ĐẶT VẤN ĐỀ Diquat (viết tắt là DQ) là một loại thuốc diệt cỏ tiếp xúc không chọn lọc được tạo ra lần đầu tại nước Anh vào năm 1955 và được sản xuất thương mại lần đầu vào năm 1958. Do cùng thuộc nhóm bipyridinium, Diquat mang nhiều đặc điểm tương đồng với Paraquat: tác dụng diệt cỏ nhanh và an toàn với môi trường nhưng đồng thời cũng mang độc tính cao khi xâm nhập vào cơ thể người [22, 39]. Biểu hiện lâm sàng của ngộ độc cấp Diquat rất đa dạng và phức tạp, phụ thuộc vào nồng độ, số lượng dung dịch và đường tiếp xúc, tổn thương trên đa cơ quan, trường hợp nặng có thể tử vong nhanh chóng do suy đa tạng. Theo nghiên cứu của Giselle tỷ lệ tử vong do ngộ độc cấp Diquat là 43% [17].
Mặc dù đặc điểm lâm sàng nặng nề và phức tạp, nhưng các nghiên cứu về tính chất dược động học và độc tính của Diquat còn rất hạn chế. Nguyên nhân là do Diquat ít được sử dụng phổ biến so với thuốc trừ cỏ cùng nhóm bipyridinium là Paraquat, số lượng sản phẩm thương mại chứa Diquat rất ít hoặc thường được sản suất như là thành phần phối hợp với Paraquat, dẫn đến số lượng các vụ ngộ độc Diquat cũng ít hơn đáng kể so với ngộ độc Paraquat. Vì thế nên các nghiên cứu trên thế giới từ trước đến nay đều tập trung vào Paraquat, các nghiên cứu về Diquat đều chỉ được thực nghiệm trên động vật hoặc các bài báo cáo lâm sàng. Tại Việt Nam số nghiên cứu về Diquat đã được công bố còn giới hạn.
Việc điều trị cũng gặp nhiều khó khăn do chưa có một phác đồ điều trị cụ thể nào được đưa ra, các biện pháp điều trị chưa được nghiên cứu đầy đủ. Thời gian gần đây, khi Paraquat dần bị các nước trên thế giới cấm sử dụng, Việt Nam cũng đã chính thức cấm lưu hành và sử dụng Paraquat từ tháng 2/2017. Vì thế Diquat, được biết là một loại thuốc diệt cỏ có tác dụng và tính an toàn tương tự Paraquat được sử dụng thay thế Paraquat. Do được sử dụng phổ biến dần, các vụ ngộ độc cấp Diquat bắt đầu xuất hiện với số lượng bệnh nhân ngày càng nhiều, nhiều vụ ngộ độc nghiêm trọng đã xảy ra khiến nhiều bệnh nhân tử vong.
Tại Trung 1 tâm chống độc Bệnh Viện Bạch Mai, trong quý 2 năm 2021 đã ghi nhận 15 bệnh nhân ngộ độc Diquat nhập viện, trong đó 8 53%) bệnh nhân đã tử vong. Trong chẩn đoán và điều trị ngộ độc cấp DQ, xét nghiệm định lượng DQ trong huyết tương đóng vai trò đặc biệt quan trọng, giúp xác định mức độ nặng của ngộ độc, tiên lượng bệnh nhân cũng như đánh giá hiệu quả của các biện pháp điều trị, đặc biệt là lọc máu hấp phụ. Lọc máu hấp phụ là kỹ thuật sử dụng cột than hoạt tính hoặc cột resin nhằm tăng cường đào thải DQ trong máu bệnh nhân ngộ độc. Xét nghiệm định lượng nồng độ DQ huyết tương cung cấp công cụ quan trọng để đánh giá hiệu quả của các biện pháp điều trị tăng thải trừ này.
