Thiết kế vector biểu hiện Azurin trong E. coli BL21 (ĐH Thái Nguyên)

Thiết kế vector biểu hiện và biểu hiện gen azurin trong E. coli BL21. Nghiên cứu tập trung vào tối ưu hóa biểu hiện protein tái tổ hợp.

• Tác giả: Phạm Thị Hồng Nghi
• Người hướng dẫn: Ts. Trịnh Đình Khá
• Trường học: Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Thiết Kế Vector Biểu Hiện Và Biểu Hiện Gen Mã Hóa Protein Azurin Trong Escherichia Coli Bl21
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.2. Nội dung nghiên cứu
• 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về protein azurin
• 1.1.1. Sơ lƣợc về protein azurin
• 1.1.2. Cấu trúc của gen azurin
• 1.1.3. Khả năng chống ung thƣ
• 1.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới về protein azurin
• 1.3. Tình hình nghiên cứu protein azurin tại Việt Nam
• 1.4. Nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa Azurin
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu, trang thiết bị, dụng cụ nghiên cứu
• 2.2. Chủng vi sinh vật và plasmid
• 2.3. Thiết bị dụng cụ và hóa chất
• 2.4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu
• 2.5.1. Phƣơng pháp sinh học phân tử
• 2.5.2. Tinh sạch protein tái tổ hợp
• 2.5.3. Phƣơng pháp điện di
• 2.5.4. Xác định hoạt tính ức chế sinh trƣởng với các dòng tế bào ung thƣ
• 2.5.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu
• 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Thiết kế vector biểu hiện
• 3.2. Biểu hiện gen azurin
• 3.3. Tinh sạch azurin tái tổ hợp
• 3.4. Khả năng ức chế tế bào ung thƣ vú của Azurin tái tổ hợp
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH

Tóm tắt

I. Tổng quan Azurin trong E

Azurin, một protein có nguồn gốc từ vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa, đang nổi lên như một ứng cử viên đầy hứa hẹn trong lĩnh vực điều trị ung thư. Khả năng ức chế tế bào ung thư của Azurin đã được chứng minh thông qua nhiều cơ chế, bao gồm ổn định protein p53, can thiệp vào quá trình hình thành mạch và gây ra quá trình apoptosis (chết tế bào theo chương trình). Nghiên cứu này tập trung vào việc biểu hiện gen mã hóa Azurin trong Escherichia coli BL21, một hệ thống biểu hiện protein được sử dụng rộng rãi, nhằm sản xuất protein tái tổ hợp với tiềm năng ứng dụng trong y học. Ung thư vú là một trong những loại ung thư phổ biến nhất trên toàn thế giới, việc tìm kiếm các liệu pháp điều trị mới và hiệu quả là vô cùng cấp thiết. Azurin, với cơ chế tác động đa dạng và khả năng thâm nhập chọn lọc vào tế bào ung thư, hứa hẹn mang lại một giải pháp tiềm năng. Việc nghiên cứu biểu hiện Azurin trong E. coli không chỉ cung cấp một nguồn cung cấp protein tái tổ hợp ổn định mà còn mở ra cơ hội cho việc phát triển các dẫn xuất và biến thể Azurin với hoạt tính chống ung thư được cải thiện. Hóa trị liệu hiện nay gây ra nhiều tác dụng phụ và hiện tượng kháng thuốc. Chính vì vậy, việc nghiên cứu và tìm kiếm các liệu pháp điều trị mới là cấp thiết. Nghiên cứu này có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao trong việc tạo ra các dược phẩm bằng công nghệ sinh học, phục vụ bảo vệ sức khỏe con người. Luận văn này trình bày các kết quả về thiết kế vector biểu hiện, biểu hiện gen protein Azurin trong E. coli, tinh sạch và đánh giá khả năng ức chế tế bào ung thư vú của Azurin tái tổ hợp.

1.1. Azurin Protein Ức chế Ung thư đầy Tiềm năng

Azurin là một protein oxy hóa khử có kích thước nhỏ, được sản xuất bởi vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa. Đặc tính nổi bật của Azurin là khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư thông qua nhiều cơ chế khác nhau. Trong nhân tế bào, Azurin có thể tăng cường mức độ protein p53, một protein ức chế khối u quan trọng, từ đó kích thích quá trình apoptosis. Azurin cũng có khả năng can thiệp vào quá trình hình thành mạch máu, một yếu tố quan trọng cho sự phát triển và di căn của khối u. Điểm đặc biệt của Azurin là khả năng thâm nhập vào tế bào ung thư một cách chọn lọc, làm giảm tác dụng phụ đối với các tế bào khỏe mạnh. Azurin được nghiên cứu sử dụng trong điều trị các khối u. Azurin chứa một điểm kỵ nước, khả năng tiêu diệt các tế bào khối u xuất hiện dựa vào sự ổn định của protein p53 ức chế sự phát triển của bệnh ung thư.

