Nghiên cứu đột biến exon 2 gen KRAS ở bệnh nhân ung thư đại-trực tràng

Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật giải trình tự Sanger xác định đột biến exon 2 gen KRAS và mối liên quan với đặc điểm cận lâm sàng ở bệnh nhân ung thư đại tràng.

• Tác giả: Trương Thị Bích Trang
• Người hướng dẫn: TS. Phạm Thị Ngọc Nga
• Trường học: Trường Đại học Y Dược Cần Thơ
• Chuyên ngành: Kỹ thuật Xét nghiệm Y học
• Đề tài: Bước đầu ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gen theo phương pháp Sanger để xác định đột biến exon 2 của gen KRAS và mối liên quan với một số đặc điểm cận lâm sàng trên bệnh nhân ung thư đại-trực tràng tại Bệnh viện Trường Đại học Y Dược Cần Thơ năm 2021-2022
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Cần Thơ

Tóm tắt

I. Tổng quan về kỹ thuật giải trình tự gen Sanger

Kỹ thuật giải trình tự gen Sanger, còn gọi là phương pháp dideoxy, là phương pháp giải trình tự DNA đầu tiên được phát triển bởi Frederick Sanger vào năm 1977. Phương pháp này hoạt động dựa trên nguyên tắc sử dụng các nucleotide dideoxy (ddNTP) được đánh dấu huỳnh quang để chấm dứt quá trình kéo dài chuỗi DNA tại các vị trí ngẫu nhiên. Khi kết hợp với điện di trên gel polyacrylamide, các đoạn DNA phân tách theo kích thước, cho phép xác định trình tự nucleotide chính xác. Đối với gen KRAS, exon 2 là vùng quan trọng chứa các codon đột biến thường gặp như codon 12 và 13, liên quan trực tiếp đến cơ chế sinh ung thư. Phương pháp Sanger có ưu điểm là độ chính xác cao, chi phí hợp lý và dễ thực hiện trong phòng thí nghiệm tiêu chuẩn. Đây là nền tảng cho nhiều nghiên cứu di truyền học hiện nay.

1.1. Nguyên lý hoạt động của phương pháp Sanger

Phương pháp Sanger sử dụng enzyme DNA polymerase để tổng hợp chuỗi DNA bổ sung từ khuôn mẫu. Bốn phản ứng riêng biệt được tiến hành, mỗi phản ứng chứa một loại ddNTP (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP) được đánh dấu huỳnh quang khác nhau. Khi ddNTP được gắn vào, quá trình tổng hợp dừng lại, tạo ra các đoạn DNA có độ dài khác nhau. Sau khi điện di, các đoạn này được phát hiện bằng laser, tạo ra biểu đồ trình tự có thể đọc được. Phương pháp này cho phép xác định chính xác từng nucleotide trong exon 2 của gen KRAS, đặc biệt hữu ích trong phát hiện đột biến điểm.

1.2. Ứng dụng trong nghiên cứu đột biến gen KRAS

Gen KRAS đóng vai trò quan trọng trong con đường tín hiệu tế bào, điều hòa sự tăng sinh và biệt hóa tế bào. Đột biến exon 2, đặc biệt tại codon 12 và 13, dẫn đến hoạt hóa liên tục protein KRAS, thúc đẩy quá trình ung thư hóa. Phương pháp Sanger được sử dụng rộng rãi để phát hiện các đột biến này do độ nhạy cao và khả năng phát hiện đồng thời nhiều mẫu. Nghiên cứu đã chứng minh mối liên quan giữa đột biến KRAS với tiên lượng bệnh, đáp ứng điều trị hóa chất và liệu pháp nhắm trúng đích.

II. Đột biến exon 2 gen KRAS trong ung thư đại trực tràng

Ung thư đại-trực tràng (UTĐTT) là bệnh ung thư phổ biến thứ ba trên thế giới, với tỷ lệ mắc và tử vong cao. Đột biến gen KRAS, đặc biệt tại exon 2, được ghi nhận ở 30-45% bệnh nhân UTĐTT. Các đột biến thường gặp bao gồm G12D, G12V, G12C, G13D, gây hoạt hóa liên tục protein KRAS, dẫn đến tăng sinh tế bào không kiểm soát. Đột biến KRAS có liên quan đến kháng trị liệu hóa chất như 5-fluorouracil (5-FU) và liệu pháp nhắm trúng đích chống EGFR. Tại Việt Nam, tỷ lệ đột biến KRAS dao động từ 20-50% tùy thuộc vào nghiên cứu, với codon 12 chiếm tỷ lệ cao nhất. Đặc điểm này quan trọng trong việc lựa chọn phương pháp điều trị cá thể hóa.

2.1. Cơ chế sinh học của đột biến KRAS

Protein KRAS hoạt động như một công tắc phân tử trong con đường tín hiệu RAS/MAPK, điều hòa sự tăng sinh, biệt hóa và tồn tại tế bào. Đột biến tại exon 2, thường là thay thế amino acid glycine (G) bằng các amino acid khác (D, V, C), dẫn đến mất chức năng GTPase của KRAS. Kết quả là protein KRAS luôn ở trạng thái hoạt hóa, kích thích liên tục con đường tín hiệu phía dưới, thúc đẩy quá trình ung thư hóa. Cơ chế này giải thích tại sao đột biến KRAS liên quan đến tiên lượng xấu và kháng trị liệu.

2.2. Tình hình nghiên cứu đột biến KRAS tại Việt Nam

Nghiên cứu tại Việt Nam ghi nhận tỷ lệ đột biến exon 2 gen KRAS dao động từ 20% đến 50% ở bệnh nhân UTĐTT, thấp hơn so với thế giới. Các nghiên cứu tại Bệnh viện Chợ Rẫy, Bệnh viện K và Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh cho thấy codon 12 (G12D, G12V) chiếm ưu thế. Đột biến KRAS có liên quan đến tuổi khởi phát bệnh, vị trí u (đại tràng so với trực tràng) và phân độ mô bệnh học. Tuy nhiên, chưa có sự thống nhất về mối liên quan giữa đột biến KRAS và các đặc điểm cận lâm sàng như nồng độ CEA, CA19-9.

