Luận văn: Xác định Amlodipin và Perindopril bằng phương pháp điện di mao quản

Luận văn xây dựng quy trình xác định Amlodipin và Perindopril bằng phương pháp điện di mao quản. Ứng dụng phân tích trong mẫu dược phẩm và nước tiểu.

• Tác giả: Tran Ngoc Hang
• Người hướng dẫn: TS. Le Dinh Chi
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Hóa phân tích
• Đề tài: Xác định Amlodipin Besilat Và Perindopril Tert-Butylamin Bằng Phương Pháp Điện Di Mao Quản
• Loại tài liệu: Luận văn Thạc sĩ Khoa học
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Amlodipin và Perindopril

Amlodipin besilat và perindopril tert-butylamin là hai hoạt chất dùng trong điều trị tăng huyết áp và bệnh tim mạch. Amlodipin thuộc nhóm chẹn kênh calci, giúp giãn mạch máu và hạ huyết áp hiệu quả. Perindopril là chế phẩm ức chế enzym chuyển đổi angiotensin (ACE), có tác dụng bảo vệ tim và thận. Hai chất này thường được kết hợp trong các dược phẩm như Coveram để tăng hiệu quả điều trị. Việc xác định chính xác hàm lượng hai hoạt chất này là rất quan trọng để đảm bảo chất lượng dược phẩm và hiệu quả điều trị cho bệnh nhân. Phương pháp điện di mao quản (CE) là một giải pháp phân tích hiện đại và hiệu quả.

1.1. Thông tin chung về Amlodipin besilat

Amlodipin besilat là muối besilat của amlodipin, được sử dụng rộng rãi trong điều trị tăng huyết áp. Chất này có khả năng chẹn kênh canxi và làm giãn các mạch máu ngoại biên, giảm sức cản mạch máu và hạ huyết áp. Amlodipin có đặc tính lipophilic, cho phép nó thâm nhập vào tế bào cơ trơn mạch máu. Chất này có tác dụng dài hạn, cho phép bệnh nhân chỉ cần dùng một lần mỗi ngày. Hàm lượng điển hình trong các dược phẩm dao động từ 5-10mg/ngày.

1.2. Đặc điểm của Perindopril tert butylamin

Perindopril tert-butylamin là ức chế ACE có hiệu quả cao, được chuyển hóa thành perindoprilat hoạt động trong cơ thể. Chất này giúp giảm huyết áp bằng cách ức chế sự hình thành angiotensin II, một chất co mạch mạnh. Perindopril có tác dụng bảo vệ chức năng tim và thận, đặc biệt hữu ích cho bệnh nhân suy tim và đái tháo đường. Liều lượng thường dùng là 4-8mg mỗi ngày, có thể kết hợp với các chất chẹn kênh calci.

II. Phương pháp Điện di Mao quản CE

Điện di mao quản (Capillary Electrophoresis - CE) là một phương pháp phân tích hiện đại dựa trên sự tách biệt các chất ion dựa trên khác biệt về tỷ lệ điện tích và khối lượng phân tử. Phương pháp này sử dụng một mao quản nhỏ (đường kính 50-100 micromet) chứa dung dịch đệm điện li. Khi áp dụng hiệu điện thế cao (20-30 kV), các chất ion sẽ di chuyển với vận tốc khác nhau, tạo ra sự tách biệt hoàn hảo. CE-C4D (Conductivity Detection) là kỹ thuật phát hiện dựa trên độ dẫn điện, rất phù hợp cho các chất ion như amlodipin và perindopril. Phương pháp này có ưu điểm là tiêu tốn ít mẫu, chọn lọc cao, thời gian phân tích ngắn và độ phân giải tuyệt vời.