1.2. Ứng dụng Azurin trong Điều trị Ung thư vú

Ung thư vú là loại ung thư phổ biến nhất ở phụ nữ trên toàn thế giới. Theo GLOBOCAN năm 2020, Ung thư vú (UTV) là ung thư ở nữ đã vượt qua ung thư phổi là bệnh phổ biến nhất được chẩn đoán ung thư, với ước tính khoảng 2,3 triệu ca mới trên toàn thế giới (11,7%). Ung thư vú là nguyên nhân gây tử vong do ung thư đứng thứ năm sau ung thư phổi, đại trực tràng, gan, dạ dày với tỷ lệ 6,9%. Tại Việt Nam, theo nghiên cứu gánh nặng bệnh ung thư và chiến lược phòng chống ung thư quốc gia đến năm 2020 cho thấy UTV là bệnh có tỷ lệ mới mắc cao nhất trong các ung thư ở nữ giới. Tỷ lệ mới mắc chuẩn theo tuổi năm 2010 ước tính là 28,1/100. Các phương pháp điều trị hiện tại như phẫu thuật, xạ trị và hóa trị có thể gây ra nhiều tác dụng phụ và hiện tượng kháng thuốc. Azurin, với cơ chế tác động đa dạng và khả năng thâm nhập chọn lọc vào tế bào ung thư, hứa hẹn mang lại một giải pháp tiềm năng. Các nghiên cứu cho thấy azurin hoạt động mạnh gây độc tế bào, đối với các bệnh ung thư vú dòng tế bào MCF-7, làm tăng cường độ quá trình apoptosis hơn 50%.

II. Thách thức và Cơ hội trong Biểu hiện Azurin ở E

Mặc dù Azurin có nhiều tiềm năng trong điều trị ung thư, việc sản xuất protein này với số lượng lớn và chất lượng cao vẫn là một thách thức. Pseudomonas aeruginosa, nguồn gốc tự nhiên của Azurin, không phải là một hệ thống biểu hiện protein lý tưởng do các yếu tố như độc tính và hệ thống gen phức tạp. Do đó, việc biểu hiện Azurin trong E. coli, một hệ thống biểu hiện protein được sử dụng rộng rãi, là một giải pháp hấp dẫn. Tuy nhiên, việc biểu hiện protein ngoại lai trong E. coli có thể gặp phải các vấn đề như hình thành thể vùi, giảm hoạt tính sinh học và khó khăn trong quá trình tinh sạch. Để vượt qua những thách thức này, cần tối ưu hóa các yếu tố như cấu trúc vector biểu hiện, điều kiện nuôi cấy và quy trình tinh sạch. Thành tựu về sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền giúp chúng ta có thể hiểu rõ bản chất phân tử của các bệnh. Công nghệ rDNA và những ứng dụng trong ngành công nghiệp dược phẩm đã thúc đẩy sự phát triển mạnh mẽ của các công ty công nghệ sinh học. Việc nghiên cứu biểu hiện gen mã protein Azurin trong Escherichia coli BL21 tiến tới sản xuất protein Azurin tái tổ hợp có hoạt tính ức chế tế bào ung thư phục vụ bảo vệ sức khỏe con người có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao.

2.1. Khó khăn khi Biểu hiện Protein Ngoại lai trong E.coli

Biểu hiện protein ngoại lai trong E. coli có thể gặp phải nhiều khó khăn, bao gồm hình thành thể vùi, giảm hoạt tính sinh học, khó khăn trong quá trình tinh sạch và độc tính đối với tế bào chủ. Thể vùi là các tập hợp protein không hòa tan, gây khó khăn cho việc thu hồi protein có hoạt tính. Quá trình gấp cuộn protein không chính xác có thể dẫn đến giảm hoặc mất hoạt tính sinh học. Việc tinh sạch protein ngoại lai từ hỗn hợp phức tạp của protein E. coli có thể tốn nhiều thời gian và công sức. Cuối cùng, một số protein ngoại lai có thể gây độc tính đối với E. coli, làm giảm năng suất biểu hiện. Để giải quyết, cần tối ưu hóa các yếu tố khác nhau.

