Quy trình xác định Diquat trong huyết tương bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao

Tài liệu trình bày quy trình xác định thuốc diệt cỏ Diquat trong huyết tương bằng phương pháp HPLC, tối ưu hóa các điều kiện phân tích và xử lý mẫu.

• Tác giả: Luu Thu Huyen
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyen Thi Kim Thuong
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Hóa phân tích
• Đề tài: Xác Định Thuốc Diệt Cỏ Diquat Trong Mẫu Huyết Tương Người Bằng Phương Pháp Sắc Ký Lỏng Hiệu Năng Cao
• Loại tài liệu: Luận văn Thạc sĩ Khoa học
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng Quan về Diquat và Tầm Quan Trọng của Phương Pháp HPLC

Diquat là một loại thuốc diệt cỏ được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp, nhưng có khả năng gây độc tính cao nếu tiếp xúc hoặc ngộ độc. Việc xác định diquat trong huyết tương có ý nghĩa lâm sàng quan trọng để chẩn đoán, theo dõi và đánh giá tiên lượng bệnh nhân ngộ độc. Phương pháp HPLC (High Performance Liquid Chromatography - Sắc kí lỏng hiệu năng cao) là một trong những kỹ thuật phân tích độc lập, có độ chính xác cao, khả năng phân biệt tốt và ít bị ảnh hưởng từ các chất cùng hành động. Phương pháp này cho phép xác định chính xác nồng độ diquat trong mẫu huyết tương, hỗ trợ đắc lực cho công tác chẩn đoán lâm sàng.

1.1. Công Thức Hóa Học và Tính Chất của Diquat

Diquat là một chất hoá học dipyridinium với công thức phân tử C₁₂H₁₂N₂²⁺. Chất này có tính chất lý hóa học đặc biệt như khả năng hòa tan tốt trong nước, tính ion hóa mạnh ở pH sinh lý. Cơ chế gây độc của diquat liên quan đến việc tạo ra các gốc tự do, gây stress oxy hóa và tổn thương các tế bào, đặc biệt là phổi, thận và gan.

1.2. Dược Động Học và Quá Trình Trao Đổi Chất

Sau khi tiếp xúc hoặc ngộ độc, diquat được hấp thụ nhanh chóng từ đường tiêu hóa. Quá trình chuyển hóa và thải trừ chủ yếu qua thận, với thời gian bán thời gian từ 12-36 giờ. Việc xác định nồng độ trong huyết tương giúp đánh giá mức độ tiếp xúc và tiên lượng bệnh tình của bệnh nhân.

II. Các Phương Pháp Phân Tích Diquat Trước Khi Sử Dụng HPLC

Trước khi phương pháp HPLC trở thành tiêu chuẩn vàng, các nhà khoa học đã ứng dụng nhiều kỹ thuật khác nhau để xác định diquat trong mẫu sinh học. Mỗi phương pháp có những ưu và nhược điểm riêng, tuy nhiên HPLC nổi bật với độ nhạy cao, độ chọn lọc tốt và khả năng định lượng chính xác. Phương pháp quang phổ sử dụng máy đo UV-Vis có độ nhạy thấp hơn. Phương pháp điện di mao quản và sắc kí khí khối phổ phức tạp và đắt tiền hơn. HPLC với detector DAD (Diode Array Detector) cung cấp thông tin phổ mà không cần các bước chuẩn bị mẫu quá phức tạp.

2.1. Phương Pháp Quang Phổ và Điện Di Mao Quản

Phương pháp quang phổ UV-Vis dựa trên khả năng hấp thụ ánh sáng của diquat, nhưng độ nhạy thấp và dễ bị các chất khác can nhiễu. Phương pháp điện di mao quản cung cấp độ phân biệt tốt nhưng yêu cầu thiết bị chuyên dụng và thời gian phân tích lâu.

2.2. Sắc Kí Khí Khối Phổ và Sắc Kí Lỏng Hiệu Năng Cao

Sắc kí khí khối phổ (GC-MS) có độ nhạy cao nhưng yêu cầu daquat phải được hóa dẫn xuất trước phân tích. Sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) vượt trội nhờ khả năng xác định diquat trực tiếp, không cần dẫn xuất, giảm thời gian và chi phí phân tích.

