Chương 1: Tổng quan Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết quả và bàn luận Chương 4: Kết luận và kiến nghị 5 Chương 2. Tổng quan về cellulose vi khuẩn (BC) 2. Giới thiệu Cellulose vi khuẩn (BC) là một chuỗi polymer các glucopyranose nối với nhau bằng liên kết β-1,4-glucan [16], Những polymer này gồm những thớ sợi tự nhiên rất mảnh được gọi là các sợi thứ cấp, có đường kính khoảng 1,5nm. Các thớ sợi thứ cấp kết lại thành những vi sợi, những vi sợi tạo thành bó sợi, những bó sợi tạo thành dải.
Mỗi dải có chiều dày 3 – 4 nm, và chiều dài 130 – 177 nm [16]. Một đoạn của cấu trúc cellulose vi khuẩn [17] Cấu trúc của BC sẽ khác nhau ở mỗi điều kiện nuôi cấy khác nhau. Tuy cấu trúc cellulose ở vi khuẩn rất khác so với cấu trúc cellulose ở thực vật nhưng BC có những đặc tính vượt trội hơn mà ở cellulose thực vật không có [18]. Một số đặc tính có thể kể đến như: chịu nhiệt tốt, có khả năng thấm hút nước cao, độ bền cơ học tốt, không độc, không gây dị ứng với người sử dụng, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao hơn cellulose của thực vật,.
Vào năm 1886, những nghiên cứu đầu tiên của Brown về sản xuất BC từ vi khuẩn A. xylinum đã thành công [19]. Nó đã khởi đầu và thu hút sự chú ý từ nửa sau của thế kỷ XX, hàng loạt những nghiên cứu tập trung sâu vào cơ chế tổng hợp, cũng như cấu trúc và đặc tính của cellulose đã ra đời. Vi khuẩn Gluconaccetobacter xylinus Cellulose vi khuẩn được nhiều loài vi sinh vật tổng hợp trong đó chủng A.
xylinum hay có tên gọi khác là Gluconacetobacter xylinus được biết đến nhiều nhất, đây cũng là loài vi khuẩn sinh tổng hợp cellulose hiệu quả nhất và được tập trung nghiên cứu nhiều nhất [20]. Vị trí phân loại của Gluconacetobacter xylinus 6 Đây là một vi khuẩn acetic thuộc họ Acetobacteraceae, họ này bao gồm các giống sau: Acetobacter, Acidomonas, Asaia, Gluconacetobacter, Gluconobacter và Kozakia [20]. Các loài vi khuẩn này trước đây được gọi với các tên gọi Acetobacter xylinus hay Acetobacter xylinum, sau này theo hệ thống phân loại của nhà khoa học Bergey (2005), được xếp lại vào giống Gluconacetobacter với tên gọi Gluconacetobacter xylinus. Đặc điểm hình thái G.
xylinus là vi khuẩn gram âm, thuộc loại vi khuẩn hiếu khí bắt buộc có khả năng tổng hợp sinh màng cellulose trong môi trường nuôi cấy tĩnh. Chúng có dạng trực khuẩn, hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước khoảng 2 µm [21]. Nhóm vi khuẩn này không có khả năng sinh bào tử, thường đứng riêng lẻ hoặc tập hợp với nhau thành một chuỗi. Khi chất dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy không đủ hoặc đã cạn kiệt, chúng biến đổi thành dạng có hình thái đặc biệt để thích nghi với điều kiện sống như: dạng tế bào phình to, kéo dài, phân nhánh hoặc không phân nhánh và dần dần sẽ gây thoái hóa giống làm giảm hoạt tính một cách đáng kể.
