Khóa luận tốt nghiệp công nghệ sinh học xây dựng quy trình phát hiện papaya ringspot virus gây bệnh đốm vòng trên đu đủ bằng phương pháp sample pooling kết hợp kỹ thuật multiplex rt pcr

Khóa luận trình bày quy trình phát hiện virus papaya ringspot gây bệnh đốm vòng trên đu đủ bằng phương pháp sample pooling và multiplex rt pcr.

Trường đại học

Trường Đại Học Nông Lâm

Chuyên ngành

Công Nghệ Sinh Học

Người đăng

Ẩn danh

Thể loại

Khóa Luận Tốt Nghiệp

2023

58
1
0

Phí lưu trữ

30 Point

Mục lục chi tiết

LỜI CẢM ƠN

XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN

TÓM TẮT

1. CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ

1.1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.1. Nguồn gốc và phân loại khoa học

1.1.2. Đặc điểm thực vật học của cây đu đủ

1.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến cây đu đủ

2. CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Phương pháp nghiên cứu

3. CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

3.2. Vật liệu và hóa chất

3.3. Thiết bị và dụng cụ

3.4. Phương pháp nghiên cứu

3.4.1. Quy trình ly trích RNA tổng số bằng cột silica

3.4.2. Xác định nồng độ và độ tinh sạch bằng máy quang phổ

3.4.3. Tổng hợp cDNA bằng enzyme phiên mã ngược

3.4.4. Phản ứng khuếch đại đoạn gen mục tiêu bằng kỹ thuật RT-PCR

3.4.5. Điện di sản phẩm sau phản ứng khuếch đại và giải trình tự

3.4.6. Xây dựng quy trình phát hiện virus PRSV bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR

3.4.6.1. Thiết kế primer cho phản ứng multiplex RT-PCR
3.4.6.2. Tối ưu hóa nhiệt độ cho phản ứng multiplex RT-PCR
3.4.6.3. Tối ưu hóa nồng độ primer cho phản ứng multiplex RT-PCR

3.4.7. Xây dựng quy trình sample pooling trong nhận dạng virus PRSV gây bệnh đốm vòng trên cây đu đủ

3.4.8. Phản ứng multiplex RT-PCR lần 1

3.4.9. Phản ứng multiplex RT-PCR lần 2

3.4.10. Phát hiện PRSV trên mẫu thu thập thực địa bằng quy trình sample pooling

3.4.11. So sánh hiệu quả phát hiện PRSV của phương pháp sample pooling với phương pháp RT-PCR từng mẫu đơn lẻ

4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Kết quả ly trích RNA

4.2. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR

4.3. Tối ưu hóa nhiệt độ cho phản ứng multiplex RT-PCR

4.4. Tối ưu hóa nồng độ primer cho phản ứng multiplex RT-PCR

4.5. Xây dựng quy trình sample pooling trong nhận dạng virus PRSV gây bệnh đốm vòng trên cây đu đủ

4.6. Phát hiện PRSV trên mẫu thu thập thực địa bằng quy trình sample pooling

4.7. So sánh hiệu quả phát hiện PRSV của phương pháp sample pooling với phương pháp RT-PCR từng mẫu đơn lẻ

5. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

DANH SÁCH CÁC BẢNG

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Virus Papaya Ringspot Gây Bệnh Đốm Vòng

Virus Papaya Ringspot (PRSV) là một trong những loại virus gây hại nghiêm trọng nhất cho cây đu đủ. Bệnh đốm vòng do virus này gây ra không chỉ ảnh hưởng đến năng suất mà còn làm giảm chất lượng trái đu đủ. Việc phát hiện sớm virus này là rất quan trọng để kiểm soát và ngăn chặn sự lây lan của bệnh. Nghiên cứu này nhằm xây dựng quy trình phát hiện virus PRSV một cách hiệu quả và chính xác.

