi là sapogenin, có cấu trúc triterpen với khung cơ bản 30 carbon hoặc steroid với 27 carbon dẫn xuất từ khung cholestan. Trên phần sapogenin thường gắn các nhóm thế hydroxyl (OH).

Nhóm OH này trong đa số trường hợp có định hướng β. Phần đường ở đa số saponin thường được gắn vào các nhóm OH ở trên. Với số lượng không nhiều của các sapogenin, sự đa dạng của các saponin chủ yếu là do thành phần, số lượng và vị trí của các đường trong phân tử. Phân loại Dựa theo cấu trúc hóa học của phần genin, người ta chia saponin là 2 nhóm lớn là saponin triterpenoid và saponin steroid.

a) Saponin triterpenoid - Saponin triterpenoid năm vòng: + Có phần sapogenin có khung 30 carbon với 5 vòng và 8 nhóm methyl. + Nhóm được phân làm 5 phân nhóm nhỏ: • Nhóm Oleanan • Nhóm Ursan Oleanan • Nhóm Taraxasteran 9 Buoc.) • Nhóm Lupan • Nhóm Hopan Ursan - Saponin triterpenoid bốn vòng: gồm 4 phân nhóm nhỏ là • Nhóm Dammaran • Nhóm Lanostan • Nhóm Tirucallan • Nhóm Cucurbitan Dammaran Lanostan Hình 1.5: Công thức của một số nhóm Saponin 10 Buoc.) Theo như các nghiên cứu, thành phần saponin chủ yếu được tìm thấy trong các cây thuộc họ nhân sâm thuộc nhóm Dammarane (bao gồm ginsenosides Rb1, Rb2, Re và Rg1) [25]. b) Saponin steroid Nhóm này có cấu trúc cơ bản là khung cholestan với 27 carbon trong đó mạch nhánh của khung steroid thường đóng vòng với dị tố oxy hay nitơ tạo thành một hay hai dị vòng là E (năm cạnh) và F (6 cạnh). Các saponin nhóm này ít có các nhóm thế trên khung, ngoại trừ nhóm OH C-3.

Sự khác biệt giữa các saponin chủ yếu là trên mạch nhánh để tạo nên các nhóm khác nhau. Saponin steroid được chia thành 2 phân nhóm là: - Saponin steroid thông thường: với dị tố trong vòng E và F chỉ là Oxy. - Saponin steroid alkaloid: với Nitơ trong phân tử. Tính chất của saponin Saponin thường là những chất vô định hình, không màu tới màu trắng ngà.

Đa số saponin có vị nhẫn đắng, ngoài ra vẫn có một số loại có vị ngọt. Saponin là những chất phân cực nên có thể tan trong các dung môi phân cực như các alcol, hỗn hợp cồn – nước, nước và các dung môi phân cực khác như dimethyl sulfoxid, dioxin, pyridine… Với saponin có mạch đường ngắn đến trung bình, butanol là một dung môi hòa tan tương đối chọn lọc. Với saponin có mạch đường dài có thể tan tốt trong nước. Saponin có những tính chất hết sức đặc trưng như: - Làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều khi lắc với nước.

- Khối lượng phân tử lớn nên khó bị thẩm tích. - Làm vỡ hồng cầu ngay ở những nồng độ rất loãng. - Độc với cá, diệt các loài thân mềm như giun, sán, ốc sên… - Kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt. - Có thể tạo phức với cholesterol hoặc với các chất 3β-hydroxysteroid khác.

Tuy nhiên, không phải tất cả các saponin đều thể hiện đầy đủ các tính chất trên. Kiểm nghiệm dược liệu chứa Saponin ✓ Dựa trên tính chất tạo bọt. ✓ Dựa trên tính chất phá huyết. ✓ Dựa trên độ độc đối với cá.

✓ Khả năng tạo phức với cholesterol. ✓ Các phản ứng màu. ✓ Sắc ký lớp mỏng. ✓ Xác định bằng quang phổ.

✓ Định lượng: Phương pháp cân, phương pháp đo quang, phương pháp sắc ký lỏng cao áp.