Đặc điểm sinh lý, sinh hóa Khoảng sinh trưởng của G. xylinus có thể phát triển trong phạm vi pH từ 3 đến o o 8, nhiệt độ từ 12 C đến 35 C và có thể phát triển trong môi trường có nồng độ ethanol o o lên tới 10% [21]. Khoảng nhiệt độ từ 25 C đến 30 C là nhiệt độ tối ưu để G. xylinus o phát triển, chúng không phát triển ở nhiệt độ 37 C ngay cả trong môi trường dinh dưỡng tối ưu và pH tối ưu để G.
xylinum phát triển là 5,5 [22]. xylinus có thể chuyển hóa glucose thành acid gluconic, điều này là nguyên nhân làm cho pH của môi trường nuôi cấy giảm từ 1 đến 2 đơn vị trong quá trình nuôi cấy. xylinus có khả năng chịu được pH thấp, vì thế người ta thường bổ sung thêm acid acetic hay acid citric vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ và tăng hiệu suất tổng hợp cellulose [23]. Đặc điểm nuôi cấy và nhu cầu dinh dưỡng Sau một thời gian khi nuôi cấy trên môi trường thạch sẽ hình thành các khuẩn lạc G.
xylinus nhẵn hoặc xù xì. Phần rìa của khuẩn lạc có thể gợn sóng hoặc bằng phẳng, màu trong suốt hoặc trắng. Có thể dễ dàng tách các khuẩn lạc khỏi môi trường nuôi cấy vì chúng thường lồi trên bề mặt môi trường. Khi nuôi cấy trên môi trường lỏng trong điều kiện tĩnh, sau một thời gian trên bề mặt của môi trường dần hình thành một lớp màng sinh học – màng BC.
Ngược lại, trong điều kiện nuôi cấy lắc sẽ tạo ra cellulose dạng hạt với các kích thước khác nhau và phân tán trong môi trường. Vì cấu trúc của cellulose trong từng điều kiện là khác nhau nên đặc tính của chúng trong từng điều kiện cũng là không giống nhau [24] [25]. Môi trường thích hợp để chủng vi khuẩn G. xylinus sinh trưởng, phát triển là môi trường tổng hợp có đầy đủ các chất dinh dưỡng thiết yếu như: C, N, S, P,.
Ngoài ra, các nguyên tố vi lượng và các yếu tố tăng trưởng cũng tạo điều kiện cho quá trình sinh trưởng phát triển của vi khuẩn thuận lợi hơn. Nhu cầu sử dụng đường của G. xylinus là rất lớn, do đó một số sản phẩm như nước dừa già, rỉ đường,. đã được đề xuất làm nguyên liệu nuôi cấy cho G.
Đặc tính của cellulose vi khuẩn 2. Cấu trúc kết tinh của cellulose vi khuẩn. Khái niệm về cấu trúc tinh thể cellulose vi khuẩn đối với các kĩ thuật công nghệ thời trước vẫn là một khái niệm xa vời vì không thể xác định và phân biệt được cấu trúc tinh thể trong cấu trúc cellulose vi khuẩn. Công nghệ lúc đó chỉ xác định được các loại cellulose thực vật trong tự nhiên đều được hình thành bởi hai loại cấu trúc tinh thể gồm cellulose Iα và Iβ [26].
Về sau nhờ vào các thiết bị công nghệ tiên tiến như phổ Raman, phổ cộng hưởng từ hạt nhân, phổ hồng ngoại và nhiễu xạ tia X đã giúp người ta xác định được kích thước và phân biệt cấu trúc cellulose vi khuẩn, xác định các dạng kết tinh của cellulose [27]. Nghiên cứu trong cấu trúc của các sợi cellulose trong màng BC chứa nhiều tinh thể Iα hơn cellulose thực vật. Các tinh thể Iα có nhiều trong cấu trúc của BC (khoảng 64-71%) hơn là trong cấu trúc của các cellulose thực vật (khoảng 20%) [28]. Ngược lại Iβ chủ yếu có trong thành phần cellulose hình thành nên thành tế bào của một số 8 loài thực vật bậc cao như cotton và gai.
Tỉ lệ Iα- Iβ trong BC có thể dao động tùy thuộc vào môi trường, nhiệt độ và chủng vi sinh vật. Có thể thấy cấu trúc tinh thể cũng đóng một vai trò quan trọng đến các tính chất của cellulose. Tuy nhiên đến hiện tại các đề tài nghiên cứu về mối quan hệ giữa các đặc tính của cellulose và cấu trúc tinh thể của nó vẫn còn hạn chế. Các tính chất của cellulose vi khuẩn.
