Khóa luận tốt nghiệp công nghệ sinh học xây dựng quy trình phát hiện papaya ringspot virus gây bệnh đốm vòng trên đu đủ bằng phương pháp sample pooling kết hợp kỹ thuật multiplex rt pcr

Khóa luận trình bày quy trình phát hiện virus papaya ringspot gây bệnh đốm vòng trên đu đủ bằng phương pháp sample pooling và multiplex rt pcr.

• Tác giả: Ngô Thanh Thúy
• Người hướng dẫn: TS. Huỳnh Văn Biết
• Trường học: Trường Đại Học Nông Lâm
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Xây Dựng Quy Trình Phát Hiện Virus Papaya Ringspot Gây Bệnh Đốm Vòng Trên Đu Đủ
• Loại tài liệu: Khóa Luận Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Thủ Đức

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN
• TÓM TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1.1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại khoa học
• 1.1.2. Đặc điểm thực vật học của cây đu đủ
• 1.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến cây đu đủ
• 2. CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Phương pháp nghiên cứu
• 3. CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 3.2. Vật liệu và hóa chất
• 3.3. Thiết bị và dụng cụ
• 3.4. Phương pháp nghiên cứu
• 3.4.1. Quy trình ly trích RNA tổng số bằng cột silica
• 3.4.2. Xác định nồng độ và độ tinh sạch bằng máy quang phổ
• 3.4.3. Tổng hợp cDNA bằng enzyme phiên mã ngược
• 3.4.4. Phản ứng khuếch đại đoạn gen mục tiêu bằng kỹ thuật RT-PCR
• 3.4.5. Điện di sản phẩm sau phản ứng khuếch đại và giải trình tự
• 3.4.6. Xây dựng quy trình phát hiện virus PRSV bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR
• 3.4.6.1. Thiết kế primer cho phản ứng multiplex RT-PCR
• 3.4.6.2. Tối ưu hóa nhiệt độ cho phản ứng multiplex RT-PCR
• 3.4.6.3. Tối ưu hóa nồng độ primer cho phản ứng multiplex RT-PCR
• 3.4.7. Xây dựng quy trình sample pooling trong nhận dạng virus PRSV gây bệnh đốm vòng trên cây đu đủ
• 3.4.8. Phản ứng multiplex RT-PCR lần 1
• 3.4.9. Phản ứng multiplex RT-PCR lần 2
• 3.4.10. Phát hiện PRSV trên mẫu thu thập thực địa bằng quy trình sample pooling
• 3.4.11. So sánh hiệu quả phát hiện PRSV của phương pháp sample pooling với phương pháp RT-PCR từng mẫu đơn lẻ
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả ly trích RNA
• 4.2. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR
• 4.3. Tối ưu hóa nhiệt độ cho phản ứng multiplex RT-PCR
• 4.4. Tối ưu hóa nồng độ primer cho phản ứng multiplex RT-PCR
• 4.5. Xây dựng quy trình sample pooling trong nhận dạng virus PRSV gây bệnh đốm vòng trên cây đu đủ
• 4.6. Phát hiện PRSV trên mẫu thu thập thực địa bằng quy trình sample pooling
• 4.7. So sánh hiệu quả phát hiện PRSV của phương pháp sample pooling với phương pháp RT-PCR từng mẫu đơn lẻ
• 5. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
• DANH SÁCH CÁC BẢNG
• DANH SÁCH CÁC HÌNH

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Virus Papaya Ringspot Gây Bệnh Đốm Vòng

Virus Papaya Ringspot (PRSV) là một trong những loại virus gây hại nghiêm trọng nhất cho cây đu đủ. Bệnh đốm vòng do virus này gây ra không chỉ ảnh hưởng đến năng suất mà còn làm giảm chất lượng trái đu đủ. Việc phát hiện sớm virus này là rất quan trọng để kiểm soát và ngăn chặn sự lây lan của bệnh. Nghiên cứu này nhằm xây dựng quy trình phát hiện virus PRSV một cách hiệu quả và chính xác.

1.1. Nguồn Gốc và Phân Loại Virus Papaya Ringspot

Virus Papaya Ringspot có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới và được phân loại thuộc họ Potyviridae. Virus này có khả năng lây lan nhanh chóng qua các phương tiện như côn trùng và hạt giống.

1.2. Biểu Hiện Của Bệnh Đốm Vòng Trên Đu Đủ

Bệnh đốm vòng trên đu đủ thường biểu hiện qua các đốm vàng trên lá, làm giảm khả năng quang hợp và ảnh hưởng đến sự phát triển của cây. Các triệu chứng này thường xuất hiện ở giai đoạn đầu của sự phát triển cây.

II. Thách Thức Trong Việc Phát Hiện Virus Papaya Ringspot

Việc phát hiện virus PRSV gặp nhiều thách thức do triệu chứng bệnh thường không rõ ràng ở giai đoạn đầu. Điều này dẫn đến việc cây bị nhiễm bệnh không được phát hiện kịp thời, gây thiệt hại lớn cho nông dân. Hơn nữa, virus này có khả năng lây lan nhanh chóng, làm tăng nguy cơ lây nhiễm trong các vườn đu đủ.

2.1. Khó Khăn Trong Việc Nhận Diện Sớm Virus

Nhiều nông dân không thể nhận diện virus PRSV cho đến khi triệu chứng rõ ràng xuất hiện, dẫn đến việc mất mùa và thiệt hại kinh tế.

2.2. Tác Động Của Virus Đến Năng Suất Đu Đủ

Virus PRSV có thể làm giảm năng suất đu đủ lên đến 80%, ảnh hưởng nghiêm trọng đến thu nhập của nông dân và ngành nông nghiệp.