2.1. Nguyên tắc hoạt động của điện di mao quản

Nguyên tắc CE dựa trên sự khác biệt về tính chất điện của các chất. Các phân tử ion được đặt trong dung dịch đệm và chịu tác động của trường điện mạnh. Dòng điện di thẩm thấu (EOF) là chuyển động tổng thể của dung dịch đệm hướng về một điện cực, giúp dẫn động các chất không ion hoặc yếu ion. Các chất có tính acid sẽ mang điện âm và di chuyển về anode, trong khi chất base sẽ mang điện dương di chuyển về cathode. Tốc độ di chuyển phụ thuộc vào điện tích, kích thước phân tử và độ nhớt môi trường.

2.2. Dung dịch đệm và điều kiện tối ưu

Lựa chọn dung dịch đệm là yếu tố then chốt cho sự thành công của phân tích CE. pH của dung dịch đệm ảnh hưởng trực tiếp đến độ ion hóa của các chất cần phân tích. Đối với amlodipin và perindopril, pH tối ưu thường nằm trong khoảng 2.5-3.5 để đạt sự tách biệt tốt nhất. Nồng độ đệm, thành phần hóa học (phosphate, citrate) và điện áp áp dụng đều ảnh hưởng đến chất lượng phân tích. Nhiệt độ cũng cần được kiểm soát để tránh hiện tượng phân tầng nhiệt trong mao quản.

III. Tối ưu hóa phương pháp xác định Amlodipin và Perindopril

Quá trình tối ưu hóa điều kiện phân tích là bước quan trọng để đạt được độ phân giải cao và thời gian phân tích ngắn. Nghiên cứu đã khảo sát ảnh hưởng của pH, nồng độ dung dịch đệm, điện áp áp dụng, thời gian bơm mẫu và chiều cao bơm mẫu. Kết quả cho thấy điều kiện tối ưu là sử dụng đệm phosphate pH 3.0 với nồng độ 50 mM, áp dụng điện áp 20 kV, thời gian bơm 3 giây ở độ cao 50 mm. Dưới các điều kiện này, amlodipin và perindopril được tách biệt rõ ràng với thời gian phân tích khoảng 15-20 phút. Phương pháp cho phép phát hiện lượng chất rất nhỏ (mức ppb) và có độ lặp lại cao.

3.1. Khảo sát hệ thống đệm và pH

Khảo sát ảnh hưởng pH cho thấy khi pH tăng từ 2.0 lên 4.0, thời gian di chuyển của cả amlodipin và perindopril đều tăng, nhưng độ phân giải giảm. pH tối ưu là 3.0, nơi đạt được cân bằng tốt giữa độ phân giải và thời gian phân tích. Hệ đệm phosphate 50 mM cho diện tích pic lớn nhất và đường chuẩn tuyến tính. Nền ion backgroundI nên được kiểm soát để tránh làm tăng noise trong dectection.

3.2. Các thông số kỹ thuật bơm mẫu

Thời gian bơm mẫu và chiều cao bơm ảnh hưởng đến lượng chất được đưa vào mao quản. Khảo sát cho thấy khi tăng thời gian bơm từ 1 đến 5 giây, diện tích pic tăng tuyến tính. Thời gian bơm 3 giây được chọn làm tối ưu vì cân bằng giữa độ nhạy và độ phân giải. Chiều cao bơm 50mm cũng cho kết quả tốt nhất, giúp đạt độ lặp lại cao (RSD < 5%) trong các lần phân tích liên tiếp.

IV. Ứng dụng thực tế và đánh giá phương pháp

Phương pháp CE-C4D được áp dụng thành công để phân tích mẫu dược phẩm chứa amlodipin và perindopril như Coveram, Coversyl, và Ambelin. Kết quả cho thấy hàm lượng amlodipin và perindopril trong các mẫu thuốc nằm trong khoảng cho phép (95-105% hàm lượng khai báo). Phương pháp có giới hạn phát hiện (LOD) lần lượt là 0.05 µg/mL và 0.08 µg/mL, giới hạn định lượng (LOQ) là 0.15-0.25 µg/mL. Độ lặp lại (RSD) nằm trong khoảng 2-4%, độ thu hồi khi thêm chuẩn đạt 98-102%. Phương pháp cũng được phát triển thêm để xác định amlodipin trong mẫu nước tiểu qua kỹ thuật chiết lỏng-lỏng, mở ra ứng dụng trong theo dõi nồng độ chất trong sinh học.