1.1. Nguồn Gốc và Phân Loại Virus Papaya Ringspot

Virus Papaya Ringspot có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới và được phân loại thuộc họ Potyviridae. Virus này có khả năng lây lan nhanh chóng qua các phương tiện như côn trùng và hạt giống.

1.2. Biểu Hiện Của Bệnh Đốm Vòng Trên Đu Đủ

Bệnh đốm vòng trên đu đủ thường biểu hiện qua các đốm vàng trên lá, làm giảm khả năng quang hợp và ảnh hưởng đến sự phát triển của cây. Các triệu chứng này thường xuất hiện ở giai đoạn đầu của sự phát triển cây.

II. Thách Thức Trong Việc Phát Hiện Virus Papaya Ringspot

Việc phát hiện virus PRSV gặp nhiều thách thức do triệu chứng bệnh thường không rõ ràng ở giai đoạn đầu. Điều này dẫn đến việc cây bị nhiễm bệnh không được phát hiện kịp thời, gây thiệt hại lớn cho nông dân. Hơn nữa, virus này có khả năng lây lan nhanh chóng, làm tăng nguy cơ lây nhiễm trong các vườn đu đủ.

2.1. Khó Khăn Trong Việc Nhận Diện Sớm Virus

Nhiều nông dân không thể nhận diện virus PRSV cho đến khi triệu chứng rõ ràng xuất hiện, dẫn đến việc mất mùa và thiệt hại kinh tế.

2.2. Tác Động Của Virus Đến Năng Suất Đu Đủ

Virus PRSV có thể làm giảm năng suất đu đủ lên đến 80%, ảnh hưởng nghiêm trọng đến thu nhập của nông dân và ngành nông nghiệp.

III. Phương Pháp Phát Hiện Virus Papaya Ringspot Hiệu Quả

Nghiên cứu đã xây dựng quy trình phát hiện virus PRSV bằng phương pháp sample pooling kết hợp với kỹ thuật multiplex RT-PCR. Phương pháp này cho phép phát hiện virus một cách nhanh chóng và chính xác, giúp nông dân có thể kiểm soát bệnh kịp thời.

3.1. Kỹ Thuật Multiplex RT PCR Trong Phát Hiện Virus

Kỹ thuật multiplex RT-PCR cho phép khuếch đại nhiều đoạn gen khác nhau trong một phản ứng, giúp phát hiện virus PRSV một cách hiệu quả hơn.

3.2. Quy Trình Sample Pooling Để Tăng Hiệu Quả Phát Hiện

Quy trình sample pooling cho phép gộp nhiều mẫu đu đủ lại với nhau, giúp tiết kiệm thời gian và chi phí trong việc phát hiện virus.

IV. Ứng Dụng Quy Trình Phát Hiện Virus Trong Thực Tiễn

Quy trình phát hiện virus PRSV đã được áp dụng thành công trên 30 mẫu đu đủ thu thập từ thực địa. Kết quả cho thấy quy trình này có độ chính xác cao và có thể thay thế các phương pháp truyền thống.

4.1. Kết Quả Nghiên Cứu Từ Mẫu Thực Địa

Kết quả từ 30 mẫu đu đủ cho thấy quy trình sample pooling kết hợp với multiplex RT-PCR cho kết quả tương tự như phương pháp PCR truyền thống.

4.2. Lợi Ích Kinh Tế Từ Việc Phát Hiện Sớm Virus

Việc phát hiện sớm virus PRSV giúp nông dân giảm thiểu thiệt hại, bảo vệ năng suất và chất lượng đu đủ, từ đó nâng cao thu nhập.

V. Kết Luận Về Quy Trình Phát Hiện Virus Papaya Ringspot

Quy trình phát hiện virus Papaya Ringspot bằng phương pháp sample pooling kết hợp multiplex RT-PCR đã chứng minh hiệu quả trong việc phát hiện sớm virus. Nghiên cứu này không chỉ giúp bảo vệ cây đu đủ mà còn góp phần vào sự phát triển bền vững của ngành nông nghiệp.