III. Phương Pháp Phát Hiện Virus Papaya Ringspot Hiệu Quả

Nghiên cứu đã xây dựng quy trình phát hiện virus PRSV bằng phương pháp sample pooling kết hợp với kỹ thuật multiplex RT-PCR. Phương pháp này cho phép phát hiện virus một cách nhanh chóng và chính xác, giúp nông dân có thể kiểm soát bệnh kịp thời.

3.1. Kỹ Thuật Multiplex RT PCR Trong Phát Hiện Virus

Kỹ thuật multiplex RT-PCR cho phép khuếch đại nhiều đoạn gen khác nhau trong một phản ứng, giúp phát hiện virus PRSV một cách hiệu quả hơn.

3.2. Quy Trình Sample Pooling Để Tăng Hiệu Quả Phát Hiện

Quy trình sample pooling cho phép gộp nhiều mẫu đu đủ lại với nhau, giúp tiết kiệm thời gian và chi phí trong việc phát hiện virus.

IV. Ứng Dụng Quy Trình Phát Hiện Virus Trong Thực Tiễn

Quy trình phát hiện virus PRSV đã được áp dụng thành công trên 30 mẫu đu đủ thu thập từ thực địa. Kết quả cho thấy quy trình này có độ chính xác cao và có thể thay thế các phương pháp truyền thống.

4.1. Kết Quả Nghiên Cứu Từ Mẫu Thực Địa

Kết quả từ 30 mẫu đu đủ cho thấy quy trình sample pooling kết hợp với multiplex RT-PCR cho kết quả tương tự như phương pháp PCR truyền thống.

4.2. Lợi Ích Kinh Tế Từ Việc Phát Hiện Sớm Virus

Việc phát hiện sớm virus PRSV giúp nông dân giảm thiểu thiệt hại, bảo vệ năng suất và chất lượng đu đủ, từ đó nâng cao thu nhập.

V. Kết Luận Về Quy Trình Phát Hiện Virus Papaya Ringspot

Quy trình phát hiện virus Papaya Ringspot bằng phương pháp sample pooling kết hợp multiplex RT-PCR đã chứng minh hiệu quả trong việc phát hiện sớm virus. Nghiên cứu này không chỉ giúp bảo vệ cây đu đủ mà còn góp phần vào sự phát triển bền vững của ngành nông nghiệp.

5.1. Tương Lai Của Nghiên Cứu Về Virus PRSV

Nghiên cứu sẽ tiếp tục được mở rộng để cải thiện quy trình phát hiện và phát triển các giống đu đủ kháng bệnh.

5.2. Khuyến Nghị Đối Với Nông Dân

Nông dân nên áp dụng quy trình phát hiện virus PRSV để bảo vệ cây trồng và nâng cao năng suất, đồng thời cần thường xuyên theo dõi tình trạng sức khỏe của cây đu đủ.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Cây đu đủ (Carica papaya L., thuộc họ Caricaceae) là cây ăn quả nhiệt đới có giá trị dinh dưỡng và hiệu quả kinh tế cao. Trong 100 g thịt quả chín chứa 86,6% nước, 12,1% tinh bột, 0,6% protein, 0,3% lipid, 0,7% xơ, cùng hàm lượng khoáng và vitamin đa dạng như kali (204 mg), canxi (34 mg), vitamin A (450 mg), vitamin C (74 mg). Tại Việt Nam, cây đu đủ được canh tác rộng rãi ở nhiều vùng sinh thái, đặc biệt là khu vực trung du và các tỉnh Đông Nam Bộ. Tuy nhiên, hoạt động sản xuất đu đủ đang đối mặt với thiệt hại nghiêm trọng do bệnh đốm vòng gây ra bởi Papaya ringspot virus (PRSV).

PRSV là loại virus lây lan nhanh qua côn trùng môi giới (rệp muội) và qua vết thương cơ học, không thể phòng trị bằng thuốc hóa học mà chủ yếu dựa vào việc sử dụng giống kháng và loại bỏ nguồn bệnh sớm. Việc chẩn đoán bệnh dựa trên triệu chứng hình thái thường gặp khó khăn ở giai đoạn đầu hoặc dễ nhầm lẫn do hiện tượng ẩn triệu chứng. Do đó, yêu cầu đặt ra là phải xây dựng được phương pháp xét nghiệm phân tử vừa có độ nhạy, độ đặc hiệu cao, vừa tiết kiệm chi phí và thời gian khi xử lý số lượng mẫu lớn.

Mục đích nghiên cứu: Xây dựng quy trình phát hiện và chẩn đoán virus PRSV gây bệnh đốm vòng trên cây đu đủ bằng phương pháp gộp mẫu (sample pooling) kết hợp kỹ thuật multiplex RT-PCR, nhằm nâng cao độ chính xác và hiệu quả kinh tế trong công tác quản lý dịch bệnh.

Nhiệm vụ nghiên cứu:

1. Xây dựng quy trình phát hiện virus PRSV bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR kết hợp đối chứng nội.
2. Xây dựng quy trình sample pooling nhằm xác định ngưỡng phát hiện virus PRSV trong mẫu gộp.
3. Ứng dụng quy trình sample pooling kết hợp multiplex RT-PCR để phát hiện PRSV trên các mẫu đu đủ thu thập từ thực địa.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Cây đu đủ (Carica papaya), Papaya ringspot virus (PRSV), bộ gen RNA tổng số của đu đủ và PRSV, các cặp mồi đặc hiệu khuếch đại gen P3 của PRSV và gen actin của đu đủ.
• Phạm vi thời gian: Từ tháng 8/2022 đến tháng 12/2022.
• Phạm vi không gian: Phòng 204 – Phòng Sinh học phân tử, Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh; vùng thu mẫu thực địa tại xã Bình Hòa Nam, huyện Đức Huệ, tỉnh Long An (tọa độ 10°48'59.8"E).