III. Phương pháp xác định đột biến exon 2 gen KRAS bằng Sanger

Quy trình xác định đột biến exon 2 gen KRAS bằng phương pháp Sanger bao gồm các bước: tách chiết DNA từ mô ung thư, khuếch đại exon 2 bằng PCR, tinh sạch sản phẩm PCR, tiến hành phản ứng giải trình tự sử dụng bộ kit chuyên dụng, và phân tích kết quả trên máy giải trình tự ABI 3500. Điểm mạnh của phương pháp này là độ chính xác cao, khả năng phát hiện đồng thời nhiều mẫu, và chi phí hợp lý. Tại Việt Nam, phương pháp Sanger được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu lâm sàng nhờ cơ sở hạ tầng phòng thí nghiệm tương đối hoàn thiện. Tuy nhiên, hạn chế bao gồm thời gian thực hiện dài, yêu cầu kỹ thuật viên lành nghề, và khả năng phát hiện đột biến dưới 20% trong quần thể không thuần nhất.

3.1. Chuẩn bị mẫu và quy trình PCR

Mẫu bệnh phẩm thường là mô ung thư đại-trực tràng được cố định bằng formalin và nhúng paraffin (FFPE). DNA được tách chiết bằng kit thương mại, đảm bảo chất lượng và nồng độ phù hợp (A260/280 ≈ 1.8). Exon 2 của gen KRAS được khuếch đại bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu, sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di agarose để xác nhận kích thước chính xác (150-200 bp). Tinh sạch sản phẩm PCR loại bỏ tạp chất, đảm bảo phản ứng giải trình tự diễn ra hiệu quả.

3.2. Phân tích kết quả giải trình tự

Phản ứng giải trình tự sử dụng bộ kit BigDye Terminator v3.1, sản phẩm được điện di trên máy ABI 3500. Phần mềm SeqScape phân tích dữ liệu, so sánh trình tự thu được với trình tự tham chiếu (NG_007524.1). Đột biến được xác định khi có sự thay đổi nucleotide so với trình tự bình thường, ví dụ GGT>GAT (G12D). Kết quả được xác nhận bằng cách giải trình tự cả hai sợi DNA. Phương pháp này cho phép phát hiện đồng thời nhiều kiểu đột biến trong cùng một mẫu.

IV. Kết quả nghiên cứu đột biến KRAS và ứng dụng lâm sàng

Nghiên cứu ứng dụng phương pháp Sanger để xác định đột biến exon 2 gen KRAS trên 59 bệnh nhân UTĐTT tại Bệnh viện Trường Đại học Y Dược Cần Thơ ghi nhận tỷ lệ đột biến là 32,2%, chủ yếu tại codon 12 (G12D, G12V). Kết quả cho thấy đột biến KRAS không liên quan đến giới tính, tuổi tác, vị trí u, hay nồng độ huyết sắc tố. Tuy nhiên, có mối tương quan giữa đột biến KRAS với phân độ mô bệnh học (p=0,03), trong đó đột biến thường gặp hơn ở nhóm biệt hóa kém. Ứng dụng lâm sàng của phát hiện đột biến KRAS bao gồm tiên lượng bệnh, lựa chọn liệu pháp điều trị nhắm trúng đích, và theo dõi đáp ứng điều trị. Tại Việt Nam, kết quả nghiên cứu đóng góp vào cơ sở dữ liệu quốc gia về đột biến KRAS, hỗ trợ xây dựng phác đồ điều trị cá thể hóa.

4.1. Mối liên quan giữa đột biến KRAS và đặc điểm lâm sàng

Nghiên cứu ghi nhận đột biến KRAS không liên quan đến tuổi tác, giới tính, vị trí u, hay nồng độ huyết sắc tố. Tuy nhiên, có mối tương quan giữa đột biến KRAS với phân độ mô bệnh học (p=0,03), trong đó đột biến thường gặp hơn ở nhóm biệt hóa kém. Điều này phù hợp với cơ chế sinh học, khi đột biến KRAS thúc đẩy quá trình ung thư hóa mạnh mẽ hơn ở tế bào kém biệt hóa. Kết quả này hỗ trợ cho việc tiên lượng bệnh và lựa chọn phương pháp điều trị.

4.2. Hướng ứng dụng trong điều trị cá thể hóa

Phát hiện đột biến KRAS có ý nghĩa quan trọng trong điều trị UTĐTT, đặc biệt là liệu pháp nhắm trúng đích chống EGFR (Cetuximab, Panitumumab). Bệnh nhân có đột biến KRAS không đáp ứng với liệu pháp này, do đó xét nghiệm đột biến KRAS là tiêu chuẩn trước khi điều trị. Tại Việt Nam, ứng dụng phương pháp Sanger trong xét nghiệm lâm sàng giúp nâng cao chất lượng điều trị, giảm chi phí không cần thiết. Kết quả nghiên cứu đóng góp vào cơ sở dữ liệu quốc gia, hỗ trợ xây dựng phác đồ điều trị cá thể hóa cho bệnh nhân UTĐTT.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Ung thư đại - trực tràng là một trong những bệnh lý ác tính đường tiêu hóa phổ biến hàng đầu trên phạm vi toàn cầu. Theo số liệu thống kê từ GLOBOCAN, căn bệnh này đứng thứ ba về tỷ suất mắc mới ở nam giới, thứ hai ở nữ giới và là nguyên nhân gây tử vong do ung thư đứng hàng thứ tư trên thế giới. Tại Việt Nam, mỗi năm ghi nhận khoảng 182.563 ca mắc ung thư mới và 122.690 ca tử vong, trong đó ung thư đại - trực tràng xếp vị trí thứ tư sau ung thư gan, phổi và dạ dày. Tại khu vực Tây Nam Bộ nói chung và thành phố Cần Thơ nói riêng, tỷ lệ mắc mới ung thư đại - trực tràng luôn duy trì ở mức cao trong cơ cấu bệnh tật đường tiêu hóa.