5.1. Tương Lai Của Nghiên Cứu Về Virus PRSV

Nghiên cứu sẽ tiếp tục được mở rộng để cải thiện quy trình phát hiện và phát triển các giống đu đủ kháng bệnh.

5.2. Khuyến Nghị Đối Với Nông Dân

Nông dân nên áp dụng quy trình phát hiện virus PRSV để bảo vệ cây trồng và nâng cao năng suất, đồng thời cần thường xuyên theo dõi tình trạng sức khỏe của cây đu đủ.

09/07/2025
Khóa luận tốt nghiệp công nghệ sinh học xây dựng quy trình phát hiện papaya ringspot virus gây bệnh đốm vòng trên đu đủ bằng phương pháp sample pooling kết hợp kỹ thuật multiplex rt pcr

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Du đủ (Carica papaya Caricaceae) là một loại cây nhiệt đới phổ biến có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới Châu Mỹ, là loài duy nhất trong Chi đu đủ (Carica), thuộc Họ đu đủ (Caricaceae hay Papayaceae). Trong quả du đủ chín có hàm lượng dinh dưỡng cao, theo phân tích thành phần hoá học, trong 100g thịt trái chín có chứa 86,6 % nước, 12,1 % tinh bột, 0,6 % protein, 0,3 % lipit, năng lượng là 50 calo, 0,7 % xơ, 0,5 % tro và khá nhiều khoáng như: Kali (204 mg), Ca (34 mg), P (11 mg). Đặc biệt, đu đủ cung cấp lượng vitamin rất phong phú: vitamin A (450 mg), C (74 mg), B1 (0,03 mg), P (0,5 mg), B2 (0,04mg) (Trần Thế Tục, 1998). Day là loại qua đặc sản của vùng nhiệt đới, có giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế cao.

Ở Việt Nam, đu đủ được trồng rộng rãi trên phạm vi cả nước, trồng nhiều nhất ở các vùng trung du đặc biệt là các tỉnh miền Đông Nam Bộ. Với các giống đu đủ được trồng phô biến là: đu đủ ta, đu đủ Mehico, đu đủ Trung Quốc, du đủ Solo, du đủ Thai Lan, đu đủ Đài Loan,. Tuy nhiên việc sản xuất đang bị hạn chế bởi bệnh do Papaya ringspot virus (PRSV) (Gonsalves, 1998). Day là virus gây thiệt hại hang đầu đối với canh tác đu đủ.

Do tính chất gây bệnh đặc trưng của virus là lây lan rất nhanh và không thê kiểm soát bang hóa chất hay bat kì phương thức nao ma chỉ có thé khắc phục bằng cách phòng trừ và sử dụng giống kháng bệnh nên thiệt hại của bệnh rất nghiêm trọng. Thêm vào đó, bệnh lại rất khó nhận biết ở giai đoạn sớm, đến khi ta quan sát được triệu chứng một cách rõ ràng thì đã quá muộn và thường không chính xác, gây nên nhiều thiệt hại nặng nề. Thiệt hai đáng kế do PRSV đối với việc canh tác đu đủ đã làm nảy sinh nhu cầu làm sao dé sớm phát hiện và loại bỏ cây bị nhiễm bệnh. Vì vậy, đề tài “Xay dựng quy trình phát hiện Papaya ringspot virus gây bệnh đốm vòng trên đu đủ bằng phương pháp sample pooling kết hợp kỹ thuật multiplex RT — PCR” được thực hiện nhằm giúp phát hiện sớm mầm bệnh và ngăn chặn kịp thời, giúp giảm bớt thiệt hại do virus PRSV gây ra.