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và đối tượng virus

Papaya ringspot virus (PRSV) thuộc chi Potyvirus, họ Potyviridae, có cấu trúc hạt xoắn mềm dẻo kích thước 760–800 nm × 12 nm, vật chất di truyền là phân tử RNA sợi đơn dương (ssRNA(+)) kích thước khoảng 12 kb. PRSV được chia thành hai chủng chính: PRSV-p (gây hại trên đu đủ và cây họ Bầu bí) và PRSV-w (chỉ gây hại trên cây họ Bầu bí). Virus lây truyền không bền vững qua các loài rệp muội như rệp bông (Aphis gossypii) và rệp đào (Myzus persicae), có sự hỗ trợ của protein thể vùi vô định hình (AI).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

• Ly trích RNA tổng số: Sử dụng bộ kit EZ-10 Spin Column Plant RNA Mini-Preps Kit (BioBasic, Canada) dựa trên nguyên lý hấp phụ màng silica. Nồng độ và độ tinh sạch RNA được xác định bằng máy đo quang phổ BioDrop thông qua tỷ số $A_{260}/A_{280}$.
• Phiên mã ngược (Reverse Transcription): Tổng hợp mạch cDNA từ khuôn RNA tổng số bằng bộ hóa chất SensiFAST cDNA Synthesis Kit (Bioline, Anh) với chu trình nhiệt: $25^\circ\text{C}$ (10 phút) $\rightarrow 42^\circ\text{C}$ (15 phút) $\rightarrow 48^\circ\text{C}$ (15 phút) $\rightarrow 85^\circ\text{C}$ (5 phút).
• Thiết kế mồi và kiểm tra phân tử: Thiết kế mồi đặc hiệu bằng phần mềm Primer3 và kiểm tra độ đặc hiệu bằng công cụ BLAST trên NCBI. Đoạn mồi khuếch đại gen P3 của virus PRSV và gen actin của đu đủ (đối chứng nội nhằm kiểm soát chất lượng tách chiết và phản ứng).
• Tối ưu hóa phản ứng Multiplex RT-PCR: Thực hiện khảo sát gradient nhiệt độ bắt cặp ($52–62^\circ\text{C}$) và tối ưu hóa 9 tổ hợp nồng độ mồi ($0{,}1,\mu\text{M}$; $0{,}2,\mu\text{M}$; $0{,}4,\mu\text{M}$).
• Phương pháp gộp mẫu (Sample pooling): Khảo sát ngưỡng phát hiện của virus PRSV ở các tỷ lệ pha loãng RNA bệnh trong nước DEPC và trong RNA mô đu đủ khỏe (từ mức gộp 10 đến 100.000 lần) ở nồng độ chuẩn hóa $50 \pm 2\text{ ng/}\mu\text{L}$.
• Nguồn dữ liệu và vật liệu thực nghiệm: Mẫu đối chứng dương PRSV từ Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường; 30 mẫu lá đu đủ thực địa thu thập tại Đức Huệ, Long An; cơ sở dữ liệu trình tự đối chiếu mã số MT470189.1 trên NCBI.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Đặt vấn đề

Chương này tổng quan về giá trị kinh tế của cây đu đủ và tác hại nghiêm trọng của bệnh đốm vòng do PRSV gây ra đối với vùng trồng đu đủ ở Việt Nam và thế giới. Tác giả chỉ ra tính cấp thiết của việc phát triển một công cụ chẩn đoán phân tử có khả năng phát hiện nhanh, chính xác mầm bệnh ở giai đoạn sớm với chi phí thấp, từ đó xác lập mục tiêu, 3 nội dung nghiên cứu cụ thể và phạm vi thực hiện của khóa luận.

Chương 2: Tổng quan tài liệu

Chương 2 cung cấp hệ thống cơ sở lý thuyết bao gồm:

• Đặc điểm thực vật học, sinh thái học, giá trị dinh dưỡng, dược liệu và tình hình sản xuất đu đủ tại Việt Nam và trên thế giới (Ấn Độ dẫn đầu sản lượng toàn cầu với 38,61% thị phần xuất khẩu giai đoạn 2008–2010; năng suất đu đủ tại Việt Nam đạt trung bình khoảng 20 tấn/ha).
• Danh mục sâu bệnh hại chính trên cây đu đủ gồm côn trùng (rệp sáp, rệp muội, nhện đỏ, ruồi đục quả), nấm bệnh (Pythium aphanidermatum, Phyllosticta sulata, Helminthosporium rostratum, Oidium caricae), tuyến trùng (Meloidogyne incognita, Rotylenchulus reniformis) và virus (Papaya mosaic virus, Papaya ringspot virus).
• Phân loại học, cấu trúc bộ gen, đặc tính lan truyền và triệu chứng của PRSV.
• Tổng quan các phương pháp chẩn đoán PRSV: quan sát triệu chứng, cây chỉ thị, kính hiển vi điện tử, huyết thanh học (ELISA, DIBA) và sinh học phân tử (PCR, RT-PCR, Multiplex RT-PCR).
• Nguyên lý và lịch sử ứng dụng phương pháp sample pooling trong tầm soát bệnh tốn ít mẫu đơn và tiết kiệm chi phí.