2.2. Tối ưu hóa Biểu hiện Azurin trong E.coli BL21

Để tối ưu hóa việc biểu hiện Azurin trong E. coli BL21, cần xem xét các yếu tố như cấu trúc vector biểu hiện, điều kiện nuôi cấy và quy trình tinh sạch. Vector biểu hiện cần được thiết kế để đảm bảo biểu hiện protein hiệu quả và ổn định. Điều kiện nuôi cấy cần được tối ưu hóa để giảm thiểu hình thành thể vùi và tăng cường quá trình gấp cuộn protein chính xác. Quy trình tinh sạch cần được thiết kế để thu hồi protein có hoạt tính cao với hiệu suất cao. Sử dụng IPTG nồng độ 0,5 mM sau 6 giờ ở 37°C để thu được năng suất biểu hiện cao nhất. Protein được xuất sang vùng quanh chất ở Escherichia coli và số lượng tương ứng với 27% tổng hàm lượng protein trong vùng quanh chất.

2.3. Vai trò của E.Coli BL21 trong Nghiên Cứu Azurin

E.Coli BL21 là một chủng vi khuẩn được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu sinh học phân tử và công nghệ sinh học, đặc biệt là trong việc biểu hiện protein tái tổ hợp. Chủng này có một số đặc điểm quan trọng khiến nó trở thành một lựa chọn phổ biến cho việc sản xuất Azurin. E.Coli BL21 thiếu một số enzyme protease, giúp giảm thiểu sự phân hủy protein mục tiêu. Ngoài ra, nó có thể được dễ dàng biến đổi gen và nuôi cấy trong môi trường phòng thí nghiệm. Việc sử dụng E.Coli BL21 giúp tạo ra số lượng lớn protein Azurin, từ đó hỗ trợ các nghiên cứu về cơ chế hoạt động và ứng dụng tiềm năng của nó trong điều trị ung thư. Việc nghiên cứu biểu hiện gen mã protein Azurin trong Escherichia coli BL21 tiến tới sản xuất protein Azurin tái tổ hợp có hoạt tính ức chế tế bào ung thư phục vụ bảo vệ sức khỏe con người có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao.

III. Thiết kế Vector Biểu hiện Azurin Hướng dẫn Chi tiết

Thiết kế vector biểu hiện đóng vai trò then chốt trong việc biểu hiện thành công Azurin trong E. coli. Vector biểu hiện cần chứa các yếu tố cần thiết cho biểu hiện protein hiệu quả, bao gồm promoter mạnh, trình tự ribosome binding site (RBS) tối ưu, gen mã hóa Azurin và trình tự terminator. Ngoài ra, vector biểu hiện có thể chứa các yếu tố bổ sung như thẻ tag để tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình tinh sạch protein. Vector được cắt mở vòng với BamHI và XhoI. Sau đó sản phẩm cắt pET22b(+) mở vòng và đoạn gene azu_VTCC-B-657 được chạy điện di trên agarose và tinh sạch thôi gel. Kết quả điện di trên gel agarose ở Hình 3.1 cho thấy sản phẩm azu_VTCC-B-657 và pET22b(+) sau khi cắt với BamHI và XhoI đã được tinh sạch. Sản phẩm cắt kiểm tra plasmid tái tổ pET22b(+)_azu_VTCC-B-657 bằng BamHI và XhoI ở Hình 3.2 cho thấy đoạn gene azu_VTCC-B-657 có kích thước khoảng 500 bp đã được chèn vào pET22b(+).

3.1. Lựa chọn Vector Biểu hiện phù hợp pET22b

Việc lựa chọn vector biểu hiện phù hợp là rất quan trọng để đảm bảo biểu hiện protein hiệu quả và ổn định. pET22b(+) là một vector biểu hiện được sử dụng rộng rãi trong E. coli, với promoter mạnh T7, trình tự RBS tối ưu và trình tự terminator hiệu quả. Ngoài ra, pET22b(+) chứa thẻ His-tag, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình tinh sạch protein bằng sắc ký ái lực niken. Cấu trúc vector biểu hiện pET-22b(+)

3.2. Chèn Gen Azurin vào Vector pET22b BamHI XhoI

Sau khi lựa chọn vector biểu hiện, gen mã hóa Azurin cần được chèn vào vector một cách chính xác. Điều này thường được thực hiện bằng cách sử dụng enzyme giới hạn để cắt cả vector và gen mã hóa Azurin, sau đó sử dụng enzyme ligase để nối hai đoạn DNA lại với nhau. Cần đảm bảo rằng gen Azurin được chèn đúng khung đọc để đảm bảo protein được biểu hiện chính xác. Hai plasmid pTZ_azu_VTCC-B-657 và pET22b(+) được cắt mở vòng với BamHI và XhoI. Sau đó sản phẩm cắt pET22b(+) mở vòng và đoạn gene azu_VTCC-B-657 được chạy điện di trên agarose và tinh sạch thôi gel.