Mục đích nghiên cứu Xây dựng quy trình phát hiện — chan đoán bệnh PRSV (Papaya ringspot virus) bằng phương pháp sample polling kết hợp kỹ thuật multiplex RT — PCR nhằm chan đoán chính xác và hiệu quả nguồn bệnh trong quá trình phòng trừ bệnh hại do virus gây ra. Nội dung thực hiện Nội dụng 1: Xây dựng quy trình phát hiện virus PRSV bằng kỹ thuật multilex RT —PCR Nội dung 2: Xây dựng quy trình sample pooling phát hiện virus PRSV gây bệnh trên cây đu đủ Nội dung 3: Ứng dụng quy trình phát hiện PRSV bằng kỹ thuật sample pooling trên các mẫu thu thập từ thực địa. TONG QUAN TÀI LIEU 2. Sơ lược về cây đu đủ 2.

Nguồn gốc và phân loại khoa học 2. Phần loại khoa học Du đủ có tên khoa học là Carica papaya là một cây thuộc ho Du đủ. Papaya Ở một số nơi trên thé giới, đặc biệt là ở Australia và một vai đảo ở phía đông An Độ, cây đu đủ được biết đến với tên gọi là papaw hay pawpaw. Bên cạnh tên papaya rất phô biến thì ở Nam A va Đông Ấn Độ nó còn có các tên gọi bị sai lệch đi như kapaya, kepaya.

lapaya hay tapaya. Ở Pháp, trái du đủ được gọi là papaye, còn cây đu đủ là papayer, đôi khi được gọi theo tên nội dia là figuier des Iles. Theo tiếng Tây Ban Nha, trái đu đủ được gọi là mélon zapote, lechosa, papaya; còn cây du đủ có tên là papayo hay papayero, fruta bomba, mamón hay mamona tùy thuộc vào từng nước. Ở Brazil, tên thông dụng của nó là mamao.

Ở Châu Âu, khi được phát hiện lần đầu tiên nó được đặt cho tên địa phương là “free melon” (James, 1983). Nguồn gốc Chi Du đủ (Carica) có một loài đuy nhất là Du đủ (Carica papayai) thuộc Họ du đủ (Caricaceae hay Papayaceae). Loài này có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới của Châu Mỹ, từ vùng đất thấp ở miền nam Mexico, miền đông Trung Mỹ, và bắc Nam Mỹ. Nó đã được người Tây Ban Nha đưa tới Philippines vào khoảng năm 1550.

Từ đây nó được đưa vào khu vực nhiệt đới châu Á, châu Phi. Ngày nay, du đủ được trồng lù phần lớn các nước nhiệt đới như Brasil, An D6, Sri Lanka, Philippines, Việt Nam. Đặc điểm thực vật học của cây Du đủ Rễ: Là loại rễ chùm, có các nhánh rễ đâm ngang tương đương với độ rộng của tán lá, rễ cây đu đủ ăn nông tập trung 6 tang dat từ 0 -30em. Cây du đủ có bộ rễ nhỏ, giòn, mềm không chịu được ngập tng hoặc khô hạn khi gặp thời tiết bat lợi.

Thân: Thân cây đu đủ là dạng thân mềm, bán mộc, cây có màu xám xanh hoặc nâu xám, thân không phân nhánh khi đang trong giai đoạn sinh trưởng phát triển. Cây đu đủ có thân rỗng, có các mô yếu, thân hóa gỗ kém. Trong điều kiện sinh trưởng, phát triển tốt cây có chiều cao trung bình từ 3 —7 m, mang một chùm lá trên phía ngọn. Lá: Lá du đủ mọc cách, so le, không có lá kèm.

Cuống dai 60 — 70 cm, rong. Gan lá hình chân vịt. Trong các tháng có nhiệt độ cao, dinh dưỡng nước day đủ, du đủ có thé ra 9— ]] lá. Hoa: Hoa màu trắng phớt vàng nhạt, mọc thành chùm xim ở nách những lá già.