4.1. Phân tích mẫu dược phẩm Coveram

Mẫu dược phẩm Coveram được phân tích trực tiếp bằng phương pháp CE-C4D sau khi chuẩn bị mẫu đơn giản. Hàm lượng amlodipin được xác định là 99.5% ± 2.1%, perindopril là 100.2% ± 1.8%. Các kết quả này phù hợp với yêu cầu của Dược điển và các tiêu chuẩn quốc tế. Phương pháp cho phép phân tích nhanh mà không cần sử dụng hóa chất dư thừa, thân thiện với môi trường.

4.2. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp

Độ tin cậy của phương pháp CE-C4D được đánh giá qua các thông số: độ chụm (RSD 2-4%), độ đúng (98-102% thu hồi), khoảng tuyến tính rộng (0.2-100 µg/mL), LOD và LOQ thấp. Phương pháp ổn định, lặp lại cao, không chịu ảnh hưởng bởi các tạp chất thường gặp trong mẫu dược phẩm. Kết quả so sánh với phương pháp HPLC tham chiếu cho thấy sự tương thích cao, chứng minh độ chính xác của phương pháp CE-C4D.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Cùng với sự phát triển nhanh chóng của xã hội hiện đại, chất lƣợng cuộc sống và sức khỏe con ngƣời đƣợc quan tâm nhiều hơn. Tỉ lệ những ngƣời mắc bệnh tăng huyết áp, suy tim, đau tim ngày càng cao do các thói quen sinh hoạt, chế độ ăn uống không hợp lí hoặc do yếu tố di truyền và tuổi tác. Theo số liệu thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới, tăng huyết áp ảnh hƣởng đến sức khỏe của hơn 1 tỷ ngƣời trên toàn thế giới và là yếu tố nguy cơ tim mạch quan trọng nhất liên quan đến bệnh mạch vành, suy tim, bệnh mạch máu não và bệnh thận mãn tính. Năm 2015, trong số 17,7 triệu ngƣời tử vong do các bệnh tim mạch, chiếm 31% tổng số ca tử vong toàn cầu, ƣớc tính tăng huyết áp là nguyên nhân trực tiếp gây tử vong của 7,1 triệu ngƣời [17].

Nếu điều trị tốt bệnh tăng huyết áp có thể làm giảm đến 50% nguy cơ mắc suy tim ở ngƣời bệnh. Năm 2015 Hội tim mạch học Việt Nam đã nghiên cứu và thống kê đƣợc 5.454 trƣờng hợp trong tổng số 44 triệu ngƣời ở 8 tỉnh thành của Việt Nam mắc bệnh cao huyết áp, tƣơng đƣơng với 47,3% dân số. Amlodipin besilat kết hợp perindopril tert-butylamin là một trong những thuốc đƣợc sử dụng phổ biến trong việc điều trị, kiểm soát, phòng chống và cải thiện những bệnh, hội chứng nhƣ cao huyết áp, mãn cơn đau thắt ngực ổn định, suy tim, đau tim. Tuy nhiên hiện nay nhiều doanh nghiệp sản xuất thuốc vì lợi ích kinh tế đã sản xuất ra những sản phẩm kém chất lƣợng, không đạt hàm lƣợng hay không có hoạt chất nhƣ trên bao bì làm ảnh hƣởng đến khả năng điều trị bệnh cũng nhƣ sức khỏe của con ngƣời.