Tuy nhiên, cho đến nay tại Việt Nam việc xét nghiệm DQ chỉ dừng ở mức độ định tính trong nước tiểu bằng phương pháp so màu để xác định bệnh nhân ngộ độc DQ mà chưa có cơ sở xét nghiệm nào có thể thực hiện việc định lượng nồng độ DQ máu với kết quả đáng tin cậy. Điều này dẫn đến một khoảng trống lớn trong chẩn đoán, tiên lượng cũng như đánh giá hiệu quả của các biện pháp lọc máu làm cho việc điều trị ngộ độc DQ tại Trung tâm Chống độc và các khoa hồi sức cấp cứu trên cả nước gặp rất nhiều khó khăn. Để định lượng DQ trong huyết tương trên thế giới đã áp dụng các phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS), điện di mao quản (CE), sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS). Tại Trung tâm chống độc bệnh viện Bạch Mai hiện đang sử dụng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao để xét nghiệm độc chất nhưng cũng chưa có quy trình chuẩn định lượng DQ huyết tương.
Vì vậy, chúng tôi chọn đề tài nghiên cứu “Xác định thuốc diệt cỏ Diquat trong mẫu huyết tương người bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao”. 2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Tổng quan về diquat 1. Công thức diquat Diquat (DQ) có tên khoa học là 1,1'-Ethylene-2,2'-bipyridylium là thuốc diệt cỏ không chọn lọc, thuộc lớp bipyridunium, được tạo ra lần đầu ở nước Anh vào năm 1955 và sản xuất thương mại lần đầu vào năm 1958.
Trong thương mại, DQ phổ biến dưới dạng dung dịch DQ dibromide 20%. DQ có khối lượng phân tử tương đối 184,24 g/mol và có công thức hóa học như hình 1. 1: Công thức cấu tạo của Diquat 1. Tính chất lý, hóa học của diquat DQ thường có màu vàng nhạt, không mùi, tỷ trọng ở 200C là 1,220-1,270, bị phân hủy trước khi đun sôi hoặc nóng chảy và pH của dung dịch DQ trong nước 6,0 - 7,0.
DQ thường ở dạng dibromide hoặc dichloride. Dạng dibromide bột tinh thể có màu vàng nhạt, không mùi, hút ẩm mạnh tan dễ dàng trong nước (700 g/L nước), tan ít trong cồn (25 g/L) và hầu như không tan trong các dung môi hữu cơ không 3 phân cực (<0. Ở dạng dung dịch 20%, Diquat dibromide là chất lỏng màu nâu đen và mùi đất, pH từ 6,0 - 7,0. Dung dịch diquat rất ổn định trong điều kiện tự nhiên và môi trường axit, nhưng bị thủy phân trong môi trường kiềm pH trên 9,0 do sự hấp thụ anion OH- làm phá vỡ vòng pyridine.
Trong môi trường tự nhiên, DQ mang bản chất cation nên gắn mạnh với các chất khoáng sét và có trong đất, hình thành liên kết ion và mất tác dụng; nhanh chóng phân hủy dưới tia UV trong ánh sáng mặt trời nên được coi là loại thuốc trừ cỏ an toàn với môi trường. DQ được sản xuất bởi nhiều công ty khác nhau với các tên thương mại và hàm lượng khác nhau, nói chung thường ở dạng dung dịch màu xanh. Một số tên gọi thường gặp của DQ như: Aquacide, Aquakill, Reglone, Reglox, Vegetrole, Torpedo, Weedtrine-D,… 1. Cơ chế gây độc của diquat DQ đang dần bị cấm như một loại hóa chất bảo vệ thực vật vì độc tính gây tử vong của nó.
(EU cấm vào năm 2018, Anh cấm vào năm 2019,…) Tuy nhiên, tại Việt Nam, DQ vẫn được phép sử dụng và vì PQ đã bị cấm vào năm 2017 nên DQ trở thành một loại thuốc diệt cỏ được sử dụng phổ biến thay thế PQ. Cơ chế gây độc của DQ được mô tả theo sơ đồ (Hình 1. Dưới sự có mặt của sắt, anion superoxid O2● tự do phản ứng với hydro peroxid H2O2 để tạo ra gốc tự do hydroxyl OH●. Gốc tự do OH● có thể tấn công các chuỗi lipid trên màng tế bào sinh học, khởi động quá trình oxy hóa lipid dẫn đến tổn thương màng tế bào và gây chết tế bào.