3.3. Kiểm tra và Xác nhận Vector tái tổ hợp

Sau khi tạo vector tái tổ hợp, cần kiểm tra và xác nhận rằng gen Azurin đã được chèn đúng cách. Điều này có thể được thực hiện bằng cách sử dụng các phương pháp như cắt enzyme giới hạn, điện di gel và giải trình tự DNA. Việc giải trình tự DNA là phương pháp chính xác nhất để xác nhận rằng gen Azurin đã được chèn đúng khung đọc và không có đột biến. Vector tái tổ hợp pET22b(+)_azu_VTCC-B-657 được đọc trình tự kiểm tra khung đọc mở với mồi T7P. Kết quả đọc trình tự khung đọc mở cho thấy khung đọc mở đã đúng và gen được chèn đúng chiều khung đọc, cấu trúc biểu hiện gen đã được thiết kế.

IV. Biểu hiện và Tinh sạch Azurin Tái tổ hợp từ E

Sau khi thiết kế và xác nhận vector biểu hiện, bước tiếp theo là biểu hiện Azurin tái tổ hợp trong E. coli BL21. Quá trình này bao gồm nuôi cấy E. coli BL21 chứa vector biểu hiện, cảm ứng biểu hiện protein và thu hoạch tế bào. Sau đó, protein Azurin tái tổ hợp được tinh sạch từ dịch tế bào bằng các phương pháp sắc ký khác nhau. SDS-PAGE protein tổng số của tế bào E.Coli BL21 tái tổ hợp biểu hiện Mẫu trước cảm ứng (1), Sau 6 giờ cảm ứng với IPTG (2,3,4) Mẫu protein tổng số từ cặn tế bào sau 6 giờ cảm ứng được kiểm tra SDS-PAGE. Kết quả ở Hình 3.4 cho thấy mẫu protein sau cảm ứng xuất hiện băng protein có kích thước khoảng 17 kDa khác biệt so với mẫu đối chứng không cảm ứng (làn 1). Băng này có kích thước tương ứng với kích thước dự tính của azurin, chứng tỏ azurin tái tổ hợp đã được biểu hiện.

4.1. Cảm ứng Biểu hiện Azurin bằng IPTG

IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) là một chất cảm ứng được sử dụng rộng rãi để kích hoạt biểu hiện protein từ promoter T7 trong E. coli BL21. IPTG liên kết với protein ức chế LacI, làm giải phóng promoter T7 và cho phép RNA polymerase phiên mã gen Azurin. Cần tối ưu hóa nồng độ IPTG và thời gian cảm ứng để đạt được năng suất biểu hiện protein cao nhất mà không gây độc tính cho tế bào. Chủng được nuôi biểu hiện trong môi trường LB, lắc 200 vòng/phút ở 37°C, cảm ứng 1 mM IPTG và mẫu tế bào được thu sau 4 giờ cảm ứng.

4.2. Tinh sạch Azurin bằng Sắc ký ái lực Niken His Tag

Sắc ký ái lực niken là một phương pháp hiệu quả để tinh sạch protein chứa His-tag. His-tag là một đoạn peptide ngắn chứa các axit amin histidine, có ái lực cao với các ion niken. Protein Azurin tái tổ hợp chứa His-tag được liên kết với cột sắc ký chứa các ion niken, trong khi các protein khác không liên kết. Sau đó, protein Azurin được giải phóng khỏi cột bằng cách sử dụng imidazole, một chất có ái lực cạnh tranh với niken. Tế bào thu từ dịch nuôi cấy biểu hiện azurin sau 6 giờ cảm ứng được phá siêu âm. Dịch nổi thu được sau khi ly tâm được sử dụng để tinh sạch azurin qua cột sắc ký ái lực Niken. Kết quả SDS-PAGE ở Hình 3. cho thấy mẫu biểu hiện ở phân đoạn tinh sạch chỉ có một băng protein có kích thước khoảng 17 kDa, đúng với kích thước băng protein azurin dự đoán.

4.3. Đánh giá Độ tinh khiết của Protein Azurin

Sau khi tinh sạch, cần đánh giá độ tinh khiết của protein Azurin bằng các phương pháp như điện di gel SDS-PAGE và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Điện di gel SDS-PAGE cho phép xác định kích thước và số lượng các protein có trong mẫu. HPLC cho phép xác định độ tinh khiết và sự đồng nhất của protein. Protein Azurin phải ở dạng monomer tinh sạch xuất hiện một băng duy nhất.