Sau một thời gian nuôi cấy trong môi trường tĩnh, bề mặt của môi trường sẽ hình thành nên một lớp màng mỏng. Lớp màng này sau khi tinh chế, làm khô sẽ tạo thành sảm phẩm mỏng như giấy có độ dày 0. Một số đặc tính có thể kể đến của màng BC như: Quan sát màng BC trên kính hiển vi điện tử cho thấy màng có các sợi cellulose rất nhỏ, mảnh, đồng nhất, liên kết chặt chẽ với nhau [29]. Các sợi nhỏ không định hướng bao gồm các liên kết hydro ở mức độ dày đặc giúp cho BC có độ đàn hồi, độ bền, độ dai và sức căng của màng BC tốt, chịu được lực kéo cao.
Trọng lượng nhẹ, khả năng chịu nhiệt tốt [30]. Cellulose vi khuẩn là cellulose rất trong suốt, cấu trúc mạng tinh thể mịn, thành phần tỉ lệ Iα cao. Khả năng giữ nước và hấp thụ nước cực tốt, tính xốp chọn lọc do khối lượng phân tử cao, chắc và có mạng lưới liên kết hydro dày đặc [31]. Là loại màng sinh học không chứa các thành phần như ligin và hemicellulose vì vậy có thể bị phân hủy hoàn toàn bởi một số vi sinh vật, là nguồn tài nguyên có thể phục hồi.
Khi sử dụng không gây kích ứng, không gây độc cho con người, đặc biệt là màng BC có khả năng cản khuẩn khá tốt [29]. Quá trình sinh tổng hợp BC Quá trình sinh tổng hợp cellulose từ G. Xylinus trên được chia thành bốn giai đoạn chính (hình 3) [32]: đầu tiên glucose được phosphoryl hóa thành glucose- 6 - phosphate; tiếp theo glucose- 6 -phosphate được đồng phân hóa thành glucose- 1 - phosphate; glucose- 1 -phosphate được chuyển thành glucose uridinediphosphate; và cuối cùng là chuỗi glucan được tổng hợp từ glucose uridinediphosphate. Sau đó, chuỗi glucan song song được tổng hợp và kết tinh để tạo thành các vi sợi, các vi sợi tập hợp lại tại thành cellulose.
Cơ chế sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn [17] 2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp BC 2. Môi trường nuôi cấy Môi trường nuôi cấy của G. xylinus là môi trường tổng hợp bao gồm các nguồn dinh dưỡng cần thiết như carbon, nitrogen, sulfur và phosphate, các yếu tố tăng trưởng và các yếu tố vi lượng.
Một số môi trường nuôi cấy G. xylinus có nhu cầu sử dụng đường rất lớn và nó giữ vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp BC nên đã có rất nhiều nghiên cứu và đề nghị sử dụng các sản phẩm thứ cấp trong các ngành công nghiệp khác để làm nguyên liệu trong nuôi cấy G. Một trong những môi trường nuôi cấy truyền thống để nuôi cấy G. xylinus chính là nước dừa già.
Thành phần dinh dưỡng của nước dừa già trong 100g [33] Thành phần Hàm lượng (%) Nước 94,99% Protein 0,72% Chất béo toàn phần 0,2 % Carbohydrate 3,17% Đường 2.16% Ca 24 mg Fe 0,29 mg Mg 25 mg P 20 mg K 250 mg Na 105 mg Zn 0,1 mg Cu 0,04 mg Mangan 0,142 mg Selenium 1 µg Vitamin C 2,4 mg Vitamin B1 0,03 mg Vitamin B2 0,057 mg Vitamin B3 0,08 mg Vitamin B5 0,043 mg Vitamin B6 0,032 mg Vitamin B9 3 µg Nước dừa già không khó tìm, có thể mua tại các cơ sở sản xuất mứt dừa, dừa sấy hay cơ sở sản xuất dầu dừa tại các nhà máy sản xuất dầu dừa với giá thành rẻ. 11 Trong nước dừa chứa rất nhiều chất dinh dưỡng được trình bày ở bảng 1, chất kích thích tăng trưởng như 1,3 – diphenyllurea, hexitol, cytolunin, myoinositol, sorbitol,… Đó là môi trường dinh dưỡng thích hợp để cho G. xylinus sinh trưởng và phát triển để tổng hợp BC.