Tên cặp primer	Trình tự mồi ($5' \rightarrow 3'$)	Kích thước sản phẩm	Gen mục tiêu / Nguồn
PRSV613-F PRSV613-R	TTGTGTACGACTTCTCACCGAA CGAATGTCATCCAAAGACTGATGATAAAC	613 bp	Gen P3 của PRSV (Tuo và ctv, 2014)
PRSV331-F PRSV331-R	TGTGTACGACTTCTCACCGA CTTAACGCACAACTCAGCGTAT	331 bp	Gen P3 của PRSV (Tự thiết kế)
ACT-F ACT-R	TGGTCGTACAACTGGTATTG ACAATGGATGGACCAGACTC	675 bp	Gen actin đu đủ - Đối chứng nội (Tự thiết kế)

Chương 3: Vật liệu và phương pháp

Chương 3 trình bày chi tiết danh mục hóa chất, sinh phẩm, thiết bị phòng thí nghiệm cùng các quy trình kỹ thuật:

• Quy trình 10 bước tách chiết RNA tổng số qua cột lọc silica.
• Quy trình tổng hợp cDNA thể tích $10,\mu\text{L}$ và phản ứng PCR đơn mồi thể tích $25,\mu\text{L}$.
• Ma trận 9 tổ hợp nồng độ mồi cho phản ứng multiplex RT-PCR thể tích $12{,}5,\mu\text{L}$ (gồm $6{,}25,\mu\text{L}$ MyTaq Mix 2X, mồi, $1,\mu\text{L}$ cDNA và nước không chứa nuclease).
• Bố trí thí nghiệm sample pooling: thiết lập các mức gộp thể tích từ 10 đến $100.000,\mu\text{L}$ ($1,\mu\text{L}$ RNA bệnh kết hợp với RNA khỏe hoặc nước DEPC tương ứng).
• Sơ đồ tầm soát 30 mẫu thực địa theo thuật toán phân cấp: kiểm tra mẫu gộp tổng 30 $\rightarrow$ phân 6 nhóm gộp 5 $\rightarrow$ kiểm tra từng cá thể trong nhóm dương tính.

Nồng độ mồi PRSV ($\mu\text{M}$)	Nồng độ mồi Actin $0{,}1,\mu\text{M}$	Nồng độ mồi Actin $0{,}2,\mu\text{M}$	Nồng độ mồi Actin $0{,}4,\mu\text{M}$
$0{,}1$	$0{,}1,/,0{,}1$	$0{,}1,/,0{,}2$	$0{,}1,/,0{,}4$
$0{,}2$	$0{,}2,/,0{,}1$	$0{,}2,/,0{,}2$	$0{,}2,/,0{,}4$
$0{,}4$	$0{,}4,/,0{,}1$	$0{,}4,/,0{,}2$	$0{,}4,/,0{,}4$

Chương 4: Kết quả và thảo luận

Chương 4 phân tích toàn bộ số liệu thu được từ thực nghiệm:

• Đánh giá chất lượng RNA ly trích: mẫu dương đạt nồng độ $110{,}2\text{ ng/}\mu\text{L}$ với tỷ số $A_{260}/A_{280} = 2{,}096$, đáp ứng tiêu chuẩn tinh sạch cho phản ứng khuếch đại.
• Điện di sản phẩm RT-PCR mồi PRSV613 cho một băng duy nhất kích thước 613 bp. Kết quả giải trình tự và gióng hàng BLAST đạt độ tương đồng 95,4% với trình tự PRSV mã số MT470189.1 trên NCBI (công bố bởi Tran và Yeh, 2020).
• Tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp: Khảo sát dải nhiệt độ $52–62^\circ\text{C}$ xác định được nhiệt độ ủ tối ưu là $56^\circ\text{C}$. Ở nhiệt độ này, cả hai phân đoạn gen 331 bp (PRSV) và 675 bp (actin) khuếch đại đồng đều và không xuất hiện băng phụ.
• Tối ưu hóa nồng độ mồi: Nồng độ tối ưu cho phản ứng multiplex RT-PCR là $0{,}2,\mu\text{M}$ mồi PRSV331-F/R và $0{,}2,\mu\text{M}$ mồi ACT-F/R.
• Đánh giá giới hạn phát hiện của phương pháp sample pooling: Khi pha loãng trong nước DEPC, sản phẩm khuếch đại xuất hiện ở mức pha loãng lên đến 10.000 lần. Khi pha loãng trong RNA đu đủ khỏe (nồng độ đo lại dao động từ $49{,}3$ đến $51{,}4\text{ ng/}\mu\text{L}$), ngưỡng phát hiện đạt mức gộp $1/1.000$ (1 mẫu bệnh trong 999 mẫu khỏe). Mức pha loãng $1/10.000$ và $1/100.000$ không cho tín hiệu khuếch đại do sự ức chế và cạnh tranh từ lượng lớn RNA nền khỏe mạnh.
• Kết quả kiểm tra 30 mẫu thực địa tại Long An: Mẫu gộp 30 cho kết quả dương tính $\rightarrow$ kiểm tra 6 nhóm gộp 5 phát hiện nhóm 2 (mẫu 6–10) và nhóm 6 (mẫu 26–30) dương tính $\rightarrow$ kiểm tra từng mẫu riêng lẻ xác định chính xác mẫu số 9 và mẫu số 27 dương tính với PRSV.