V. Nghiên cứu Khả năng Ức chế Tế bào Ung thư vú MCF7

Sau khi thu được protein Azurin tái tổ hợp tinh khiết, hoạt tính ức chế tế bào ung thư vú của Azurin được đánh giá trên dòng tế bào MCF7. Các phương pháp như thử nghiệm MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) được sử dụng để xác định tỷ lệ sống sót của tế bào MCF7 sau khi tiếp xúc với Azurin. Dựa trên tỷ lệ tế bào sống trong các nhóm nghiên cứu và nồng độ Azurin tái tổ hợp sử dụng, lập phương trình hồi quy tuyến tính giữa tỷ lệ tế bào sống (Y, %) và nồng độ A zurin tái tổ hợp (X, µg/ml). Phương trình hồi quy tuyến tính có dạng: Y = a + bX. Từ phương trình hồi quy tuyến tính, tính liều ức chế 50% tế bào (IC50) của azurin ở thời điểm 72h giờ trên các dòng tế bào ung thư theo công thức:

5.1. Thử nghiệm MTS Đánh giá Độc tính trên Tế bào MCF7

Thử nghiệm MTS là một phương pháp phổ biến để đánh giá độc tính của các chất trên tế bào. Trong thử nghiệm này, tế bào MCF7 được tiếp xúc với các nồng độ khác nhau của Azurin tái tổ hợp. Sau một thời gian ủ nhất định, chất MTS được thêm vào môi trường nuôi cấy. Tế bào sống có khả năng khử MTS thành formazan, một chất có màu. Lượng formazan được tạo ra tỷ lệ thuận với số lượng tế bào sống, và có thể được đo bằng máy quang phổ. Azurin tái tổ hợp tinh sạch được lọc qua màng vô khuẩn (Millipore 0,25 µm) được thử độc tính trên tế bào theo dãy pha loãng trong môi trường nuôi cấy với cùng dải nồng độ 50 μg/mL, 30 μg/mL, 20 μg/mL, 10 μg/mL và 5 μg/mL, 2 μg/mL và 1 μg/mL. Đối chứng âm là mẫu tế bào không bổ sung protein tái tổ hợp Azurin. Mỗi mẫu thí nghiệm và đối chứng được tiến hành lặp lại 3 lần.

5.2. Xác định Liều Ức chế 50 IC50 của Azurin

IC50 là nồng độ của một chất ức chế cần thiết để giảm 50% hoạt động của một quá trình sinh học. Trong trường hợp này, IC50 của Azurin là nồng độ cần thiết để giảm 50% số lượng tế bào MCF7 sống sót. IC50 là một thước đo quan trọng về hiệu quả của một chất ức chế, và được sử dụng để so sánh hiệu quả của các chất ức chế khác nhau. Dựa trên số liệu thu được, lập phương trình hồi quy tuyến tính giữa tỷ lệ tế bào sống và nồng độ Azurin tái tổ hợp. Từ phương trình này, tính toán IC50 theo công thức đã nêu ở trên. 8.13S (Sigma) được sử dụng như là chất đối chứng dương và được thử nghiệm ở các nồng độ 100 g/ml, 80 g/ml; 60 g/ml; 40 g/ml 20 g/ml, 10 g/ml và 5 g/ml DMSO nồng độ 10% luôn được sử dụng như đối chứng âm.

VI. Kết luận và Hướng Nghiên cứu Azurin Ứng dụng trong Ung thư

Nghiên cứu này đã thành công trong việc biểu hiện gen mã hóa Azurin trong E. coli BL21, tinh sạch protein tái tổ hợp và chứng minh hoạt tính ức chế tế bào ung thư vú của Azurin. Kết quả này mở ra cơ hội cho việc phát triển Azurin như một liệu pháp tiềm năng trong điều trị ung thư vú. Tuy nhiên, cần có thêm nhiều nghiên cứu để tối ưu hóa quá trình sản xuất Azurin, hiểu rõ hơn về cơ chế tác động của Azurin và đánh giá hiệu quả của Azurin trên các mô hình in vivo. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thư của azurin tái tổ hợp trên tế bào MCF7 được thể hiện ở bảng 3. Từ các số liệu thu được cho thấy mẫu azurin tái tổ hợp có hoạt tính với giá trị IC50 thấp 30,09 g/ml thấp hơn đối chứng dương 8.13S có giá trị IC50 đạt 38,67 g/ml.