III. Tối Ưu Hóa Điều Kiện HPLC để Xác Định Diquat

Để đạt được kết quả phân tích diquat chính xác và đáng tin cậy, cần tối ưu hóa các điều kiện chạy HPLC. Các yếu tố quan trọng bao gồm: lựa chọn pha động, pH dung dịch, tốc độ dòng, thể tích mẫu tiêm vào, và loại detector. Sử dụng detector DAD cho phép phát hiện diquat ở bước sóng thích hợp (thường là 254 nm), đảm bảo độ nhạy tối đa. Pha động chứa natri heptansulfonate hoạt động như chất ghép cặp ion, giúp cải thiện hình dạng đỉnh chromatogram. Các nghiên cứu cho thấy khoảng nồng độ tuyến tính rộng, cho phép định lượng chính xác ở các nồng độ khác nhau.

3.1. Lựa Chọn Pha Động và Điều Kiện Buffer

Pha động nên chứa dung dịch đệm phosphate ở pH 3.0-4.0 để duy trì độ ổn định của diquat và đạt hình dạng đỉnh tốt. Bổ sung natri heptansulfonate (3-5 mM) và PEG giúp cải thiện độ phân biệt. Tốc độ dòng 1.0-1.5 mL/phút đạt cân bằng tốt giữa thời gian phân tích và độ phân biệt.

3.2. Detector DAD và Đánh Giá Đường Chuẩn

Detector DAD phát hiện diquat ở bước sóng 254 nm với giới hạn phát hiện (LOD) ~5 ng/mL và giới hạn định lượng (LOQ) ~15 ng/mL. Đường chuẩn tuyến tính trong khoảng 20-1000 ng/mL với hệ số tương quan r² > 0.999, đảm bảo độ chính xác cao của phương pháp.

IV. Xử Lý Mẫu và Ứng Dụng Lâm Sàng trong Chẩn Đoán Ngộ Độc Diquat

Xử lý mẫu huyết tương là bước quan trọng để loại bỏ các protein và chất cản trở khác, nhằm cải thiện độ chọn lọc và độ nhạy của phương pháp. Sử dụng acid trichloroacetic (TCA) ở nồng độ 10-15% là phương pháp chiết đơn giản, hiệu quả và chi phí thấp. Sau khi lắc xoáy khoảng 5 phút, mẫu được li tâm và lọc qua màng 0.22 μm. Phương pháp này đạt hiệu suất thu hồi 85-95% và độ lặp lại tốt. Trong lâm sàng, xác định diquat trong huyết tương bệnh nhân ngộ độc giúp: xác nhận chẩn đoán, đánh giá mức độ tiếp xúc, tiên lượng bệnh tình, theo dõi hiệu quả lọc máu hấp phụ và điều chỉnh phương pháp điều trị.

4.1. Quy Trình Chuẩn Bị Mẫu và Điều Kiện Lưu Trữ

Mẫu huyết tương được thu trong các ống heparin, bảo quản ở nhiệt độ -20°C. Trước phân tích, mẫu được rã đông ở nhiệt độ phòng và xử lý bằng TCA 10%. Thời gian lắc xoáy 5 phút tối ưu cho chiết diquat từ nền mẫu. Dung dịch được li tâm ở 3500 vòng/phút, 10 phút để tách chất rắn.