Mức gộp mẫu ($\mu\text{L}$)	Thể tích RNA bệnh ($\mu\text{L}$)	Thể tích RNA khỏe ($\mu\text{L}$)	Nồng độ RNA đo lại ($\text{ng/}\mu\text{L}$)	Kết quả khuếch đại Multiplex RT-PCR
10	1	9	51,1	Dương tính (Băng sáng rõ)
20	1	19	50,3	Dương tính (Băng sáng rõ)
30	1	29	51,0	Dương tính (Băng sáng rõ)
40	1	39	50,3	Dương tính (Băng sáng rõ)
50	1	49	49,3	Dương tính (Băng sáng rõ)
100	1	99	51,2	Dương tính (Băng sáng rõ)
150	1	149	50,3	Dương tính (Băng sáng rõ)
200	1	199	50,1	Dương tính (Băng sáng rõ)
250	1	249	49,3	Dương tính (Băng sáng rõ)
300	1	299	51,4	Dương tính (Băng sáng rõ)
1.000	1	999	50,6	Dương tính (Băng mờ)
10.000	1	9.999	49,3	Âm tính (Không xuất hiện băng)
100.000	1	99.999	49,8	Âm tính (Không xuất hiện băng)

Chương 5: Kết luận và đề nghị

Chương cuối tóm tắt toàn bộ các thông số kỹ thuật đã tối ưu hóa, khẳng định tính khả thi của quy trình gộp mẫu $1/1.000$ kết hợp multiplex RT-PCR, đồng thời đề xuất mở rộng thử nghiệm trên quy mô mẫu thực địa lớn hơn.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả định lượng chính

• Thiết lập thành công phản ứng Multiplex RT-PCR phát hiện đồng thời 2 đoạn gen: đoạn gen P3 của PRSV (kích thước 331 bp) và đoạn gen actin nội chứng của cây đu đủ (kích thước 675 bp).
• Xác định chu trình nhiệt tối ưu: 1 chu kỳ $94^\circ\text{C}$ trong 4 phút; 35 chu kỳ gồm biến tính $94^\circ\text{C}$ (40 giây), bắt cặp $56^\circ\text{C}$ (30 giây), kéo dài $72^\circ\text{C}$ (1 phút); kết thúc bằng 1 chu kỳ kéo dài $72^\circ\text{C}$ trong 5 phút.
• Xác định nồng độ mồi tối ưu: $0{,}2,\mu\text{M}$ đối với cặp mồi PRSV331-F/R và $0{,}2,\mu\text{M}$ đối với cặp mồi ACT-F/R.
• Xác định ngưỡng phát hiện gộp mẫu: Phát hiện được 1 mẫu đu đủ nhiễm PRSV trong 999 mẫu đu đủ khỏe (tỷ lệ gộp $1/1.000$) ở nồng độ RNA chuẩn hóa $50 \pm 2\text{ ng/}\mu\text{L}$.
• Ứng dụng thực địa: Tầm soát thành công 30 mẫu lá đu đủ tại Bình Hòa Nam, Đức Huệ, Long An, phát hiện chính xác 2 mẫu dương tính (mẫu 9 và mẫu 27). Quy trình gộp mẫu chỉ cần thực hiện 17 phản ứng PCR, tiết kiệm 43,3% số phản ứng so với phương pháp RT-PCR từng mẫu đơn lẻ (30 phản ứng) mà vẫn cho kết quả định tính hoàn toàn tương đương.

Đóng góp kỹ thuật của tác giả

• Tích hợp thành công đối chứng nội gen actin đu đủ vào phản ứng multiplex RT-PCR, giúp kiểm soát chất lượng mẫu tách chiết và loại bỏ hoàn toàn các trường hợp âm tính giả do lỗi kỹ thuật.
• Chuẩn hóa quy trình sample pooling 5 bước (Ly trích RNA $\rightarrow$ Chuẩn hóa nồng độ $50 \pm 2\text{ ng/}\mu\text{L} \rightarrow$ Gộp mẫu tỷ lệ $\le 1/1.000 \rightarrow$ Tổng hợp cDNA $\rightarrow$ Multiplex RT-PCR và điện di), cung cấp giải pháp sàng lọc diện rộng tiết kiệm thời gian, hóa chất và nhân lực phục vụ công tác kiểm dịch thực vật.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế

• Dung lượng mẫu khảo nghiệm thực địa còn khiêm tốn (30 mẫu thu thập tại một địa điểm duy nhất ở huyện Đức Huệ, tỉnh Long An).
• Phản ứng multiplex RT-PCR ở mức gộp cao ($1/1.000$) cho băng điện di tương đối mờ do ảnh hưởng ức chế cạnh tranh từ RNA nền của cây khỏe.

Hướng nghiên cứu tiếp

• Thử nghiệm và mở rộng quy trình sample pooling trên các tập mẫu thực địa lớn hơn tại nhiều vùng trồng đu đủ trọng điểm khác nhau.
• Đưa quy trình vào ứng dụng thực tế trong công tác kiểm soát giống và kiểm dịch thực vật để đánh giá độ ổn định và độ nhạy lâm sàng.

---

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo chuyên khảo hữu ích cho:

• Sinh viên và học viên cao học ngành Công nghệ sinh học, Bảo vệ thực vật, Nông học: Tham khảo quy trình thiết kế mồi, kỹ thuật ly trích RNA thực vật bằng cột silica, phương pháp tối ưu hóa multiplex RT-PCR và phương pháp luận thiết lập mô hình sample pooling.
• Cán bộ kỹ thuật phòng xét nghiệm phân tử và trạm bảo vệ thực vật: Ứng dụng trực tiếp bộ thông số chu trình nhiệt, nồng độ mồi và quy trình sàng lọc phân cấp mẫu gộp để phát hiện sớm PRSV, giúp giảm thiểu đáng kể chi phí xét nghiệm trong các chương trình giám sát dịch tễ trên diện rộng.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Phân đoạn gen nào của PRSV và cây đu đủ được lựa chọn để khuếch đại trong phản ứng multiplex RT-PCR?

