MỞ ĐẦU Ngộ độc thực phẩm là vấn đề rất đƣợc quan tâm không chỉ ở Việt Nam mà còn trên toàn thế giới. Nguyên nhân chủ yếu gây ngộ độc thực phẩm là vi sinh vật, thƣờng gặp nhƣ Escherichia coli (E. coli), Salmonella spp. Trong đó, vi sinh vật gây ngộ độc nguy hiểm và thƣờng gặp nhất là E.
Theo báo cáo số 18 năm 2011 trong chuỗi báo cáo đánh giá nguy cơ nhiễm vi sinh vật của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và Tổ chức Nông lƣơng thế giới (FAO) đã thống kê tỉ lệ ngƣời nhiễm E.000 dân: Tại Liên minh Châu Âu 1,3 ngƣời; tại Mỹ 1,9 ngƣời; tại Newzeland và Australia 2 ngƣời; tại Argentina 22 ngƣời. coli O157:H7 thuộc loài E. coli gây xuất huyết ruột (EHEC - Enterohaemorrhagic E. coli), sinh độc tố Shiga.
coli O157:H7 là đối tƣợng gây ngộ độc thực phẩm cực kỳ nguy hiểm trên phạm vi toàn cầu. Chúng gây tiêu chảy phân máu, viêm đại tràng xuất huyết. Những trƣờng hợp hoại tử nặng có thể dẫn tới thủng ruột. Độc tố Shiga còn có thể gây hội chứng tăng ure huyết tan máu, suy thận (HUS - haemorrhagic uremic syndrome) dẫn tới tử vong.
coli O157:H7 là tác nhân gây bệnh nguy hiểm nhƣng dễ dàng bị lây nhiễm ở nhiều thực phẩm thiết yếu nhƣ nƣớc, rau, thịt sống, thịt chƣa nấu kỹ…Mối nguy E. coli O157:H7 rất lớn do chủng này có liều gây độc thấp (10 – 100 tế bào), gây dịch tiêu chảy, tốc độ lây lan nhanh, sinh độc tố Shiga, tỷ lệ gây tan huyết và suy thận cao, dẫn tới tử vong. Hàng năm, khoảng 15% trẻ em và một tỷ lệ thấp hơn ngƣời lớn nhiễm E. coli O157:H7 và dẫn tới hội chứng tán huyết, suy thận, trong đó 50% số bệnh nhân phải chạy thận và 5% tử vong.
Kể từ khi đƣợc xác định năm 1982 tại Hoa Kỳ, E. coli O157:H7 đã trở thành mầm bệnh quan trọng nhất trong nhóm các bệnh lây lan qua thực phẩm tại Hoa Kỳ cũng nhƣ các nƣớc đã phát triển ở Châu Âu và Nhật Bản. Tại Việt Nam, theo số liệu thống kê của Cục Vệ sinh An toàn thực phẩm – Bộ Y tế: Năm 2013 có 5.200 trƣờng hợp bị ngộ độc. coli là nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm quan trọng nên rất đƣợc quan tâm nghiên cứu.
Tuy đã có nhiều nghiên cứu về phân lập và xác định tỷ lệ nhiễm E. coli nói chung nhƣng 1 download by : skknchat@gmail. coli O157:H7 nói riêng chỉ có một số nghiên cứu nhỏ, phân tán, chƣa thỏa đáng với mức độ nguy hiểm của nó. coli O157:H7 còn gặp nhiều khó khăn, mất nhiều thời gian, đòi hỏi các trang thiết bị, máy móc hiện đại, phân tích viên có trình độ chuyên môn cao.
Do đó, việc phân tích chính xác E. coli O157:H7 ở nƣớc ta còn hạn chế. Aptamer có bản chất là acid oligonucleic hoặc các phân tử peptide có khả năng liên kết chặt chẽ với một phân tử đích cụ thể nhờ sự tƣơng tác cấu trúc trong không gian 3 chiều. Phổ đích của aptamer rất đa dạng từ ion, phân tử, đại phân tử tới tế bào.
Aptamer đã đƣợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: vận chuyển các phân tử, chẩn đoán các mối nguy, tạo cảm biến sinh học, nghiên cứu y dƣợc, điều trị ung thƣ, tạo thuốc phân tử, điều trị lâm sàng, nghiên cứu dịch tễ học… Trong một số trƣờng hợp với vai trò nhƣ đầu dò nhận biết phân tử, aptamer có ái lực liên kết thậm chí vƣợt qua các kháng thể đơn dòng. Xuất phát từ nhu cầu sàng lọc, xác định E. coli O157:H7 một cách nhanh chóng, hạ giá thành nên chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tạo aptamer đặc hiệu vi khuẩn Escherichia coli O157:H7”. Mục tiêu của đề tài nhằm xây dựng đƣợc quy trình sàng lọc và sàng lọc đƣợc phân tử aptamer có khả năng nhận biết đặc hiệu vi khuẩn E.