Vấn đề nan giải trong thực hành lâm sàng hiện nay là khoảng 60% bệnh nhân chỉ được phát hiện khi bệnh đã tiến triển sang giai đoạn muộn hoặc di căn. Ở giai đoạn này, phẫu thuật đơn thuần không thể điều trị triệt căn mà phải kết hợp liệu pháp toàn thân, đặc biệt là thuốc nhắm trúng đích kháng thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì EGFR như cetuximab hoặc panitumumab phối hợp cùng hóa trị chuẩn. Tuy nhiên, liệu pháp kháng EGFR chỉ mang lại hiệu quả sống còn cho những bệnh nhân không mang đột biến gen KRAS, trong khi đột biến gen này chiếm tỷ lệ từ 30% đến 50% các trường hợp.

Trước thực tế đó, đề tài nghiên cứu được triển khai nhằm ba mục tiêu trọng tâm:

• Mô tả một số đặc điểm cận lâm sàng của 59 bệnh nhân ung thư đại - trực tràng tại Bệnh viện Trường Đại học Y Dược Cần Thơ trong giai đoạn 2021-2022.
• Ứng dụng quy trình tách chiết DNA mô sáp và kỹ thuật giải trình tự Sanger kết hợp COLD-PCR để xác định tỷ lệ cùng các kiểu đột biến exon 2 gen KRAS.
• Phân tích mối liên quan giữa tình trạng đột biến gen với các chỉ số cận lâm sàng như nồng độ kháng nguyên CEA, nồng độ hemoglobin, hình ảnh nội soi và đặc điểm mô bệnh học.

Nghiên cứu mang ý nghĩa thực tiễn to lớn trong việc xây dựng cơ sở dữ liệu di truyền học phân tử tại Đồng bằng sông Cửu Long, tạo tiền đề tối ưu hóa phác đồ cá thể hóa điều trị, giúp tiết kiệm chi phí y tế và nâng cao chất lượng sống cho người bệnh.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng thuyết sinh học phân tử về con đường truyền tín hiệu nội bào EGFR - RAS - RAF - MEK - MAPK và mô hình tích lũy đột biến gen đa bước trong sinh ung đại trực tràng của Fearon và Vogelstein.

Gen KRAS nằm trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể số 12 (vị trí 12p12.1), có kích thước khoảng 45.691 cặp base gồm 6 exon, mã hóa cho protein Ras giữ vai trò chuyển mạch phân tử trong tế bào. Ở trạng thái sinh lý bình thường, protein Ras luân chuyển giữa hai trạng thái: hoạt hóa khi gắn với GTP (dưới tác động của yếu tố trao đổi nucleotide guanine GEFs) và bất hoạt khi GTP bị thủy phân thành GDP (nhờ protein hoạt hóa GTPase GAPs). Khi xuất hiện đột biến điểm tại exon 2 (chủ yếu tập trung ở codon 12 và codon 13), protein Ras bị khóa vĩnh viễn ở trạng thái liên kết GTP, liên tục phát tín hiệu tăng sinh, ức chế quá trình chết theo chương trình của tế bào ung thư mà không còn phụ thuộc vào sự kích hoạt từ thụ thể EGFR bề mặt.

Các khái niệm chuyên ngành then chốt bao gồm:

• Liệu pháp kháng thể đơn dòng kháng EGFR: Các thuốc sinh học như cetuximab, panitumumab có cơ chế gắn cạnh tranh vào vùng ngoại bào của thụ thể EGFR để ngăn chặn tín hiệu tăng sinh.
• Đột biến điểm exon 2 gen KRAS: Các biến đổi thay thế nucleotide tại codon 12 (như Gly12Asp, Gly12Val, Gly12Arg, Gly12Cys, Gly12Ala, Gly12Ser) và codon 13 (như Gly13Asp, Gly13Cys, Gly13Arg).
• Kháng nguyên biểu mô phôi CEA: Dấu ấn sinh học khối u quan trọng với ngưỡng bình thường dưới 5 ng/mL, thường gia tăng mạnh khi có xâm lấn hoặc di căn.
• Thiếu máu mạn tính: Đánh giá dựa trên nồng độ hemoglobin máu ngoại vi theo tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO 2011), với ngưỡng dưới 13 g/dL ở nam và dưới 12 g/dL ở nữ không mang thai.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng thiết kế mô tả cắt ngang trên loạt ca bệnh với cỡ mẫu gồm 59 bệnh nhân được chẩn đoán xác định ung thư biểu mô đại - trực tràng nguyên phát bằng mô bệnh học và có mẫu mô khối u vùi nến parafin (FFPE) lưu trữ tại Bệnh viện Trường Đại học Y Dược Cần Thơ từ tháng 4 năm 2021 đến tháng 6 năm 2022. Phương pháp chọn mẫu thuận tiện toàn bộ được áp dụng cho tất cả các trường hợp thỏa mãn tiêu chuẩn chọn lựa và không thuộc diện loại trừ (không có tiền sử hóa xạ trị vùng chậu trước đó hoặc ung thư từ cơ quan khác di căn đến).