Phản ứng multiplex RT-PCR khuếch đại đồng thời 2 phân đoạn: phân đoạn gen P3 của virus PRSV có kích thước 331 bp (sử dụng cặp mồi PRSV331-F/PRSV331-R) và phân đoạn gen actin của bộ gen đu đủ có kích thước 675 bp (sử dụng cặp mồi ACT-F/ACT-R làm đối chứng nội).

2. Điều kiện tối ưu cho phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện PRSV được xác định như thế nào?

Điều kiện tối ưu gồm nhiệt độ bắt cặp là $56^\circ\text{C}$, nồng độ mỗi cặp mồi (PRSV331 và Actin) là $0{,}2,\mu\text{M}$. Chu trình luân nhiệt gồm 1 chu kỳ $94^\circ\text{C}$ (4 phút); 35 chu kỳ: $94^\circ\text{C}$ (40 giây) – $56^\circ\text{C}$ (30 giây) – $72^\circ\text{C}$ (1 phút); và 1 chu kỳ kéo dài $72^\circ\text{C}$ (5 phút).

3. Ngưỡng phát hiện tối đa của phương pháp sample pooling khi gộp RNA bệnh vào RNA khỏe là bao nhiêu?

Khi RNA mẫu bệnh được pha loãng trong RNA mẫu khỏe ở nồng độ chuẩn hóa $50 \pm 2\text{ ng/}\mu\text{L}$, ngưỡng phát hiện tối đa đạt mức gộp $1/1.000$ (tương ứng 1 mẫu đu đủ bệnh trong 999 mẫu đu đủ khỏe). Ở các mức pha loãng cao hơn ($1/10.000$ và $1/100.000$), phản ứng không phát hiện được virus.

4. Hiệu quả phát hiện virus PRSV trên 30 mẫu thực địa bằng phương pháp sample pooling thể hiện ra sao?

Quy trình gộp mẫu qua 3 bước phân cấp đã phát hiện chính xác 2 mẫu dương tính (mẫu 9 và mẫu 27) trong tổng số 30 mẫu thực địa thu thập tại Đức Huệ, Long An. Kết quả này trùng khớp 100% với phương pháp RT-PCR từng mẫu đơn lẻ nhưng chỉ tiêu tốn 17 phản ứng thay vì 30 phản ứng.

5. Phân đoạn gen PRSV khuếch đại ban đầu đạt độ tương đồng bao nhiêu phần trăm khi tra cứu trên NCBI?

Sản phẩm khuếch đại 613 bp từ cặp mồi PRSV613-F/R sau khi giải trình tự đã cho độ tương đồng 95,4% với trình tự gen PRSV mang mã số MT470189.1 đã được công bố trên Ngân hàng Gen NCBI bởi Tran và Yeh (2020).

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp đã xây dựng thành công quy trình kỹ thuật phát hiện Papaya ringspot virus (PRSV) gây bệnh đốm vòng trên cây đu đủ bằng phương pháp sample pooling kết hợp multiplex RT-PCR có tích hợp gen đối chứng nội actin. Nghiên cứu đã xác lập các thông số tối ưu gồm nhiệt độ ủ $56^\circ\text{C}$, nồng độ mồi $0{,}2,\mu\text{M}$ và đạt ngưỡng phát hiện mẫu gộp ở tỷ lệ $1/1.000$. Thử nghiệm trên 30 mẫu lá đu đủ thực địa tại Long An khẳng định quy trình có độ chính xác tương đương phương pháp RT-PCR đơn lẻ nhưng giúp giảm 43,3% số phản ứng xét nghiệm. Đây là cơ sở thực nghiệm tin cậy để triển khai các chương trình chẩn đoán, sàng lọc diện rộng phục vụ quản lý và phòng trừ bệnh đốm vòng hại đu đủ.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Du đủ (Carica papaya Caricaceae) là một loại cây nhiệt đới phổ biến có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới Châu Mỹ, là loài duy nhất trong Chi đu đủ (Carica), thuộc Họ đu đủ (Caricaceae hay Papayaceae). Trong quả du đủ chín có hàm lượng dinh dưỡng cao, theo phân tích thành phần hoá học, trong 100g thịt trái chín có chứa 86,6 % nước, 12,1 % tinh bột, 0,6 % protein, 0,3 % lipit, năng lượng là 50 calo, 0,7 % xơ, 0,5 % tro và khá nhiều khoáng như: Kali (204 mg), Ca (34 mg), P (11 mg). Đặc biệt, đu đủ cung cấp lượng vitamin rất phong phú: vitamin A (450 mg), C (74 mg), B1 (0,03 mg), P (0,5 mg), B2 (0,04mg) (Trần Thế Tục, 1998). Day là loại qua đặc sản của vùng nhiệt đới, có giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế cao.

Ở Việt Nam, đu đủ được trồng rộng rãi trên phạm vi cả nước, trồng nhiều nhất ở các vùng trung du đặc biệt là các tỉnh miền Đông Nam Bộ. Với các giống đu đủ được trồng phô biến là: đu đủ ta, đu đủ Mehico, đu đủ Trung Quốc, du đủ Solo, du đủ Thai Lan, đu đủ Đài Loan,. Tuy nhiên việc sản xuất đang bị hạn chế bởi bệnh do Papaya ringspot virus (PRSV) (Gonsalves, 1998). Day là virus gây thiệt hại hang đầu đối với canh tác đu đủ.