Nội dung nghiên cứu: - Xây dựng thƣ viện ssDNA và sàng lọc các aptamer liên kết với vi khuẩn E. - Tách dòng và xác định trình tự aptamer nhận biết đặc hiệu vi khuẩn E. 2 download by : skknchat@gmail.com CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.
Tổng quan về Escherichia coli O157:H7 1. Giới thiệu chung về E. coli O157:H7 Escherichia coli O157:H7 thuộc họ Enterobacteriaceae, chi Escherichia [5]. Chúng là vi khuẩn Gram âm, hình que, có khả năng di động (hình 1.
Kích thƣớc: dài từ 2 - 4 µm, rộng 0.8 - 1µm, có nhiều lông toàn thân và có roi dài khoảng 20 nm. coli O157:H7 là sinh vật nhân sơ, DNA có cấu trúc siêu xoắn nằm giữa tế bào, không có màng nhân bao bọc. coli O157:H7 có cấu tạo đơn giản bao gồm: Lớp ngoài là thành tế bào,có thêm lớp màng lipopolysaccharide (LPS). Lớp trong là màng sinh chất (gồm 1 lớp lipid nằm giữa 2 lớp phospho) bao quanh tế bào chất.
Tế bào chất là phần vật chất dạng keo chứa protein, acid nucleic, hydrat carbon, lipid, các ion vô cơ và nhiều nhiều chất khác có khối lƣợng phân tử thấp [7,8].1: Cấu tạo tế bào vi khuẩn E. coli O157:H7 DNA của vi khuẩn E. coli O157:H7 gồm hệ gen nhân dài sấp xỉ 5,5 triệu bp, gồm khoảng 5483 gen và 2 plasmid có chiều dài lần lƣợt là 93 kb và 3,3 kb (hình 1. Trong hệ gen nhân chứa 2 gen mã hóa cho độc tố đặc trƣng của vi khuẩn này là stx1 và stx2 [5,25].
coli O157:H7 có hai loại kháng nguyên là O và H, trong đó O là kháng nguyên bề mặt, còn H là kháng nguyên lông roi [5,6]. 3 download by : skknchat@gmail.1: Thông số hệ gen của vi khuẩn E. coli O157:H7 Hệ gen pO157 pOSAK1 Độ dài 5,498,450 bp 92,721 bp 3,306 bp Tỉ lệ G+C 50.4 % Khung đọc mở (ORF): 5,361 83 3 Vùng mã hóa protein 88.8 % Chiều dài trung bình của các ORF 904 bp 922 bp 579 bp rRNA (16S-23S-5S) 7 0 0 tRNA và tmRNA 103 0 0 Hình 1.2: Cấu trúc hệ gen của vi khuẩn E. coli O157:H7 4 download by : skknchat@gmail.
Đặc tính của E. coli O157:H7 là vi sinh vật hiếu kị khí tùy tiện, có khả năng hô hấp và lên men để trao đổi chất. Chúng không sinh bào tử, tế bào tồn tại dạng đơn lẻ hoặc theo cặp đôi. Vi khuẩn này có thể sinh trƣởng ở dải nhiệt độ rộng từ 80C đến 460C, nhiệt độ tối ƣu là 370C, bị tiêu diệt ở nhiệt độ trên 700C.
coli O157:H7 sinh truởng đƣợc trên môi trƣờng có pH từ 4,4 đến 9,0; thậm chí ở 370C trong 2 - 7h, nó vẫn có thể tồn tại đƣợc ở pH = 2,5 [43]; pH tối ƣu khoảng 6 - 7. Vi khuẩn này bị ức chế ở môi trƣờng có nồng độ muối là 8,5%, chậm phát triển ở nồng độ trên 2,5%. coli O157:H7 sống kí sinh trong hệ tiêu hóa của ngƣời và động vật. Tuy nhiên khi bị phóng thích ra ngoài môi trƣờng chúng vẫn tiếp tục tồn tại 2 - 3 ngày ở 250C, 10 - 31 ngày ở 80C.