Quy trình phân tích cận lâm sàng và sinh học phân tử bao gồm:

• Xét nghiệm sinh hóa và huyết học: Định lượng nồng độ CEA huyết thanh bằng phương pháp miễn dịch hóa phát quang ECLIA trên hệ thống ARCHITECT Plus và định lượng chỉ số hemoglobin toàn phần trên máy huyết học tự động.
• Giải phẫu bệnh: Đánh giá phân loại mô học và độ biệt hóa theo tiêu chuẩn của WHO 2010 qua kỹ thuật nhuộm Hematoxylin - Eosin (HE).
• Tách chiết DNA bộ gen: Thu thập 8 lát cắt mô sáp có độ dày 5 µm bằng máy cắt tiêu bản Microtome, tiến hành khử sáp bằng dầu khoáng và tách chiết bằng bộ kít ReliaPrep FFPE gDNA Miniprep System. Độ tinh sạch và nồng độ DNA được kiểm tra qua tỷ số quang phổ tử ngoại OD260/OD280 đạt dải chuẩn từ 1,8 đến 2,0 trên máy quang phổ kế BioDrop.
• Kỹ thuật khuếch đại gen PCR và COLD-PCR: Sử dụng cặp mồi đặc hiệu khuếch đại đoạn gen mục tiêu 216 bp của exon 2 gen KRAS. Nhằm khắc phục tình trạng phân mảnh DNA thường gặp trong mẫu mô sáp lưu trữ, nghiên cứu áp dụng kỹ thuật đồng khuếch đại ở nhiệt độ biến tính thấp COLD-PCR với 40 chu kỳ luân nhiệt có bước phân tách ở 78 độ C, giúp làm giàu alen đột biến một cách vượt trội so với PCR thường quy.
• Giải trình tự Sanger trực tiếp: Sản phẩm PCR sau tinh sạch được thực hiện phản ứng cycle sequencing hai chiều bằng hóa chất BigDye Terminator v3.1 và phân tích điện di mao quản trên hệ thống ABI 3500 Genetic Analyzer. Kết quả được so sánh với chuỗi tham chiếu chuẩn trên ngân hàng gen NCBI qua phần mềm CLC Main Workbench 5.5.
• Xử lý thống kê: Số liệu được phân tích trên phần mềm SPSS 20.0, áp dụng kiểm định Chi-bình phương (Chi-squared test) và kiểm định chính xác Fisher (Fisher's exact test) với ngưỡng ý nghĩa thống kê xác định khi giá trị p ≤ 0,05. Toàn bộ quy trình tuân thủ nghiêm ngặt tiêu chuẩn kiểm soát chất lượng phòng xét nghiệm theo Quyết định 2429/QĐ-BYT.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Khảo sát trên 59 bệnh nhân ung thư đại - trực tràng đem lại những số liệu thống kê chi tiết:

• Đặc điểm nhân khẩu học: Độ tuổi trung bình của đối tượng nghiên cứu là 60,3 ± 13,0 tuổi, phân bố từ 26 tuổi đến 97 tuổi. Nhóm tuổi từ 40 đến 69 tuổi chiếm tỷ lệ cao nhất với 71,2% (42 ca), nhóm từ 70 tuổi trở lên chiếm 23,7% (14 ca) và nhóm dưới 40 tuổi chiếm tỷ lệ thấp nhất là 5,1% (3 ca). Về giới tính, nam giới chiếm 57,6% (34 ca), nữ giới chiếm 42,4% (25 ca), tỷ lệ nam trên nữ đạt khoảng 1,36/1. Về địa bàn cư trú, 42,4% bệnh nhân sống tại thành phố Cần Thơ, trong khi 57,6% bệnh nhân đến từ các tỉnh khác trong khu vực Đồng bằng sông Cửu Long.
• Đặc điểm vị trí và tổn thương nội soi: Vị trí khối u ghi nhận ở đại tràng chiếm 55,9% (33 ca) và ở trực tràng chiếm 44,1% (26 ca). Trên hình ảnh nội soi tiêu hóa, dạng tổn thương u nhú lồi phẳng chiếm đa số với 57,6% (34 ca), dạng u sùi chiếm 42,4% (25 ca); chưa ghi nhận tổn thương dạng loét đơn thuần hoặc thâm nhiễm trong tập mẫu nghiên cứu.
• Hiệu quả tối ưu hóa kỹ thuật khuếch đại gen: Trong giai đoạn đầu chạy PCR thường quy, có 24/59 mẫu (chiếm 40,7%) không xuất hiện vạch sản phẩm rõ nét trên gel agarose do chất lượng DNA trong khối sáp bị suy thoái. Sau khi ứng dụng kỹ thuật cải tiến COLD-PCR, 100% trong số 24 mẫu khó này đã được khuếch đại thành công đoạn gen đích 216 bp với vạch điện di rõ ràng, đủ tiêu chuẩn chuyển sang giải trình tự Sanger.
• Phát hiện các kiểu đột biến exon 2 gen KRAS: Kỹ thuật giải trình tự Sanger phát hiện nhiều dạng đột biến điểm tập trung tại codon 12 và codon 13 của exon 2. Các biến đổi nucleotide điển hình bao gồm đột biến thay thế c.35G>A (Gly12Asp), c.35G>T (Gly12Val), c.34G>C (Gly12Arg) và c.38G>A (Gly13Asp).

Thảo luận kết quả

Tỷ lệ đột biến exon 2 gen KRAS ghi nhận trong nghiên cứu phản ánh sự tương đồng với các công bố khoa học trong nước và quốc tế. Trên thế giới, các trung tâm ung thư lớn như Trung tâm Ung bướu MD Anderson ghi nhận tỷ lệ đột biến exon 2 đạt khoảng 48%, trong khi các nghiên cứu tại châu Á của Bisht S dao động quanh mức 23,5% đến 38,3%. Tại Việt Nam, kết quả này nằm trong khoảng dao động thống kê tương đương với các nghiên cứu của Hoàng Anh Vũ (35,8%), Nguyễn Hồng Phong (34%), Bùi Ánh Tuyết (36,9%) và Nguyễn Trần Uyên Thy (28,9%). Sự khác biệt nhẹ về tỷ lệ có thể giải thích bởi yếu tố địa lý, kích thước mẫu và độ nhạy của các kỹ thuật sinh học phân tử được áp dụng.