Vì vậy, việc nghiên cứu xây dựng một quy trình định lƣợng amlodipin besilat và perindopril tert-butylamin đơn giản, dễ thực hiện và có độ chính xác cao là hết sức cần thiết. Phƣơng pháp điện di mao quản tích hợp detector đo độ dẫn không tiếp xúc (CE- C4D) đƣợc biết đến là một phƣơng pháp phân tích mới tại Việt Nam, với trang bị nhỏ gọn, có thể tự động hóa và triển khai tại hiện trƣờng với lƣợng nhỏ mẫu và hóa chất, 1 chi phí phân tích thấp. Phƣơng pháp cho thấy tiềm năng sử dụng với các ứng dụng thiết thực tại Việt Nam, trong đó có việc phân tích hàm lƣợng các chất trong mẫu dƣợc phẩm. Vì vậy, chúng tôi đã lựa chọn đề tài “Xác định amlodipin besilat và perindopril tert-butylamin bằng phƣơng pháp điện di mao quản”, hy vọng sẽ góp một phần nhỏ bé vào việc phát triển các quy trình phân tích kiểm tra hàm lƣơng cać chất trong dƣơc phâm̉œ và mẫu sinh học.

2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Giới thiệu chung Amlodipin besilat là muối besilat của amlodipin, một dẫn xuất của dihydropyridin tổng hợp. Amlodipin nằm trong một nhóm thuốc gọi là thuốc chẹn kênh canxi có tác dụng chẹn canxi qua màng tế bào, chống cao huyết áp và điều trị đau thắt ngực [9, 14, 20, 32]. Perindopril tert-butylamin là muối tert-butylmin của perindopril, là một thuốc ức chế men chuyển angiotensine (ACE) [20, 27, 30].

Thông tin chung về amlodipin besilat và perindopril tert-butylamin Một số thông tin chung về amlodipin besilat và perindopril tert-butylamin nhƣ công thức phân tử, cấu tạo phân tử và khối lƣợng phân tử đƣợc đƣa ra trong bảng 1. Thông tin chung về amlodipin besilat và perindopril tert-butylamin [7, 8, 14, 20, 21, 27] Tên chất Amlodipin besilat Perindopril tert-butylamin (2S, 3αS, 7αS)-1-[(S)-N - 2-[(2-Aminoethoxy) [(S)-1-carboxy-butyl] alanyl] methyl]-4-(2–chlorophenyl)- hexahydro-2- 1,4–dihydro–6–methyl–3,5– Tên hóa học indolinecarboxylic acid, 1- pyridinedicarboxylic acid 3– ethylester, kết hợp với tert- ethyl 5–methyl ester butylamine (1: 1). Công thức phân tử C26H31CIN2O8S C23H33N3O5 3 Công thức cấu tạo Khối lƣợng phân 567,05 441,69 tử (g. Tính chất vật lý, vai trò và tác dụng phụ 1.

Amlodipin besilat - Tính chất: Amlodipin besilat dạng bột tinh thể màu trắng hoặc vàng nhạt, không có mùi, tan trong nƣớc và methanol [12]. • Nhiệt độ nóng chảy: 199-201ºC • Khối lƣợng riêng: 1,227 g/cm3 • Nhiệt độ sôi: 527,2ºC ở 760 mmHg - Vai trò: Amlodipin besilat đƣợc sử dụng để điều trị cao huyết áp, giúp ngăn ngừa đột quỵ và các vấn đề về thận. Amlodipin besilat cũng đƣợc sử dụng để phòng ngừa đau thắt ngực, nó có thể giúp tăng khả năng co bóp của tim và giảm tần suất các cơn đau thắt ngực [9, 15]. - Cơ chế hoạt động: Amlodipin besilat ức chế sự xâm nhập của ion canxi đi qua màng vào tế bào cơ tim và các mô cơ trơn của thành mạch máu bằng cách ngăn chặn những kênh canxi chậm của màng tế bào.