ROS có thể gây tổn thương nguyên tử hydrogens nhóm allylic của phân tử acid béo không bão hòa có mặt trong màng tế bào, tạo ra gốc lipid tự do peroxyl, sau đó tiếp tục cắt bỏ nguyên tử hydro gốc ally khỏi phân tử acid béo liền kề để tạo ra lipid hydroperoxide LOOH, dẫn tới sự oxy hóa acid béo (LPO). Hiện tượng này 4 làm giảm tính lỏng, tăng tính bền của màng tế bào, dễ dàng hơn cho phospholipid tráo đổi giữa 2 lớp phospholipid, phá vỡ giới hạn cho vật chất di chuyển qua màng tế bào, dẫn tới màng tế bào bị xé rách và hệ quả là hoại tử mô tế bào. LPO có thể vô hiệu hóa các recepter hoặc enzym gắn màng tế bào, và gián đoạn hoạt động chức năng của chúng. Các sản phẩm của quá trình LPO có thể gây đột biến và thay đổi biểu hiện gene thông qua biến đổi ADN.
Các nghiên cứu trên động vật đã cho thấy độc tính DQ trên gan, chắc chắn có một phần, gây ra bởi phản ứng thủy thân lipid bởi gốc oxy tự do, đồng thời cho thấy các chất có hoạt tính chống oxy hóa mạnh và các chất thu nhặt gốc tự do như melatonin là có tác dụng bảo vệ. Tổn thương gan và phản ứng oxy hóa khử chất béo gây ra bởi DQ đã được giảm đáng kể trên các con chuột chuyển gen có mức độ hoạt động cao enzym glutathion peroxidase. Bên cạnh ROS, tác dụng gây stress oxi hóa bởi DQ còn được chứng minh bởi các gốc nito tự do, có thể kể đến tác dụng giảm NO trên chuột lang và sinh ra peroxynitrite (ONOO-) trong tế bào gan từ phản ứng O2●- với NO●. N-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME), một chất đối kháng cạnh tranh không đặc hiệu với nitrogen oxide synthetase, đã được tìm ra có thế giới hạn sự phát triển của các gốc nitơ tự do trong tế bào thần kinh bằng cách giảm tổng hợp NO●.
Dưới sự có mặt của sắt, anion superoxid O2● tự do phản ứng với hydro peroxid H2O2 để tạo ra gốc tự do hydroxyl OH●. Gốc tự do OH● có thể tấn công các chuỗi lipid trên màng tế bào sinh học, khởi động quá trình oxy hóa lipid dẫn đến tổn thương màng tế bào và gây chết tế bào. ROS có thể gây tổn thương nguyên tử hydrogens nhóm allylic của phân tử acid béo không bão hòa có mặt trong màng tế bào, tạo ra gốc lipid tự do peroxyl, sau đó tiếp tục cắt bỏ nguyên tử hydro gốc ally khỏi phân tử acid béo liền kề để tạo ra lipid hydroperoxide LOOH, dẫn tới sự oxy hóa acid béo (LPO). Hiện tượng này làm giảm tính lỏng, tăng tính bền của màng tế bào, dễ dàng hơn cho phospholipid tráo đổi giữa 2 lớp phospholipid, phá vỡ giới hạn cho vật chất di chuyển qua màng tế bào, dẫn tới màng tế bào bị xé rách và hệ quả là hoại tử mô tế bào.
LPO có thể vô 5 hiệu hóa các recepter hoặc enzym gắn màng tế bào, và gián đoạn hoạt động chức năng của chúng. 2: Cơ chế ngộ độc Diquat Các sản phẩm của quá trình LPO có thể gây đột biến và thay đổi biểu hiện gene thông qua biến đổi ADN. Các nghiên cứu trên động vật đã cho thấy độc tính DQ trên gan, chắc chắn có một phần, gây ra bởi phản ứng thủy thân lipid bởi gốc 6 oxy tự do, đồng thời cho thấy các chất có hoạt tính chống oxy hóa mạnh và các chất thu nhặt gốc tự do như melatonin là có tác dụng bảo vệ. Tổn thương gan và phản ứng oxy hóa khử chất béo gây ra bởi DQ đã được giảm đáng kể trên các con chuột chuyển gen có mức độ hoạt động cao enzym glutathion peroxidase.