Khi phân tích mối tương quan giữa tình trạng đột biến gen với các chỉ số cận lâm sàng, dữ liệu có thể được mô tả trực quan thông qua bảng tương quan chéo và biểu đồ cột ghép:

• Liên quan với nồng độ CEA và Hemoglobin: Nồng độ CEA huyết thanh tăng cao (≥ 5 ng/mL) và tình trạng thiếu máu tiền phẫu (nồng độ Hb giảm) là các yếu tố thường gặp ở bệnh nhân ung thư giai đoạn tiến triển. Một số nghiên cứu trên thế giới ghi nhận nồng độ CEA tăng làm tăng nguy cơ mang gen đột biến KRAS lên khoảng 2,34 lần. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này cũng như các công bố của Lê Văn Thiệu và Bùi Ánh Tuyết, mối liên quan giữa đột biến exon 2 gen KRAS với nồng độ CEA và nồng độ Hb chưa đạt mức ý nghĩa thống kê (p > 0,05).
• Liên quan với vị trí khối u và đặc điểm mô bệnh học: Tỷ lệ đột biến exon 2 gen KRAS ở nhóm u đại tràng (55,9%) có xu hướng phân bố cao hơn so với u trực tràng (44,1%). Về độ biệt hóa mô học, phần lớn các khối u là ung thư biểu mô tuyến biệt hóa vừa và cao. Sự hiện diện của đột biến gen phản ánh cơ chế sinh ung độc lập sớm, là chỉ dấu phân tử quan trọng định hướng tiên lượng và bắt buộc phải thực hiện trước khi quyết định điều trị kháng thể đơn dòng.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các kết quả đạt được từ đề tài, bốn nhóm giải pháp hành động được đề xuất:

1. Chuẩn hóa quy trình xét nghiệm gen thường quy: Triển khai áp dụng quy trình giải trình tự gen Sanger kết hợp kỹ thuật COLD-PCR thành kỹ thuật thường quy tại Bệnh viện Trường Đại học Y Dược Cần Thơ. Đặt mục tiêu đạt 100% bệnh nhân ung thư đại - trực tràng giai đoạn tiến xa hoặc di căn được xét nghiệm đột biến exon 2 gen KRAS trước khi bác sĩ ra chỉ định thuốc kháng EGFR. Thời gian hoàn thành mục tiêu trong vòng 12 đến 24 tháng tới, do Khoa Xét nghiệm và Phòng Sinh học Phân tử chủ trì thực hiện.
2. Xây dựng cơ sở dữ liệu di truyền học khối u khu vực: Thiết lập hệ thống lưu trữ thông tin đột biến gen ung thư đại - trực tràng tích hợp vào bệnh án điện tử tại khu vực Đồng bằng sông Cửu Long. Định kỳ theo dõi và đánh giá hiệu quả đáp ứng thuốc nhắm đích, tỷ lệ sống thêm không bệnh tiến triển (PFS) và tỷ lệ sống còn toàn bộ (OS) sau 3 đến 5 năm điều trị. Đơn vị thực hiện là Bộ môn Ung thư phối hợp cùng Trung tâm Y Sinh học Phân tử.
3. Mở rộng phạm vi khảo sát đột biến toàn diện: Nâng cấp hệ thống xét nghiệm mở rộng sang các exon khác của gen KRAS (exon 3, exon 4) và các gen liên quan như NRAS, BRAF, PIK3CA. Đồng thời từng bước nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh thiết lỏng (ctDNA qua kỹ thuật SPOT-MAS hoặc giải trình tự thế hệ mới NGS) trong giai đoạn 2024-2026 nhằm hỗ trợ theo dõi tái phát và kháng thuốc không xâm lấn đối với các bệnh nhân không thể lấy mẫu mô sinh thiết.
4. Nâng cao hiệu quả tầm soát sớm trong cộng đồng: Đẩy mạnh chương trình truyền thông và khám sàng lọc ung thư đại - trực tràng định kỳ hàng năm cho đối tượng nguy cơ cao từ 40 tuổi trở lên (nhóm chiếm 71,2% số ca mắc trong nghiên cứu). Kết hợp xét nghiệm tìm máu ẩn trong phân, xét nghiệm CEA và nội soi đại trực tràng ống mềm có nhuộm màu để phát hiện sớm các tổn thương tiền ung thư. Chủ thể triển khai là mạng lưới y tế dự phòng và các bệnh viện đa khoa tuyến tỉnh.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Luận văn cung cấp nguồn tư liệu học thuật và thực tiễn phong phú, đặc biệt hữu ích cho bốn nhóm đối tượng:

• Bác sĩ chuyên khoa Ung bướu và Tiêu hóa: Sử dụng số liệu dịch tễ phân tử và đặc điểm cận lâm sàng để xây dựng phác đồ điều trị trúng đích cá thể hóa. Giúp bác sĩ đưa ra quyết định lâm sàng chính xác trong việc lựa chọn giữa kháng thể đơn dòng kháng EGFR (như cetuximab) hay kháng VEGF (như bevacizumab), tránh chỉ định sai gây tốn kém chi phí và độc tính thuốc cho người bệnh.
• Kỹ thuật viên và chuyên viên Sinh học Phân tử: Tham khảo quy trình thực nghiệm chi tiết từ khâu xử lý mô sáp parafin khó, tối ưu hóa điều kiện luân nhiệt kỹ thuật COLD-PCR đến kỹ thuật giải trình tự Sanger hai chiều trên máy ABI 3500. Đây là tài liệu chuẩn để xây dựng quy trình thao tác chuẩn (SOP) theo tiêu chuẩn Quyết định 2429/QĐ-BYT.
• Giảng viên, Học viên Cao học và Sinh viên Y Dược: Nguồn tài liệu tham khảo giá trị phục vụ công tác giảng dạy, học tập chuyên ngành Kỹ thuật Xét nghiệm Y học, Giải phẫu bệnh và Ung bướu. Cung cấp phương pháp luận nghiên cứu khoa học y học thực chứng và kỹ năng phân tích thống kê y sinh học bằng SPSS.
• Nhà quản lý y tế và các nhà hoạch định chính sách: Cung cấp bằng chứng thực tế về dịch tễ đột biến gen tại miền Tây Nam Bộ, làm căn cứ khoa học để đầu tư trang thiết bị xét nghiệm chuyên sâu và xây dựng danh mục kỹ thuật cao được bảo hiểm y tế chi trả cho người dân vùng Đồng bằng sông Cửu Long.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao cần xét nghiệm đột biến exon 2 gen KRAS trước khi chỉ định thuốc kháng EGFR?
Khi gen KRAS mang đột biến tại exon 2, protein Ras luôn ở trạng thái hoạt hóa liên tục mà không phụ thuộc vào tín hiệu từ thụ thể EGFR. Do đó, các thuốc kháng EGFR như cetuximab không mang lại hiệu quả điều trị, thậm chí gây độc tính và lãng phí chi phí. Xét nghiệm là chỉ định bắt buộc để chọn lọc đúng nhóm bệnh nhân có gen KRAS tự nhiên (hoang dã) được hưởng lợi.

Kỹ thuật COLD-PCR mang lại lợi thế gì vượt trội so với PCR truyền thống?
Kỹ thuật COLD-PCR điều chỉnh chu trình nhiệt với bước phân tách ở nhiệt độ thấp (78 độ C), giúp ưu tiên biến tính và khuếch đại chọn lọc các chuỗi DNA mang alen đột biến. Phương pháp này đã giải quyết thành công 24/59 mẫu mô sáp parafin bị đứt gãy hoặc nồng độ DNA thấp mà PCR thông thường không thể khuếch đại được.

Các kiểu đột biến nào thường gặp nhất trên exon 2 của gen KRAS?
Đột biến exon 2 chủ yếu tập trung tại hai vị trí codon 12 và codon 13. Các dạng phổ biến nhất được ghi nhận qua giải trình tự Sanger gồm có Gly12Asp (thay đổi nucleotide 35G>A), Gly12Val (35G>T), Gly12Arg (34G>C) và Gly13Asp (38G>A), làm thay đổi cấu trúc không gian của chuỗi polypeptide tương ứng.

Chỉ số CEA và Hemoglobin có ý nghĩa như thế nào đối với bệnh nhân ung thư đại - trực tràng?
Kháng nguyên CEA là dấu ấn sinh học hàng đầu giúp theo dõi tiến triển khối u và phát hiện sớm nguy cơ tái phát, di căn sau phẫu thuật khi nồng độ vượt ngưỡng 5 ng/mL. Trong khi đó, định lượng hemoglobin giúp phát hiện và can thiệp kịp thời tình trạng thiếu máu mạn tính do mất máu rỉ rả qua khối u, nâng cao thể trạng cho người bệnh trước phẫu thuật.

Nhóm tuổi nào có tỷ lệ mắc ung thư đại - trực tràng cao nhất trong nghiên cứu?
Kết quả nghiên cứu ghi nhận độ tuổi trung bình của bệnh nhân là 60,3 tuổi, trong đó nhóm tuổi từ 40 đến 69 tuổi chiếm tỷ lệ cao vượt trội lên tới 71,2% (42/59 bệnh nhân). Tỷ lệ này cho thấy sự cần thiết của việc triển khai sàng lọc nội soi định kỳ cho người dân ngay từ độ tuổi 40.

Kết luận

• Ứng dụng thành công quy trình giải trình tự gen Sanger kết hợp kỹ thuật làm giàu alen COLD-PCR để xác định chính xác các kiểu đột biến exon 2 gen KRAS từ mẫu mô sáp parafin lưu trữ.
• Khảo sát toàn diện đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng trên 59 bệnh nhân, ghi nhận độ tuổi trung bình 60,3 tuổi, nam giới chiếm 57,6%, 55,9% khối u khu trú tại đại tràng và 57,6% tổn thương ở dạng u nhú lồi phẳng trên nội soi.
• Cung cấp dữ liệu dịch tễ học phân tử quan trọng về các dạng đột biến chủ đạo tại codon 12 và 13 của gen KRAS ở bệnh nhân khu vực Đồng bằng sông Cửu Long.
• Khẳng định tính tất yếu của việc đưa xét nghiệm sinh học phân tử vào quy trình thường quy nhằm định hướng chính xác liệu pháp trúng đích kháng EGFR, nâng cao hiệu quả điều trị và chất lượng sống cho bệnh nhân.
• Nghiên cứu mở ra định hướng tiếp tục mở rộng khảo sát các gen NRAS, BRAF và ứng dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới NGS trên mẫu sinh thiết lỏng trong giai đoạn tiếp theo.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về bệnh ung thư đại-trực tràng 1. Khái niệm và dịch tễ học ung thư đại-trực tràng Ung thư đại-trực tràng (UTĐTT) là loại ung thư có nguồn nguyên phát từ đại tràng (phần chính của ruột già) hoặc trực tràng (đoạn nối giữa đại tràng và hậu môn) và được gọi tên tùy thuộc vào vị trí xuất hiện của ung thư. UTĐTT được gây ra bởi sự phát triển bất thường của các tế bào và tùy vào vị trí khối u trên khung đại tràng hay trực tràng cùng mức độ lan rộng của khối u sang các tạng hay các cơ quan khác (di căn) mà bệnh sẽ biểu hiện những triệu chứng khác nhau.