4.2. Ứng Dụng Lâm Sàng và Tiên Lượng Bệnh Nhân

Xác định diquat trong huyết tương giúp chẩn đoán chính xác các trường hợp ngộ độc. Bệnh nhân có nồng độ diquat cao (>1 mg/L) thường có tiên lượng xấu. Theo dõi nồng độ sau điều trị lọc máu hấp phụ đánh giá hiệu quả lọc máu và hỗ trợ điều chỉnh phương pháp điều trị phù hợp, cải thiện tỷ lệ sống sót bệnh nhân.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Diquat (viết tắt là DQ) là một loại thuốc diệt cỏ tiếp xúc không chọn lọc được tạo ra lần đầu tại nước Anh vào năm 1955 và được sản xuất thương mại lần đầu vào năm 1958. Do cùng thuộc nhóm bipyridinium, Diquat mang nhiều đặc điểm tương đồng với Paraquat: tác dụng diệt cỏ nhanh và an toàn với môi trường nhưng đồng thời cũng mang độc tính cao khi xâm nhập vào cơ thể người [22, 39]. Biểu hiện lâm sàng của ngộ độc cấp Diquat rất đa dạng và phức tạp, phụ thuộc vào nồng độ, số lượng dung dịch và đường tiếp xúc, tổn thương trên đa cơ quan, trường hợp nặng có thể tử vong nhanh chóng do suy đa tạng. Theo nghiên cứu của Giselle tỷ lệ tử vong do ngộ độc cấp Diquat là 43% [17].

Mặc dù đặc điểm lâm sàng nặng nề và phức tạp, nhưng các nghiên cứu về tính chất dược động học và độc tính của Diquat còn rất hạn chế. Nguyên nhân là do Diquat ít được sử dụng phổ biến so với thuốc trừ cỏ cùng nhóm bipyridinium là Paraquat, số lượng sản phẩm thương mại chứa Diquat rất ít hoặc thường được sản suất như là thành phần phối hợp với Paraquat, dẫn đến số lượng các vụ ngộ độc Diquat cũng ít hơn đáng kể so với ngộ độc Paraquat. Vì thế nên các nghiên cứu trên thế giới từ trước đến nay đều tập trung vào Paraquat, các nghiên cứu về Diquat đều chỉ được thực nghiệm trên động vật hoặc các bài báo cáo lâm sàng. Tại Việt Nam số nghiên cứu về Diquat đã được công bố còn giới hạn.

Việc điều trị cũng gặp nhiều khó khăn do chưa có một phác đồ điều trị cụ thể nào được đưa ra, các biện pháp điều trị chưa được nghiên cứu đầy đủ. Thời gian gần đây, khi Paraquat dần bị các nước trên thế giới cấm sử dụng, Việt Nam cũng đã chính thức cấm lưu hành và sử dụng Paraquat từ tháng 2/2017. Vì thế Diquat, được biết là một loại thuốc diệt cỏ có tác dụng và tính an toàn tương tự Paraquat được sử dụng thay thế Paraquat. Do được sử dụng phổ biến dần, các vụ ngộ độc cấp Diquat bắt đầu xuất hiện với số lượng bệnh nhân ngày càng nhiều, nhiều vụ ngộ độc nghiêm trọng đã xảy ra khiến nhiều bệnh nhân tử vong.

Tại Trung 1 tâm chống độc Bệnh Viện Bạch Mai, trong quý 2 năm 2021 đã ghi nhận 15 bệnh nhân ngộ độc Diquat nhập viện, trong đó 8 53%) bệnh nhân đã tử vong. Trong chẩn đoán và điều trị ngộ độc cấp DQ, xét nghiệm định lượng DQ trong huyết tương đóng vai trò đặc biệt quan trọng, giúp xác định mức độ nặng của ngộ độc, tiên lượng bệnh nhân cũng như đánh giá hiệu quả của các biện pháp điều trị, đặc biệt là lọc máu hấp phụ. Lọc máu hấp phụ là kỹ thuật sử dụng cột than hoạt tính hoặc cột resin nhằm tăng cường đào thải DQ trong máu bệnh nhân ngộ độc. Xét nghiệm định lượng nồng độ DQ huyết tương cung cấp công cụ quan trọng để đánh giá hiệu quả của các biện pháp điều trị tăng thải trừ này.