6.1. Tối ưu hóa Sản xuất Azurin Quy mô lớn

Để ứng dụng Azurin trong điều trị ung thư, cần tối ưu hóa quá trình sản xuất protein này với quy mô lớn. Các yếu tố như điều kiện nuôi cấy, cấu trúc vector biểu hiện và quy trình tinh sạch cần được tối ưu hóa để đạt được năng suất cao và chi phí sản xuất thấp. Tiếp tục đánh giá hoạt tính ức chế tế bào ung thư của Aruzin tái tổ hợp trên mô hình tế bào và mô hình động vật.

6.2. Nghiên cứu Cơ chế Tác động của Azurin

Hiểu rõ cơ chế tác động của Azurin là rất quan trọng để phát triển các liệu pháp điều trị ung thư hiệu quả hơn. Cần nghiên cứu các tương tác giữa Azurin và các protein mục tiêu trong tế bào ung thư, cũng như các con đường tín hiệu mà Azurin tác động. Nghiên cứu cần tập trung vào những protein liên quan đến p53, EphB2, ICAM-3, DC-SIGN, gp120, MSP-1 và SAG1

6.3. Đánh giá Hiệu quả của Azurin trên Mô hình In Vivo

Sau khi chứng minh hoạt tính ức chế tế bào ung thư in vitro, cần đánh giá hiệu quả của Azurin trên các mô hình in vivo. Điều này bao gồm sử dụng các mô hình động vật mắc ung thư vú để đánh giá khả năng của Azurin trong việc ngăn chặn sự phát triển và di căn của khối u. Azurin tái tổ hợp cần có hàm lượng cao và hoạt tính mạnh.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Azurin là một protein đƣợc sản xuất bởi vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa có hoạt tính ức chế tế bào ung thƣ thông qua ổn định protein p53. Trong nhân, azurin tăng cƣờng mức độ p53 nội bào, kích thích sản xuất cytochrome c vào bào tƣơng. Quá trình này kích hoạt các caspase khác (bao gồm cả caspase-7 và caspase-9) bắt đầu quá trình apoptosis (Punj et al. Apoptosis là một quá trình thiết yếu trong tế bào phát triển và duy trì cân bằng nội môi của tế bào.

Azurin có tác dụng hiệu quả hơn nhiều khi thâm nhập vào tế bào khối u so với tế bào bình thƣờng. Quá trình này do vùng domain Azu 50-70 (p28) thực hiện ( Bernardes et al. p28 ƣu tiên tác động vào các dòng tế bào ung thƣ vú ở ngƣời MCF-7, ZR-75-1, và T47D thông qua con đƣờng trung gian caveolin. p28 và peptide tƣơng tự làm giảm sự suy thoái của p53 (Yamada et al.

Vasu và cộng sự nghiên cứu cho thấy azurin hoạt động mạnh gây độc tế bào, đối với các bệnh ung thƣ vú dòng tế bào MCF-7, làm tăng cƣờng độ quá trình apoptosis hơn 50%. Ngoài tác dụng ức chế tế bào ung thƣ vú, protein azurin còn có khả năng ức chế tế bào ung thƣ biểu mô vẩy, tế bào lƣới sarcoma. Theo GLOBOCAN năm 2020, Ung thƣ vú (UTV) là ung thƣ ở nữ đã vƣợt qua ung thƣ phổi là bệnh phổ biến nhất đƣợc chẩn đoán ung thƣ, với ƣớc tính khoảng 2,3 triệu ca mới trên toàn thế giới (11,7%). Ung thƣ vú là nguyên nhân gây tử vong do ung thƣ đứng thứ năm sau ung thƣ phổi, đại trực tràng, gan, dạ dày với tỷ lệ 6,9%.

Tại Việt Nam, theo nghiên cứu gánh nặng bệnh ung thƣ và chiến lƣợc phòng chống ung thƣ quốc gia đến năm 2020 cho thấy UTV là bệnh có tỷ lệ mới mắc cao nhất trong các ung thƣ ở nữ giới. Tỷ lệ mới mắc chuẩn theo tuổi năm 2010 ƣớc tính là 28,1/100. Mặc dù tỷ lệ mắc UTV có xu hƣớng tăng trong những năm gần đây nhƣng tỷ lệ tử vong do bệnh vẫn từng bƣớc đƣợc cải thiện nhờ các thành tựu đạt đƣợc trong phòng bệnh, phát hiện bệnh sớm, chẩn đoán và điều trị. Bắt đầu từ những năm đầu thập niên 1970, các thành tựu về sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền 2 giúp chúng ta có thể hiểu rõ bản chất phân tử của các bệnh xuất hiện trên động vật, thực vật và đặc biệt là trên ngƣời.