Do tính chất gây bệnh đặc trưng của virus là lây lan rất nhanh và không thê kiểm soát bang hóa chất hay bat kì phương thức nao ma chỉ có thé khắc phục bằng cách phòng trừ và sử dụng giống kháng bệnh nên thiệt hại của bệnh rất nghiêm trọng. Thêm vào đó, bệnh lại rất khó nhận biết ở giai đoạn sớm, đến khi ta quan sát được triệu chứng một cách rõ ràng thì đã quá muộn và thường không chính xác, gây nên nhiều thiệt hại nặng nề. Thiệt hai đáng kế do PRSV đối với việc canh tác đu đủ đã làm nảy sinh nhu cầu làm sao dé sớm phát hiện và loại bỏ cây bị nhiễm bệnh. Vì vậy, đề tài “Xay dựng quy trình phát hiện Papaya ringspot virus gây bệnh đốm vòng trên đu đủ bằng phương pháp sample pooling kết hợp kỹ thuật multiplex RT — PCR” được thực hiện nhằm giúp phát hiện sớm mầm bệnh và ngăn chặn kịp thời, giúp giảm bớt thiệt hại do virus PRSV gây ra.

Mục đích nghiên cứu Xây dựng quy trình phát hiện — chan đoán bệnh PRSV (Papaya ringspot virus) bằng phương pháp sample polling kết hợp kỹ thuật multiplex RT — PCR nhằm chan đoán chính xác và hiệu quả nguồn bệnh trong quá trình phòng trừ bệnh hại do virus gây ra. Nội dung thực hiện Nội dụng 1: Xây dựng quy trình phát hiện virus PRSV bằng kỹ thuật multilex RT —PCR Nội dung 2: Xây dựng quy trình sample pooling phát hiện virus PRSV gây bệnh trên cây đu đủ Nội dung 3: Ứng dụng quy trình phát hiện PRSV bằng kỹ thuật sample pooling trên các mẫu thu thập từ thực địa. TONG QUAN TÀI LIEU 2. Sơ lược về cây đu đủ 2.

Nguồn gốc và phân loại khoa học 2. Phần loại khoa học Du đủ có tên khoa học là Carica papaya là một cây thuộc ho Du đủ. Papaya Ở một số nơi trên thé giới, đặc biệt là ở Australia và một vai đảo ở phía đông An Độ, cây đu đủ được biết đến với tên gọi là papaw hay pawpaw. Bên cạnh tên papaya rất phô biến thì ở Nam A va Đông Ấn Độ nó còn có các tên gọi bị sai lệch đi như kapaya, kepaya.

lapaya hay tapaya. Ở Pháp, trái du đủ được gọi là papaye, còn cây đu đủ là papayer, đôi khi được gọi theo tên nội dia là figuier des Iles. Theo tiếng Tây Ban Nha, trái đu đủ được gọi là mélon zapote, lechosa, papaya; còn cây du đủ có tên là papayo hay papayero, fruta bomba, mamón hay mamona tùy thuộc vào từng nước. Ở Brazil, tên thông dụng của nó là mamao.

Ở Châu Âu, khi được phát hiện lần đầu tiên nó được đặt cho tên địa phương là “free melon” (James, 1983). Nguồn gốc Chi Du đủ (Carica) có một loài đuy nhất là Du đủ (Carica papayai) thuộc Họ du đủ (Caricaceae hay Papayaceae). Loài này có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới của Châu Mỹ, từ vùng đất thấp ở miền nam Mexico, miền đông Trung Mỹ, và bắc Nam Mỹ. Nó đã được người Tây Ban Nha đưa tới Philippines vào khoảng năm 1550.

Từ đây nó được đưa vào khu vực nhiệt đới châu Á, châu Phi. Ngày nay, du đủ được trồng lù phần lớn các nước nhiệt đới như Brasil, An D6, Sri Lanka, Philippines, Việt Nam. Đặc điểm thực vật học của cây Du đủ Rễ: Là loại rễ chùm, có các nhánh rễ đâm ngang tương đương với độ rộng của tán lá, rễ cây đu đủ ăn nông tập trung 6 tang dat từ 0 -30em. Cây du đủ có bộ rễ nhỏ, giòn, mềm không chịu được ngập tng hoặc khô hạn khi gặp thời tiết bat lợi.

Thân: Thân cây đu đủ là dạng thân mềm, bán mộc, cây có màu xám xanh hoặc nâu xám, thân không phân nhánh khi đang trong giai đoạn sinh trưởng phát triển. Cây đu đủ có thân rỗng, có các mô yếu, thân hóa gỗ kém. Trong điều kiện sinh trưởng, phát triển tốt cây có chiều cao trung bình từ 3 —7 m, mang một chùm lá trên phía ngọn. Lá: Lá du đủ mọc cách, so le, không có lá kèm.

Cuống dai 60 — 70 cm, rong. Gan lá hình chân vịt. Trong các tháng có nhiệt độ cao, dinh dưỡng nước day đủ, du đủ có thé ra 9— ]] lá. Hoa: Hoa màu trắng phớt vàng nhạt, mọc thành chùm xim ở nách những lá già.

Hoa đơn tính thường khác gốc, nhưng cũng có cây vừa mang cả hoa đực; hoa cái và hoa lưỡng tính, hoặc có hoa cái và hoa lưỡng tính. Cụm hoa đực phân nhánh nhiều, có cuống, rất dai. Cụm hoa cái chỉ gồm 2 — 3 hoa. Quả: Quả mọng to, thịt quả đày, trong ruột quả có nhiều hạt đen.

Dạng quả đu đủ thường tùy vào loại hoa đã thụ phan là hình trứng hay hình cầu do hoa cái phát triển, hình thon dài do hoa lưỡng tính tạo thành. Hạt: Thon gần tròn, mọc trong phần rồng của ruột quả. Hạt già có màu xám hoặc đen và thường chìm trong nước. Bên ngoài hạt có lớp vỏ lụa mỏng, cản thắm nước nên cần chà bóc vỏ trước khi gieo.