Tuy nhiên, cho đến nay tại Việt Nam việc xét nghiệm DQ chỉ dừng ở mức độ định tính trong nước tiểu bằng phương pháp so màu để xác định bệnh nhân ngộ độc DQ mà chưa có cơ sở xét nghiệm nào có thể thực hiện việc định lượng nồng độ DQ máu với kết quả đáng tin cậy. Điều này dẫn đến một khoảng trống lớn trong chẩn đoán, tiên lượng cũng như đánh giá hiệu quả của các biện pháp lọc máu làm cho việc điều trị ngộ độc DQ tại Trung tâm Chống độc và các khoa hồi sức cấp cứu trên cả nước gặp rất nhiều khó khăn. Để định lượng DQ trong huyết tương trên thế giới đã áp dụng các phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS), điện di mao quản (CE), sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS). Tại Trung tâm chống độc bệnh viện Bạch Mai hiện đang sử dụng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao để xét nghiệm độc chất nhưng cũng chưa có quy trình chuẩn định lượng DQ huyết tương.

Vì vậy, chúng tôi chọn đề tài nghiên cứu “Xác định thuốc diệt cỏ Diquat trong mẫu huyết tương người bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao”. 2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Tổng quan về diquat 1. Công thức diquat Diquat (DQ) có tên khoa học là 1,1'-Ethylene-2,2'-bipyridylium là thuốc diệt cỏ không chọn lọc, thuộc lớp bipyridunium, được tạo ra lần đầu ở nước Anh vào năm 1955 và sản xuất thương mại lần đầu vào năm 1958.

Trong thương mại, DQ phổ biến dưới dạng dung dịch DQ dibromide 20%. DQ có khối lượng phân tử tương đối 184,24 g/mol và có công thức hóa học như hình 1. 1: Công thức cấu tạo của Diquat 1. Tính chất lý, hóa học của diquat DQ thường có màu vàng nhạt, không mùi, tỷ trọng ở 200C là 1,220-1,270, bị phân hủy trước khi đun sôi hoặc nóng chảy và pH của dung dịch DQ trong nước 6,0 - 7,0.

DQ thường ở dạng dibromide hoặc dichloride. Dạng dibromide bột tinh thể có màu vàng nhạt, không mùi, hút ẩm mạnh tan dễ dàng trong nước (700 g/L nước), tan ít trong cồn (25 g/L) và hầu như không tan trong các dung môi hữu cơ không 3 phân cực (<0. Ở dạng dung dịch 20%, Diquat dibromide là chất lỏng màu nâu đen và mùi đất, pH từ 6,0 - 7,0. Dung dịch diquat rất ổn định trong điều kiện tự nhiên và môi trường axit, nhưng bị thủy phân trong môi trường kiềm pH trên 9,0 do sự hấp thụ anion OH- làm phá vỡ vòng pyridine.

Trong môi trường tự nhiên, DQ mang bản chất cation nên gắn mạnh với các chất khoáng sét và có trong đất, hình thành liên kết ion và mất tác dụng; nhanh chóng phân hủy dưới tia UV trong ánh sáng mặt trời nên được coi là loại thuốc trừ cỏ an toàn với môi trường. DQ được sản xuất bởi nhiều công ty khác nhau với các tên thương mại và hàm lượng khác nhau, nói chung thường ở dạng dung dịch màu xanh. Một số tên gọi thường gặp của DQ như: Aquacide, Aquakill, Reglone, Reglox, Vegetrole, Torpedo, Weedtrine-D,… 1. Cơ chế gây độc của diquat DQ đang dần bị cấm như một loại hóa chất bảo vệ thực vật vì độc tính gây tử vong của nó.

(EU cấm vào năm 2018, Anh cấm vào năm 2019,…) Tuy nhiên, tại Việt Nam, DQ vẫn được phép sử dụng và vì PQ đã bị cấm vào năm 2017 nên DQ trở thành một loại thuốc diệt cỏ được sử dụng phổ biến thay thế PQ. Cơ chế gây độc của DQ được mô tả theo sơ đồ (Hình 1. Dưới sự có mặt của sắt, anion superoxid O2● tự do phản ứng với hydro peroxid H2O2 để tạo ra gốc tự do hydroxyl OH●. Gốc tự do OH● có thể tấn công các chuỗi lipid trên màng tế bào sinh học, khởi động quá trình oxy hóa lipid dẫn đến tổn thương màng tế bào và gây chết tế bào.