Điều này càng làm cho chúng có khả năng lan rộng và xâm nhiễm vào các tế bào vật chủ mới [14]. coli O157:H7 có khả năng lên men đƣờng lactose. Trên môi trƣờng Endo agar khuẩn lạc E. coli O157:H7 tròn, lồi, có ánh kim (hình 1.3: Hình ảnh khuẩn lạc của E.
coli O157:H7 trên môi trƣờng Endo agar và trên môi trƣờng Fluorocult® E. coli O157:H7 không có khả năng lên men đƣờng sorbitol và cellobise. Vi khuẩn này không tạo ra -D-glucuronidase do đó không chuyển hóa 4- methylumbelliferyl--D-glucuronid (MUG) thành 4-methylumbelliferonenên khi chiếu dƣới đèn UV khuẩn lạc không phát huỳnh quang. Khi nuôi cấy trên môi trƣờng Fluorocult® có bổ sung sorbitol và 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronid (MUG), do không có khả năng lên men đƣờng sorbitol, khuẩn lạc có màu xanh nhạt 5 download by : skknchat@gmail.com phân biệt với các E.
coli khác có màu vàng do lên men đƣợc đƣờng sorbitol. Đây là đặc điểm đƣợc sử dụng trong xét nghiệm để phát hiện sự có mặt của vi khuẩn này [26]. coli O157:H7 là loại vi khuẩn có khả năng sinh độc tố. Chúng có khả năng sinh độc tố Shiga hay còn gọi độc tố Vero.
Loại độc tố này không gây hại đối với động vật nhƣng lại gây nguy hiểm cho ngƣời nhƣ gây tán huyết, suy thận, thậm chí tử vong [38]. coli O157:H7 có hai loại kháng nguyên là O và H. Kháng nguyên thân O (somatic antigen) là kháng nguyên của vách tế bào, cấu tạo bởi lipopolysaccharide, có trên 150 loại khác nhau. Đặc tính của kháng nguyên O: - Bền nhiệt, không bị hủy khi đun nóng 100oC trong 2h.
- Kháng cồn, không bị hủy khi tiếp xúc với cồn 50%. - Bị hủy bởi formol 5%. - Rất độc, chỉ cần 0,05 mg đủ để giết chuột nhắt sau 24h. Khi kháng nguyên O gặp kháng huyết thanh tƣơng ứng sẽ xảy ra phản ứng ngƣng kết O.
Kháng nguyên O giữ vai trò nhất định đối với khả năng gây bệnh của dòng vi khuẩn và có tính chất chuyên biệt cho từng loài vật chủ [7]. Kháng nguyên lông roi H (flagellar antigen): có trên 50 loại khác nhau, cấu tạo bởi protein và có tính chất không chịu nhiệt, bị hủy bởi cồn 50% và các proteinase, không bị hủy bởi formol 5%. Khi kháng nguyên H gặp kháng thể tƣơng ứng sẽ xảy ra hiện tƣợng ngƣng kết H [7,20]. Nguyên nhân và cơ chế gây bệnh của E.
coli O157:H7 là vi khuẩn sinh độc tố. Trong hệ gen nhân của vi khuẩn này chứa 2 gen mã hóa cho độc tố đặc trƣng của chúng là stx1 và stx2. Trong đó, stx viết tắt của Shiga – like – toxin [8]. Stx là một ngoại độc tố không bền nhiệt, tác động lên cả ruột và hệ thần kinh trung ƣơng của ngƣời.
coli O157:H7 gây tiêu chảy, xuất huyết, đồng thời ức chế hấp thu đƣờng và các acid amin ở ruột non. Theo kết quả nghiên cứu của Bộ môn vi sinh, Khoa Y, Đại học Y Dƣợc Tp. Hồ Chí 6 download by : skknchat@gmail.com Minh, năm 1996: Độc tố theo đƣờng máu gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đến hệ thần kinh, có thể dẫn đến mê sảng, biến chứng thần kinh trầm trọng: co giật, tê liệt. Stx1 và Stx2 đều có tiểu đơn vị A có hoạt tính enzyme và tiểu đơn vị B gắn với thụ thể đặc hiệu là một glycolipid kí hiệu Gb3 (thụ thể đặc hiệu của Stx2 là Gb4).
Các Gb3 thƣờng thấy ở các tế bào biểu mô thận, tế bào biểu mô ruột, tế bào biểu mô mạch [8]. Stx là một protein có tính kháng nguyên mạnh, mang tính chất của một ngoại độc tố, các gen mã hóa nằm trên chromosome. stx1 có tính bảo tồn cao trong khi stx2 rất hay thay đổi về trình tự [19,25]. Tất cả các loại Stx đều có chung một cấu trúc AB5, trong đó một tiểu đơn vị A kết hợp với năm tiểu đơn vị B.