Các yếu tố ảnh hưởng đến cây Du đủ 313,1. Bat Du đủ có thể trồng trên nhiều loại đất khác nhau, tuy nhiên đất trồng đó phải thoáng, tiêu và thoát nước tốt, tầng canh tác dày và đủ chất dinh dưỡng, đặc biệt là lân và kali. Đất có tầng dày 7 cm, hàm lượng khí trong đất khoảng 4%, độ pH đạt khoảng 6,5 —7 được coi là thích hợp dé trồng du đủ 2. Nước Du đủ là cây có yêu cầu cao về nước đo có diện tích lá lớn song rất dé bị ing.

Do cau trúc của lá và lớp bảo vệ trên bộ mặt lá, đu đủ chịu hạn rất kém. Lượng nước du đủ cần khoảng 1. Khi đủ nước và cấp nước kịp thời cây sẽ sinh trưởng liên tục và cho năng suất cao. Cây cần nhiều nước trong giai đoạn vươn cao, giai đoạn hoa và giai đoạn nhanh lớn của quả.

Mùa đông hoặc thời tiết lạnh, cây cần ít nước. Nhiệt độ Do có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới nên đu đủ cần nhiệt độ cao dé sinh trưởng va phát triển, đây là yêu tố hạn chế sự phân bồ và phát triển của đu đủ. Nhiệt độ thích hợp nhất cho cây sinh trưởng và phát triển là 25 — 30°C. Khi nhiệt độ trên 44°C và cường độ chiếu sáng mạnh, cây sẽ bị mat nước và héo.

Nhiệt độ thấp hơn 15°C, làm giảm sự ra lá, quả phát triển chậm và chất lượng quả kém. Nếu nhiệt độ quá lạnh hoặc có sương muối, bộ lá của cây bị tốn hại, các bó mạch bị vỡ làm chảy nhựa và dan đến chết nếu lạnh quá dài. Nhiệt độ —2°C là nhiệt độ gây chết đối với cây. Gió và bão Do bộ rễ ăn nông và là thân thảo nên đu đủ chịu gió, bão rất kém nhất là thời kì cây đang mang quả.

Gió mạnh làm lá cây bị rách ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của cây và quả, gió to là đồ cây, gây xây xát thân, làm chảy nhựa tạo điều kiện cho nắm bệnh phát triển. Giá trị của cay Du đủ 2. Giá trị dinh dưỡng Du đủ chín chứa tới 90% nước, 13% đường, không có tinh bột, có nhiều carotenoit acid hữu cơ, vitamin: A, B, C, 0,9% chất béo, xenluloz (0,5%), canxi, photpho, magié, sat, thiamin, riboflavin. Trong 100g du du xanh có 74 —80 mg vitamin C va 500 —1.

Du đủ còn có các vitamin BI, B2, các acid gây men va khoáng chất như kali, canxi, magié, sat va kém. Ngoài các dưỡng chat nói ở trên thì đu đủ xanh còn được các nhà khoa học phát hiện nó có chứa khoảng 4% chất nhựa latex nhựa có thể tìm thấy ở quả đu đủ xanh, lá và thân cây. Trong latex có chứa chất men tiêu hóa chất đạm (proteaza) va papain. Những chất có tác dung rất tốt cho sức khỏe con người.

Ước tính 1 năm có thé thu hoạch được 100 g nhựa từ đu đủ. Cùng với đó là các chất chymopapain va papaya protenaza có trong qua du đủ xanh. Papain giống như papain chứa trong da day và trysin trong tuyến tụy đều có tác dụng tiêu hóa trong các bộ phận này. Bên cạnh đó papain còn có tác dụng ức chế vi khuẩn, hạn chế Staphillococ va vi trùng thương hàn.

Ngoai ra, Papain còn có tác dụng làm đông sữa và giảm độc đôi với toxin và toxanpunin. La du đủ chứa hàm lượng ancaloit carpain, có tac dụng như glucozit trong dương địa hoàng (digitalis) có tác dụng làm chậm nhịp tim và làm liệt amit. Hat du đủ chứa 2 chất glucozit caricin va myrosin. Hàm lượng dinh dưỡng có trong các thành phần của cây đu đủ được công bố từ Trung Mỹ và Cuba (James, 1983) Bang 2.

Giá trị dinh dưỡng có trong 100 g bộ phận có thé ăn được của cây đu đủ Thành phần Trái Lá Calories 23,11 —25,8 Lượng nước 85,9—92,6g 83,3 % Protein 0,081 — 0,34 g 5,6% Chất béo 0,05 — 0,96 g 0,4 % Carbohydrates 6,17—6,75g 8,3% Chất xơ 0,5— 1,3 g 1,0% Chất tro 0,31 — 0,66 g 1,4% Calcium 12,9 — 40,8 mg 0,406 % (CO) Phosphorus 5,3 — 22,0 mg Sat 0,25 — 0,78 mg 0,00636 % Carotene 0,0045 — 0,676 mg 28,900 LŨ. Thiamine 0,021 — 0,036 mg Riboflavin 0,024 — 0,058 mg Niacin 0,227 — 0,555 mg Ascorbic Acid 35,5 —71,3 mg 38.6% Tryptophan 4-5 mg Methionine 1 mg Lysine 15-16 mg Magnesium 0,035 % Phosphoric Acid 0,225 % 2. Giá trị thực phẩm Du đủ phổ biến nhất là được sử dụng dưới dạng tươi sống.