ROS có thể gây tổn thương nguyên tử hydrogens nhóm allylic của phân tử acid béo không bão hòa có mặt trong màng tế bào, tạo ra gốc lipid tự do peroxyl, sau đó tiếp tục cắt bỏ nguyên tử hydro gốc ally khỏi phân tử acid béo liền kề để tạo ra lipid hydroperoxide LOOH, dẫn tới sự oxy hóa acid béo (LPO). Hiện tượng này 4 làm giảm tính lỏng, tăng tính bền của màng tế bào, dễ dàng hơn cho phospholipid tráo đổi giữa 2 lớp phospholipid, phá vỡ giới hạn cho vật chất di chuyển qua màng tế bào, dẫn tới màng tế bào bị xé rách và hệ quả là hoại tử mô tế bào. LPO có thể vô hiệu hóa các recepter hoặc enzym gắn màng tế bào, và gián đoạn hoạt động chức năng của chúng. Các sản phẩm của quá trình LPO có thể gây đột biến và thay đổi biểu hiện gene thông qua biến đổi ADN.

Các nghiên cứu trên động vật đã cho thấy độc tính DQ trên gan, chắc chắn có một phần, gây ra bởi phản ứng thủy thân lipid bởi gốc oxy tự do, đồng thời cho thấy các chất có hoạt tính chống oxy hóa mạnh và các chất thu nhặt gốc tự do như melatonin là có tác dụng bảo vệ. Tổn thương gan và phản ứng oxy hóa khử chất béo gây ra bởi DQ đã được giảm đáng kể trên các con chuột chuyển gen có mức độ hoạt động cao enzym glutathion peroxidase. Bên cạnh ROS, tác dụng gây stress oxi hóa bởi DQ còn được chứng minh bởi các gốc nito tự do, có thể kể đến tác dụng giảm NO trên chuột lang và sinh ra peroxynitrite (ONOO-) trong tế bào gan từ phản ứng O2●- với NO●. N-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME), một chất đối kháng cạnh tranh không đặc hiệu với nitrogen oxide synthetase, đã được tìm ra có thế giới hạn sự phát triển của các gốc nitơ tự do trong tế bào thần kinh bằng cách giảm tổng hợp NO●.

Dưới sự có mặt của sắt, anion superoxid O2● tự do phản ứng với hydro peroxid H2O2 để tạo ra gốc tự do hydroxyl OH●. Gốc tự do OH● có thể tấn công các chuỗi lipid trên màng tế bào sinh học, khởi động quá trình oxy hóa lipid dẫn đến tổn thương màng tế bào và gây chết tế bào. ROS có thể gây tổn thương nguyên tử hydrogens nhóm allylic của phân tử acid béo không bão hòa có mặt trong màng tế bào, tạo ra gốc lipid tự do peroxyl, sau đó tiếp tục cắt bỏ nguyên tử hydro gốc ally khỏi phân tử acid béo liền kề để tạo ra lipid hydroperoxide LOOH, dẫn tới sự oxy hóa acid béo (LPO). Hiện tượng này làm giảm tính lỏng, tăng tính bền của màng tế bào, dễ dàng hơn cho phospholipid tráo đổi giữa 2 lớp phospholipid, phá vỡ giới hạn cho vật chất di chuyển qua màng tế bào, dẫn tới màng tế bào bị xé rách và hệ quả là hoại tử mô tế bào.

LPO có thể vô 5 hiệu hóa các recepter hoặc enzym gắn màng tế bào, và gián đoạn hoạt động chức năng của chúng. 2: Cơ chế ngộ độc Diquat Các sản phẩm của quá trình LPO có thể gây đột biến và thay đổi biểu hiện gene thông qua biến đổi ADN. Các nghiên cứu trên động vật đã cho thấy độc tính DQ trên gan, chắc chắn có một phần, gây ra bởi phản ứng thủy thân lipid bởi gốc 6 oxy tự do, đồng thời cho thấy các chất có hoạt tính chống oxy hóa mạnh và các chất thu nhặt gốc tự do như melatonin là có tác dụng bảo vệ. Tổn thương gan và phản ứng oxy hóa khử chất béo gây ra bởi DQ đã được giảm đáng kể trên các con chuột chuyển gen có mức độ hoạt động cao enzym glutathion peroxidase.