Hoa đơn tính thường khác gốc, nhưng cũng có cây vừa mang cả hoa đực; hoa cái và hoa lưỡng tính, hoặc có hoa cái và hoa lưỡng tính. Cụm hoa đực phân nhánh nhiều, có cuống, rất dai. Cụm hoa cái chỉ gồm 2 — 3 hoa. Quả: Quả mọng to, thịt quả đày, trong ruột quả có nhiều hạt đen.

Dạng quả đu đủ thường tùy vào loại hoa đã thụ phan là hình trứng hay hình cầu do hoa cái phát triển, hình thon dài do hoa lưỡng tính tạo thành. Hạt: Thon gần tròn, mọc trong phần rồng của ruột quả. Hạt già có màu xám hoặc đen và thường chìm trong nước. Bên ngoài hạt có lớp vỏ lụa mỏng, cản thắm nước nên cần chà bóc vỏ trước khi gieo.

Các yếu tố ảnh hưởng đến cây Du đủ 313,1. Bat Du đủ có thể trồng trên nhiều loại đất khác nhau, tuy nhiên đất trồng đó phải thoáng, tiêu và thoát nước tốt, tầng canh tác dày và đủ chất dinh dưỡng, đặc biệt là lân và kali. Đất có tầng dày 7 cm, hàm lượng khí trong đất khoảng 4%, độ pH đạt khoảng 6,5 —7 được coi là thích hợp dé trồng du đủ 2. Nước Du đủ là cây có yêu cầu cao về nước đo có diện tích lá lớn song rất dé bị ing.

Do cau trúc của lá và lớp bảo vệ trên bộ mặt lá, đu đủ chịu hạn rất kém. Lượng nước du đủ cần khoảng 1. Khi đủ nước và cấp nước kịp thời cây sẽ sinh trưởng liên tục và cho năng suất cao. Cây cần nhiều nước trong giai đoạn vươn cao, giai đoạn hoa và giai đoạn nhanh lớn của quả.

Mùa đông hoặc thời tiết lạnh, cây cần ít nước. Nhiệt độ Do có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới nên đu đủ cần nhiệt độ cao dé sinh trưởng va phát triển, đây là yêu tố hạn chế sự phân bồ và phát triển của đu đủ. Nhiệt độ thích hợp nhất cho cây sinh trưởng và phát triển là 25 — 30°C. Khi nhiệt độ trên 44°C và cường độ chiếu sáng mạnh, cây sẽ bị mat nước và héo.

Nhiệt độ thấp hơn 15°C, làm giảm sự ra lá, quả phát triển chậm và chất lượng quả kém. Nếu nhiệt độ quá lạnh hoặc có sương muối, bộ lá của cây bị tốn hại, các bó mạch bị vỡ làm chảy nhựa và dan đến chết nếu lạnh quá dài. Nhiệt độ —2°C là nhiệt độ gây chết đối với cây. Gió và bão Do bộ rễ ăn nông và là thân thảo nên đu đủ chịu gió, bão rất kém nhất là thời kì cây đang mang quả.

Gió mạnh làm lá cây bị rách ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của cây và quả, gió to là đồ cây, gây xây xát thân, làm chảy nhựa tạo điều kiện cho nắm bệnh phát triển. Giá trị của cay Du đủ 2. Giá trị dinh dưỡng Du đủ chín chứa tới 90% nước, 13% đường, không có tinh bột, có nhiều carotenoit acid hữu cơ, vitamin: A, B, C, 0,9% chất béo, xenluloz (0,5%), canxi, photpho, magié, sat, thiamin, riboflavin. Trong 100g du du xanh có 74 —80 mg vitamin C va 500 —1.

Du đủ còn có các vitamin BI, B2, các acid gây men va khoáng chất như kali, canxi, magié, sat va kém. Ngoài các dưỡng chat nói ở trên thì đu đủ xanh còn được các nhà khoa học phát hiện nó có chứa khoảng 4% chất nhựa latex nhựa có thể tìm thấy ở quả đu đủ xanh, lá và thân cây. Trong latex có chứa chất men tiêu hóa chất đạm (proteaza) va papain. Những chất có tác dung rất tốt cho sức khỏe con người.