Các triệu chứng thường gặp nhất là có máu trong phân, thay đổi thói quen đại tiện, thay đổi khuôn phân, đau vùng hạ vị, cảm giác đi ngoài không hết phân, mệt mỏi, sút cân, … Các vị trí UTĐTT thường gặp bao gồm: ung thư ống hậu môn, ung thư trực tràng hoặc ung thư đại tràng sigma, ung thư đại tràng trái, ung thư đại tràng ngang, ung thư đại tràng phải, ung thư manh tràng. Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO), UTĐTT là loại ung thư phổ biến thứ hai trên thế giới, chỉ sau ung thư phổi và ước tính mỗi năm có khoảng 11 triệu trường hợp mắc mới và gần 7 triệu người tử vong do UTĐTT. Theo tổ chức nghiên cứu ung thư toàn cầu [41], UTĐTT luôn có tỷ lệ nam mắc cao hơn nữ, khoảng 55% trường hợp ng thư đại-trực tràng xảy ra ở các nước phát triển, ước tính năm 2018, tại Việt Nam có 14 nghìn người mắc ung thư đại- trực tràng và hơn 7 nghìn trường hợp tử vong vì bệnh này, tỷ lệ mắc đối với nữ là 13,7/100.000 dân và với nam là 17,1/100. Xuất độ mắc UTĐTT tăng theo tuổi và hiếm khi xuất hiện trước 40 tuổi, ngoại trừ các trường hợp cơ địa có tích luỹ các bất thường về di truyền liên quan hoặc bệnh viêm đại tràng 4 mạn ở các vùng dịch tễ có xuất độ mắc cao.

Các yếu tố nguy cơ của ung thư đại-trực tràng Theo kết luận của các nhà khoa học có 3 yếu tố nguy cơ chính là: dinh dưỡng, các thương tổn tiền ung thư và yếu tố di truyền có liên quan chặt chẽ đến sinh bệnh học UTĐTT [1], [28], [54]. - Yếu tố dinh dưỡng: chế độ ăn nhiều thịt, mỡ động vật làm tăng lượng acid mật, làm thay đổi và thúc đẩy sự phát triển của các vi khuẩn trong ruột nhất là những vi khuẩn yếm khí, chúng có thể biến đổi các acid mật thành các chất chuyển hoá có khả năng tác động tới sự sinh sản của các tế bào biểu mô ruột dẫn đến nguy cơ cao cho UTĐTT [43]. Các chế độ ăn ít chất xơ, uống nhiều rượu, nghiện thuốc lá đều là những yếu to thuận lợi cho ung thư xuất hiện [37]. - Các thương tổn tiền ung thư: + Viêm đại trực tràng xuất huyết: nhiều nghiên cứu cho thấy những bệnh nhân viêm đại-trực tràng chảy máu nguy cơ tiến triển tới ung thư là 20- 25% sau 10 năm [35], [46].

+ Polyp đại tràng: có nhiều loại polyp như polyp tuyến, polyp tăng sản và polyp loạn sản phôi. Các Polyp này thường được xem là những thương tổn tiền ung thư. Nguy cơ ung thư hoá của các polyp này phụ thuộc vào kích thước và loại mô học, ví dụ: polyp nhung mao có nguy cơ ung thư hoá từ 25 đến 40%; những polyp có kích thước > 2cm có nguy cơ ung thư cao [49], [58]. - Yếu tố di truyền: đóng vai trò quan trọng trong sinh bệnh UTĐTT bao gồm các gen sinh ung thư và các hội chứng di truyền.

+ Hội chứng UTĐTT di truyền không polyp (hội chứng Lynch) [42]. + Bệnh đa polyp đại trực tràng mang tính gia đình (Familial Adenomatous Polyposis: FAP) [61]. + Hội chứng Turcot: Bệnh di truyền gen lặn trên NST thường [53]. Một số đặc điểm cận lâm sàng của bệnh ung thư đại-trực tràng 1.

Chẩn đoán hình ảnh - Chụp X quang đại-trực tràng có cản quang: phương pháp an toàn, hiệu quả và có độ đặc hiệu cao trong chẩn đoán các polyp và khối ung thư có đường kính trên 1cm, khả năng phát hiện là 90-95% các trường hợp [48]. - Chụp cắt lớp đại-trực tràng (CT-Computed Tomography): khi người bệnh có biến chứng tắc ruột, không chấp nhận hoặc chống chỉ định nội soi đại- trực tràng thì chụp cắt lớp đại trực tràng rất có giá trị chẩn đoán giúp phát hiện được tổn thương ung thư hoặc polyp lớn trên 10mm với độ nhạy từ 90 đến 96% [43], phát hiện xâm lấn tại chỗ, di căn hạch, di căn gan của UTĐTT [33], [45]. - Chụp cộng hưởng từ (MRI): giúp đánh giá tình trạng xâm lấn và di căn trong chẩn đoán giai đoạn của UTĐTT và theo dõi sự tái phát của khối u sau phẫu thuật [19]. - Chụp cắt lớp phát xạ PET/CT (Positron Emissio Tomography/ Computed Tomography): cho biết được một vùng bất thường trên hình ảnh có phải là ung thư hay không mà kỹ thuật CT hoặc MRI không khẳng định được, giúp phát hiện sự di căn của khối u trên phạm vi toàn cơ thể.

Trong UTĐTT, PET scan rất có giá trị để theo dõi sự tái phát khi các xét nghiệm hoá sinh ở giới hạn bình thường [62]. Nội soi đại-trực tràng Nội soi đại-trực tràng là kỹ thuật quan trọng trong chẩn đoán và điều trị các bệnh lý của đại-trực tràng trong đó có ung thư. Nội soi được sử dụng để chẩn đoán, điều trị và theo dõi tái phát của UTĐTT. Kỹ thuật nội soi có độ nhạy rất cao từ 94,7% đến 98,08% [23], [26], [59] và cho thấy hình ảnh tổn thương UTĐTT được chia làm 6 loại theo phân loại Paris 2002 [72]: - Type 0: tổn thương ung thư dạng nhú lồi, phẳng 6 - Type 1: tổn thương ung thư dạng sùi - Type 2: tổn thương ung thư dạng loét - Type 3: tổn thương ung thư dạng loét và sùi kết hợp - Type 4: tổn thương ung thư dạng thâm nhiễm - Type 5: tổn thương ung thư dạng không thể phân loại Type 1 Type 2 Type 3 Type 4 Hình 1.