Công nghệ rDNA và những ứng dụng trong ngành công nghiệp dƣợc phẩm đã thúc đẩy sự phát triển mạnh mẽ của các công ty công nghệ sinh học và các dƣợc phẩm tạo ra nhờ công nghệ rDNA (dƣợc phẩm sinh học) nhằm phục vụ và bảo vệ sức khỏe con ngƣời. Trong các biện pháp điều trị thì phẫu thuật và xạ trị hiện nay gây nhiều đau đớn và để lại nhiều phản ứng phụ cho ngƣời bệnh, hóa trị liệu có thể gây ra tác động phụ đối với các tế bào bình thƣờng và dẫn tới hiện tƣợng kháng thuốc của tế bào ung thƣ. Chính vì vậy, việc nghiên cứu và tìm kiếm các liệu pháp điều trị mới là cấp thiết. Ở Việt Nam, nghiên cứu tạo các dƣợc phẩm bằng công nghệ sinh học đang bắt đầu đƣợc tiếp cận.

Việc nghiên cứu biểu hiện gen mã protein Azurin trong Escherichia coli BL21 tiến tới sản xuất protein Azurin tái tổ hợp có hoạt tính ức chế tế bào ung thƣ phục vụ bảo vệ sức khỏe con ngƣời có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao. Xuất phát từ các lý do trên, đề tài: “Thiết kế vector biểu hiện và biểu hiện gen mã hóa protein Azurin trong Escherichia coli BL21” đƣợc thực hiện. Mục tiêu nghiên cứu Biểu hiện gen mã hóa protein Azurin trong Escherichia coli BL21 nhằm tiến tới sản xuất protein tái tổ hợp có giá trị sử dụng trong y dƣợc. Nội dung nghiên cứu - Thiết kế vector biểu hiện mang gen mã hóa protein Azurin - Biểu hiện gen protein Azurin trong E.

- Tinh sạch và đánh giá khả năng ức chế tế bào ung thƣ vú của Azurin tái tổ hợp. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về protein azurin 1. Sơ lược về protein azurin Protein oxy hóa khử azurin của vi khuẩn (viết tắt là azurin, hoặc Az) azurin là một phân tử protein có trọng lƣợng phân tử thấp (14 kDa, 128 axit amin), màu xanh lam, chứa đồng.

Azurin ngoại chất cần thiết để bảo vệ vi khuẩn khỏi stress oxy hóa (chất cho điện tử thành nitrat reductase) và độc tính của đồng, hoạt động trong chuỗi vận chuyển điện tử hô hấp ở một số vi khuẩn là một loại đồng chứa protein đơn miền với một cấu trúc β- barrel cứng nhắc. Azurin là protein chứa đồng đƣợc gọi là protein cupredoxin. Cupredoxin là các protein ở dạng hoà tan có chứa đồng, chúng tham gia vào vận chuyển điện tử của sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn. Những khả năng này là do azurin có thể tƣơng tác với một số protein liên quan đến các bệnh lý này bằng ái lực cao.

Khả năng này cùng với cấu trúc, đặc tính hóa lý làm cho azurin nhƣ một protein giá đỡ tự nhiên mang đặc trƣng bám dính giống kháng thể (immunoglobulin). Có thể đƣợc sử dụng cho các mục đích khác nhau nhƣ chống ký sinh trùng và tác nhân chống HIV, và là một trong những sản phẩm vi khuẩn tiêu biểu đƣợc sử dụng trong điều trị các khối u. Azurin chứa một điểm kỵ nƣớc (Carvalho E. Khả năng của azurin để tiêu diệt các tế bào khối u xuất hiện dựa vào sự ổn định của protein p53 ức chế sự phát triển của bệnh ung thƣ.

Chất ức chế khối u p53 bị phân hủy bởi hệ thống ubiquitin-proteasome. p53 đƣợc polyubiquiti hóa với sự hiện diện của E1, UbcH5 nhƣ E2 và MDM2 oncoprotein. Một phân tử ubiquitin liên kết MDM2 thông qua liên kết sulfhydroxy, đặc trƣng của liên kết ubiquitin ligase (E3) - ubiquitin. Dƣ lƣợng cysteine trong ga cuối carboxyl của MDM2 là cần thiết cho hoạt động.

Những dữ liệu này cho thấy rằng protein MDM2, đƣợc tạo ra bởi p53, có chức năng nhƣ một ligase ubiquitin. Trong hạt nhân azurin tăng cƣờng mức độ nội bào của p53 và Bax, những gì gây nên sự 4 giải phóng của ti thể cytochrome c vào cytosol. Quá trình này kích hoạt thác caspase (bao gồm caspase-7 và caspase-9) khởi xƣớng quá trình chết theo chƣơng trình. Amino acid từ 50 đến 77 (P28) hoạt động nhƣ một miền tải nạp protein (PTD), bao gồm 28 axit amin, có trọng lƣợng phân tử 2,8 kDa.