Ức chế sự gia tăng canxi ban đầu làm giảm 4 hoạt động co bóp của các tế bào động cơ trơn do đó ngăn ngừa sự co mạch và cơ tim co lại. Điều này dẫn đến sự giãn nở các động mạch vành chính cả vùng bình thƣờng lẫn vùng thiếu máu, giảm sự co bóp cơ tim, tăng lƣu lƣợng máu và cung cấp oxy đến mô cơ tim và giảm tổng kháng ngoại vi, kéo theo hạ huyết áp và chống đau thắt ngực [9]. - Amlodipin besilat đƣợc hấp thụ tốt sau khi uống nên sự phân phối thuốc rất rộng trong cơ thể, tuy nhiên thuốc hấp thu chậm và gần nhƣ hoàn toàn ở đƣờng tiêu hóa, sự hấp thu không bị ảnh hƣởng bởi thức ăn. Nồng độ đỉnh trong huyết tƣơng đạt đƣợc từ 6-12 giờ sau khi uống, sinh khả dụng từ 64 – 80%, thể tích phân khối khoảng 20 l/kg.

Trong gan thuốc đƣợc chuyển hóa chủ yếu thành những chất chuyển hóa bất hoạt, 10% thuốc chƣa chuyển hóa và 60% chất chuyển hóa đƣợc bài tiết theo nƣớc tiểu. Thuốc thải trừ theo hai pha, thời gian bán thải cuối cùng trung bình là 35 – 50 giờ. Thuốc không có tác dụng chuyển hóa có hại, không ảnh hƣởng đến lipid huyết tƣơng. Ở những ngƣời bệnh cao huyết áp liều một lần/ngày làm giảm huyết áp tới mức độ có ý nghĩa lâm sàng hơn 24 giờ ở tƣ thế nằm lẫn đứng.

- Tác dụng phụ: Trong những nghiên cứu lâm sàng có kiểm chứng thu nhận từ ngƣời bệnh cho thấy những tác dụng phụ thƣờng gặp nhất của amlodipin besilat là phù, nề, sƣng bàn tay, bàn chân, mắt cá chân, nhức đầu, mệt mỏi, buồn nôn, đau bụng hồi hộp, choáng váng. Ngoài ra còn có các tác dụng phụ khác là thay đổi hoạt động tiêu hóa, đau khớp, suy nhƣợc, khó tiêu, tăng sản lợi, nổi mẩn, loạn thị giác. Perindopril tert-butylamin - Tính chất: Perindopril tert-butylamin là chất rắn màu trắng, tan trong nƣớc và metanol. • Khối lƣợng riêng: 1,15 g/cm3 • Nhiệt độ nóng chảy: 126-128ºC • Nhiệt độ sôi: 537ºC ở 760 mmHg 5 - Vai trò: Perindopril đƣợc sử dụng để điều trị cao huyết áp, giảm nguy cơ đau tim hoặc tử vong do các vấn đề về tim ở bệnh nhân có bệnh về động mạch vành [27, 33].

- Cơ chế hoạt động: Perindopril ổn định dƣới dạng muối perindopril tert- butylamin đƣợc thủy phân thành perindoprilat, một chất ức chế chuyên biệt enzym chuyển đổi angiotensine ở ngƣời và động vật. Enzym chuyển đổi angiotensine kích thích sự chuyển đổi enzym chuyển đổi angiotensine I thành enzym chuyển đổi angiotensine II. Enzym chuyển đổi angiotensine II là một chất gây co mạch ngoại vi mạnh đồng thời kích thích bài tiết aldosteron từ vỏ thƣợng thận. Kết quả là giảm bài tiết aldosteron, tăng hoạt tính của renin trong huyết tƣơng, aldosteron không còn đóng vai trò hồi tác âm, giảm tổng kháng ngoại biên với tác động ƣu tiên trên cơ và thận, do đó làm giãn tĩnh mạch, khôi phục tính đàn hồi của động mạch lớn, giảm áp lực đổ đầy vào thất trái và phải, tăng lƣu lƣợng máu đến cơ.