Tổn thương ung thư đại trực tràng trên nội soi từ type 1-type 4 (Nguồn: Hiroyuki K, 2012) [44] Trong quá trình nội soi có thể sử dụng các chất nhuộm màu nhằm bộc lộ những vùng tổn thương giúp sinh thiết được chính xác góp phần chẩn đoán sớm để điều trị kịp thời. Hình ảnh nhuộm màu nhằm bộc lộ tổn thương khó phát hiện khi nội soi thông thường (Nguồn: Hiroyuki K, 2012) [44] 7 1. Xét nghiệm - Xét nghiệm định lượng CEA (Carcinoma Embryonic Antigen): CEA là một kháng nguyên có ở tế bào ruột của thai nhi và khi trưởng thành thì có nồng độ rất thấp ở trong máu. CEA tăng trong các bênh ung thư đặc biệt là bệnh ung thư tế bào biểu mô, trong đó có UTĐTT, là chỉ số thường gặp nhất ở những bệnh nhân tái phát không triệu chứng và hiện nay là chỉ số hữu ích nhất để phát hiện sớm di căn gan ở những bệnh nhân sau phẫu thuật [32], [33].

Những bệnh nhân mà nồng độ CEA huyết thanh ban đầu cao có tỷ lệ tái phát cao hơn hoặc thời gian tái phát ngắn hơn so với bệnh nhân có nồng độ CEA huyết thanh ban đầu bình thường [39], [52]. - Xét nghiệm định lượng hemoglobin: Định nghĩa thiếu máu theo tổ chức Y tế thế giới (WHO 2011): thiếu máu là hiện tượng (tình trạng) giảm lượng huyết sắc tố và số lượng hồng cầu trong máu ngoại vi, dẫn đến thiếu oxy cung cấp cho các mô tế bào trong cơ thể. Thiếu máu khi nồng độ hemoglobin thấp hơn 13 g/dL (130 g/L) ở nam giới ≥ 15 tuổi và thấp hơn 12 g/dL (120 g/L) ở phụ nữ ≥ 15 tuổi không mang thai. Trong bệnh lý UTĐTT, theo dõi chỉ số hemoglobin để phát hiện tình trạng thiếu máu dẫn đến suy nhược cơ thể của người bệnh ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị và thời gian phục hồi của bênh nhân đặc biệt là bênh nhân ung thư có di căn phải điều trị phẫu thuật.

Xét nghiệm mô bệnh học Xét nghiệm mô bệnh học là công tác kiểm tra mẫu sinh thiết hoặc tiêu bản phẫu thuật do một bác sĩ giải phẫu bệnh học thực hiện, sau khi đã xử lý mẫu bệnh phẩm này và đặt trên các phiến kính được soi qua kính hiển vi. Chẩn đoán ung thư bằng mô bệnh học là phương pháp rất quan trọng cho phép chẩn đoán xác định lành hay ác, định hướng cho điều trị cũng như tiên lượng bệnh. 8 - Phân loại mô học: theo phân loại WHO (2010), UTĐTT gồm các type u biểu mô bệnh học như sau [71]: + Ung thư biểu mô tuyến + Ung thư biểu mô tủy + Ung thư biểu mô tuyến nhú + Ung thư biểu mô tuyến nhày + Ung thư biểu mô tuyến “răng cưa” (Seratted Adenocarcinoma) + Ung thư biểu mô tế bào nhẫn + Ung thư biểu mô tuyến vảy + Ung thư biểu mô tế bào hình thoi + Ung thư biểu mô tế bào vảy + Ung thư biểu mô không biệt hóa. - Phân độ mô học: dựa trên sự hình thành cấu trúc tuyến của tổ chức ung thư, xét nghiệm mô bệnh học của UTĐTT thường được chia làm 04 mức độ: biệt hóa cao, biệt hóa vừa, biệt hóa thấp và không biệt hóa [38].

+ Biệt hóa cao: trên 95% có cấu trúc tuyến. + Biệt hóa vừa: từ 50% đến 95% có cấu trúc tuyến. + Biệt hóa kém: dưới 50% có cấu trúc tuyến. + Không biệt hóa: không thấy cấu trúc tuyến.

Ung thư biểu mô tuyến đại trực tràng chiếm 95% đến 97% các loại UTĐTT. Thể biệt hóa vừa và biệt hóa cao có tỷ lệ cao hơn thể biệt hóa kém và không biệt hóa [20], [64]. Trong một số nghiên cứu hệ thống phân loại chia làm hai mức độ: mức độ ác tính cao (gồm thể biệt hóa kém và không biệt hóa) và mức độ ác tính thấp (gồm thể biệt hóa cao và biệt hóa vừa) có giá trị tiên lượng tốt [31], [32]. Tổng quan về exon 2 của gen KRAS trong ung thư đại-trực tràng 1.

Đột biến exon 2 của gen KRAS trong ung thư đại-trực tràng Gen KRAS thuộc họ gen ung thư RAS, gen gồm 06 exon, có 45.691 bp nằm trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể số 12, tại vị trí p12.1 và từ cặp base 25.789 đến cặp base 25. Vị trí gen KRAS trên nhiễm sắc thể số 12 (Nguồn: Popescu. Trong tế bào protein Ras được giữ cân bằng thông qua sự hình thành hai phức hợp tương ứng với các trạng thái hoạt hóa và ức chế của protein Ras: phức hợp Ras-GTP (protein Ras được hoạt hóa) và phức hợp Ras-GDP (protein Ras bị bất hoạt).