P28 có khả năng xâm nhập ƣu tiên vào các tế bào ung thƣ và ngăn chặn sự tăng sinh của chúng trong ống nghiệm và in vivo. P28 và các peptide tƣơng tự làm giảm sự suy thoái của p53 có thể cung cấp một loạt của các tác nhân hóa học trị liệu cytostatic và độc tế bào. PTD azurin đã đƣợc tinh chế từ axit amin 50 đến 67, các peptide kỵ nƣớc P18 trong các axit amin 68 đến 77, hydrophilic peptide P10, là những thành phần chịu trách nhiệm cho hoạt động kháng sinh của p28 (Rita B. Azurin có tác dụng chống ký sinh trùng và kháng virus chống lại bệnh sốt rét Plasmodium falciparum và virus HIV-1.

Nó liên kết với ICAMs, hoạt động nhƣ các thụ thể cho các mầm bệnh khác nhau bao gồm Plasmodium falciparum, HIV-1 và cũng liên kết với một số protein bề mặt của ký sinh trùng hay virus, nó can thiệp vào việc xâm nhập của các tác nhân gây nhiễm vào các tế bào chủ. Trong một nghiên cứu khác thì azurin đã đƣợc chứng minh là cho phép thoái triển các khối u UISO-Mel-2 ở ngƣời đƣợc cấy ghép trên chuột và có thể đƣợc sử dụng trong điều trị ung thƣ (Yaseen Nahi Yousif &Edan Dawood Salim, 2014; Chaudhari A. Cấu trúc của gen azurin Azurin là thành viên của họ cupredoxin chứng minh tính năng cấu trúc tƣơng tự đến các miền biến immunoglobulin (Arsenio M. Các cupredoxin có một cấu trúc sandwich bất biến, cấu trúc thông thƣờng đƣợc hình thành bởi hai mặt phẳng β hình thành bởi bảy hoặc tám sợi song song và phản song song, một vùng R - helix biến đổi nằm bên ngoài thân, và một vị trí liên kết đồng hạt nhân bảo tồn (Carvalho E.

Sự tƣơng đồng của azurin với domain protein miễn dịch glubolin chứng minh kháng thể giống cấu trúc đơn của nó. Cấu trúc giống nhƣ kháng thể này 5 bao gồm 8 sợi phản song song đƣợc ổn định thông qua cầu disunfua hình thành một cấu trúc nhỏ gọn và cứng nhắc với lõi β-sandwich. Mặc dù azurin và glubolin miễn dịch đều có bản chất trình tự thấp. Cấu trúc thứ cấp của nó có thể đƣợc liên kết bằng sự chồng chất các cấu trúc, điều này chứng tỏ chúng có cùng một tổ tiên.

Trong phần giữa có vị trí P28, các P28 là một PTD xoắn α dài mang tính đặc hiệu cho lối vào của azurin trong tế bào ung thƣ. Azurin có 4 vòng lặp đƣợc cho là liên quan đến việc rằng buộc với các protein khác. Những vòng lặp tiếp xúc này tƣơng tự nhƣ trong tự nhiên ở các kháng thể, thực thi việc sở hữu protein của nó (Carvalho E. 1 Cấu trúc của protein azurin Cấu trúc azurin được biểu diễn dưới dạng sơ đồ cấu trúc liên kết với các sợi β được đánh số tuần tự, được mô tả là sợi kết nối disulfua 1 và vòng lặp giữa sợi 2b và 3 và các phối tử đồng; Cys112, His117 và Met121 trong vòng kết nối sợi 7 đến 8 và His46 và Gly45 trong vòng kết nối sợi 3 đến 4.

Góc tyrosine, trong vòng nối các sợi 7 và 8 và một chuỗi α ngoại vi cũng được mô tả. Các đường đứt nét biểu thị kiểu liên kết hydro giữa các sợi (Leckner Johan, 2001). Khả năng chống ung thư Azurin nhƣ một nhân tố đa mục tiêu chống ung thƣ có tác dụng thông qua ba con đƣờng: ức chế sự phát triển của chu kỳ tế bào qua ràng buộc để Eph tyrosine kinase ngoại bào khởi phát cảm ứng apoptosis thông qua ổn định trong tế bào của p53 và ngăn ngừa sự hình thành mạch. Từ những con đƣờng độc lập thì sẽ dẫn đến sự ức chế tế bào ung thƣ (Carvalho E.