- Perindopril dùng theo đƣờng uống, đƣợc hấp thu nhanh, tỉ lệ hấp thu chiếm 65-70 % liều dùng. Thức ăn có thể làm thay đổi lƣợng perindoprilat hình thành sau khi chuyển hóa từ perindopril. Đỉnh hấp thu của perindoprilat trong huyết tƣơng đạt đƣợc sau 3 đến 4 giờ. Thời gian bán hủy của perindoprilat khoảng 24 giờ.

Các nồng độ của perindoprilat trong huyết tƣơng tăng đáng kể ở bệnh nhân có thanh thải creatinine dƣới 60 ml/phút. - Tác dụng phụ về phƣơng diện lâm sàng khi sử dụng perindopril tert-butylamin: Ho khan, phù mạch, nhức đầu, suy nhƣợc, buồn nôn, thay đổi vị giác chóng mặt, rối loạn tính khí, rối loạn giấc ngủ, phát ban ngoài da, đau bao tử…Về phƣơng diện sinh học: tăng vừa phải ure, creatinin và kali huyết, thiếu máu [27]. Kết hợp amlodipin besilat và perindopril tert-butylamin Perindopril tert-butylamin là một chất ức chế men chuyển angiotensin. Amlodipin besilat là một chất đối kháng canxi.

Perindopril và amlodipin hoạt động kết 6 hợp để làm giãn và nới lỏng các mạch máu, điều này dẫn đến hạ huyết áp. Máu có thể lƣu thông dễ dàng hơn trong cơ thể và tim không cần phải hoạt động nhiều. Một số thuốc đã kết hợp cả hai hoạt chất này nhƣ Coveram sản xuất bởi Servier Ireland Industries Ltd, Ireland), Beatil (sản xuất bởi Gedeon Richer Polska, Poland)… 1. Các phƣơng pháp xác định 1.

Phƣơng pháp sắc ký Một trong các phƣơng pháp phổ biến để xác định amlopidin và perindoprin là phƣơng pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng detector UV dựa trên khả năng hấp thụ quang của chúng tại vùng bƣớc sóng tử ngoại. Bên cạnh đó phƣơng pháp sắc kí bản mỏng hiệu năng cao cũng là một phƣơng pháp đƣợc sử dụng tƣơng đối phổ biến. Trong công trình nghiên cứu của tác giả A.Zarghi và các cộng sự [8] đã sử dụng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để định lƣợng amlodipin trong huyết tƣơng. Amlodipin sau khi đƣợc tách ra khỏi nền mẫu đƣợc làm khô bằng khí nitơ, cặn đƣợc hòa tan trong 100 µl pha động là hỗn hợp của dung dịch natri dihydrogen phosphat 0,01 M và acetonitril (63:37, v/v) điều chỉnh tới pH 3,5 và bơm 50 µl vào thiết bị phân tích, sử dụng cột Nucleosil C8 (125 x 4,6 mm) với tốc độ dòng chảy là 1,5 ml/phút, bƣớc sóng đƣợc đặt ở 239 nm.

Bằng cách này các tác giả đã xây dựng đƣờng chuẩn với khoảng tuyến tính trong phạm vi nồng độ 0,5-16 ng/ml. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp là 0,2 ng/ml. Phƣơng pháp đơn giản và đạt hiệu suất thu hồi cao 97 %. Trong một bài báo khác, tác giả Prameela Rani và các cộng sự [28] đã phát triển phƣơng pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) để xác định hàm lƣợng perindopril tert-butylamin trong viên nén với detector DAD.

Quá trình tách chất đƣợc thực hiện trên cột YMC-Pack C18 (250 mm × 4,6 mm, kích thƣớc hạt là 5 mm) ở nhiệt độ cột là 50oC. Pha động là hỗn hợp của đệm acetonitril và kali photphat (0,05 M) 7 (37:63, v/v) (pH= 2,5) pH của pha động đã đƣợc điều chỉnh với acid ortophosphoric. Hỗn hợp acetonitril-nƣớc (40 : 60, v/v) đƣợc sử dụng làm dung môi.