Ước tính 1 năm có thé thu hoạch được 100 g nhựa từ đu đủ. Cùng với đó là các chất chymopapain va papaya protenaza có trong qua du đủ xanh. Papain giống như papain chứa trong da day và trysin trong tuyến tụy đều có tác dụng tiêu hóa trong các bộ phận này. Bên cạnh đó papain còn có tác dụng ức chế vi khuẩn, hạn chế Staphillococ va vi trùng thương hàn.

Ngoai ra, Papain còn có tác dụng làm đông sữa và giảm độc đôi với toxin và toxanpunin. La du đủ chứa hàm lượng ancaloit carpain, có tac dụng như glucozit trong dương địa hoàng (digitalis) có tác dụng làm chậm nhịp tim và làm liệt amit. Hat du đủ chứa 2 chất glucozit caricin va myrosin. Hàm lượng dinh dưỡng có trong các thành phần của cây đu đủ được công bố từ Trung Mỹ và Cuba (James, 1983) Bang 2.

Giá trị dinh dưỡng có trong 100 g bộ phận có thé ăn được của cây đu đủ Thành phần Trái Lá Calories 23,11 —25,8 Lượng nước 85,9—92,6g 83,3 % Protein 0,081 — 0,34 g 5,6% Chất béo 0,05 — 0,96 g 0,4 % Carbohydrates 6,17—6,75g 8,3% Chất xơ 0,5— 1,3 g 1,0% Chất tro 0,31 — 0,66 g 1,4% Calcium 12,9 — 40,8 mg 0,406 % (CO) Phosphorus 5,3 — 22,0 mg Sat 0,25 — 0,78 mg 0,00636 % Carotene 0,0045 — 0,676 mg 28,900 LŨ. Thiamine 0,021 — 0,036 mg Riboflavin 0,024 — 0,058 mg Niacin 0,227 — 0,555 mg Ascorbic Acid 35,5 —71,3 mg 38.6% Tryptophan 4-5 mg Methionine 1 mg Lysine 15-16 mg Magnesium 0,035 % Phosphoric Acid 0,225 % 2. Giá trị thực phẩm Du đủ phổ biến nhất là được sử dụng dưới dạng tươi sống.

Nội dung được bảo vệ bản quyền — Tải xuống đầy đủ

Tài liệu có tiêu đề Xây Dựng Quy Trình Phát Hiện Virus Papaya Ringspot Gây Bệnh Đốm Vòng Trên Đu Đủ cung cấp một cái nhìn sâu sắc về quy trình phát hiện virus Papaya Ringspot, một trong những mối đe dọa lớn đối với cây đu đủ. Tài liệu này không chỉ mô tả các phương pháp phát hiện virus mà còn nhấn mạnh tầm quan trọng của việc bảo vệ cây trồng và nâng cao năng suất nông nghiệp. Độc giả sẽ tìm thấy những thông tin hữu ích về cách thức phát hiện sớm và quản lý bệnh, từ đó giúp nông dân có thể áp dụng các biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

Để mở rộng kiến thức của bạn về lĩnh vực này, bạn có thể tham khảo tài liệu Khóa luận tốt nghiệp công nghệ sinh học đánh giá đa dạng di truyền của các giống mè trắng sesamum indicum l dựa trên các yếu tố cấu thành năng suất và chỉ thị sinh học phân tử issr. Tài liệu này sẽ giúp bạn hiểu rõ hơn về sự đa dạng di truyền trong nông nghiệp và cách mà các yếu tố này ảnh hưởng đến năng suất cây trồng. Mỗi tài liệu đều là một cơ hội để bạn khám phá sâu hơn về các chủ đề liên quan, từ đó nâng cao kiến thức và kỹ năng trong lĩnh vực nông nghiệp.