Đặt vấn đề Nước ta là một nước nhiệt đới với những điều kiện khí hậu thuận lợi, vì vậy nguồn tài nguyên thiên nhiên rất phong phú và đa dạng. Cùng với nền y học cổ truyền dân tộc có truyền thống lâu đời, nhân dân ta đã biết sử dụng các loài cây cỏ xung quanh làm nguồn dược liệu để chữa bệnh rất có hiệu quả. Ngày nay, bên cạnh thuốc tân dược thì các loại dược liệu có nguồn gốc từ thiên nhiên ngày càng được ưa chuộng. Sự thay đổi khí hậu toàn cầu dẫn tới sự khắc nghiệt của thời tiết, môi trường sống bị ô nhiễm, thói quen sinh hoạt của con người thay đổi, thực phẩm không an toàn… Những yếu tố này tác động đến sức khỏe của con người, làm gia tăng nguy cơ mắc bệnh, trong đó có nguy cơ các tế bào bị biến đổi.
Đây là một trong các nguyên nhân làm cho số ca mắc bệnh ung thư ngày càng tăng. Vì thế, một trong những nhiệm vụ hàng đầu của các nhà khoa học là nghiên cứu, cải tiến các biện pháp chữa trị ung thư để nâng cao chất lượng đời sống cho người bệnh. Cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L. Don) là một trong những cây có khả năng sản xuất các indol alkaloid có dược tính quan trọng trong chế tạo các loại thuốc chống ung thư, đặc biệt là ung thư máu.
Trong các indol alkaloid có mặt trong cây dừa cạn, hai loại alkaloid là vinblastine, vincristine được sử dụng nhiều nhất. Nhưng các chất này lại có hàm lượng rất nhỏ trong cây dừa cạn, khoảng nửa tấn lá khô mới chiết được 1g vinblastine cho sản xuất dược phẩm (Noble, 1990) [21]. Các chất này không thể tổng hợp bằng con đường hóa học do có cấu trúc rất phức tạp. Do vậy, nâng cao hàm lượng vinblastine và vincristine trong cây dừa cạn theo hướng công nghệ gen là một hướng nghiên cứu được quan tâm bởi nhiều nhà khoa học trên thế giới.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – 1ĐHTN http://www.vn Trong cây dừa cạn, vinblastine và vincristine được tạo ra từ sự kết hợp của catharanthine và vindoline. Gen CrPrx mã hoá peroxidase có chức năng xúc tác cho phản ứng tạo tiền chất cho sự tổng hợp vinblastine và vincristine. Các nghiên cứu cho thấy, trong các giống dừa cạn hiện có thì giống dừa cạn hoa hồng nhụy tím có hàm lượng alkaloid toàn phần và các chất là vinblastine và vincristine cao nhất. Nâng cao năng suất tổng hợp vinblastine và vincristine trong cây dừa cạn phục vụ cho việc tạo thuốc chữa bệnh ung thư là rất cần thiết.
Để tăng năng suất tổng hợp hai loại alkaloid trên, việc nghiên cứu đặc điểm gen tham gia vào các con đường tổng hợp alkaloid và thiết kế vector phục vụ chuyển gen là rất quan trọng. Từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc gen CrPrx phân lập từ cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L. Mục tiêu nghiên cứu Phân lập được đoạn mã hóa cDNA của gen CrPrx từ cây dừa cạn hoa hồng tím. Thiết kế được vector chuyển gen mang cấu trúc gen CrPrx phân lập từ cây dừa cạn hoa hồng tím, phục vụ chuyển gen nâng cao hàm lượng alkaloid ở cây dừa cạn.
Nội dung nghiên cứu Phân lập, tách dòng gen CrPrx. Xác định trình tự gen CrPrx được nhân lên từ cặp mồi chứa điểm cắt của enzyme giới hạn NotI/NcoI. Thiết kế vector chuyển gen mang gen CrPrx từ cây dừa cạn hoa hồng tím. Tạo dòng vi khuẩn A.tumefaciens mang vector chuyển gen gắn CrPrx.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – 2ĐHTN http://www.vn Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu về cây dừa cạn 1. Nguồn gốc và phân loại Cây dừa cạn hay còn gọi là hải đằng, dương giác, bông dừa, trường xuân, hoa thuộc họ Apocynaceae, chi Catharanthus, loài Catharanthus roseus. Cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.
Don) có nguồn gốc ở Madagasca (châu Phi), mọc hoang và được trồng ở nhiều nước nhiệt đới và ôn đới như Việt Nam, Ấn Độ, Indonesia…. Cây dừa cạn được người Pháp đưa vào trồng ở Việt Nam để làm cây cảnh. Tại châu Âu và châu Mỹ ở những vùng nóng cây dừa cạn được trồng quanh năm, nhưng ở những vùng lạnh cây được trồng theo mùa vì không chịu được lạnh. Cây dừa cạn dễ trồng, phát triển nhanh chịu nắng, hạn tốt, không kén đất và ít phải chăm sóc, cách chăm sóc không quá đặc biệt nên ít lâu sau nó đã lan ra ở nhiều địa phương, nhất là ở các tỉnh đồng bằng và ven biển nước ta.
Cây dừa cạn ra hoa quanh năm, chủ yếu là từ tháng 5 - 9 [5]. Ở Việt Nam, dừa cạn có vùng phân bố tự nhiên tương đối đặc trưng từ tỉnh Quảng Ninh đến Kiên Giang dọc theo vùng ven biển, tương đối tập trung ở các tỉnh miền Trung như Thanh Hóa, Nghệ An, Thừa Thiên - Huế, Quảng Nam, Ðà Nẵng, Bình Ðịnh và Phú Yên. Ở những vùng phân bố tự nhiên ven biển, dừa cạn có khi mọc gần như thuần loại trên các bãi cát dưới rừng phi lao, trảng cỏ, cây bụi thấp, có khả năng chịu đựng điều kiện đất đai khô cằn của vùng cát ven biển. Trước đây cây dừa cạn còn chỉ được trồng để làm cảnh, nhưng gần đây cây đã được trồng để thu hoạch lấy cây, lá, rễ dùng làm thuốc [5].
Cây dừa cạn là nguồn giàu alkaloid thuộc alkaloid terpenoid indole được phân lập từ 3 giống cây khác nhau: (1) Catharanthus roseus “Roseus” có hoa Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – 3ĐHTN http://www.vn màu hồng tím; (2) Catharanthus roseus “Ocellatus” có hoa màu trắng nhụy đỏ; (3) Catharanthus roseus “Albus” có hoa màu trắng. Trong đó, hoa màu hồng tím có hàm lượng vincristine và vinblastine cao nhất [37].1: Hoa của ba giống Catharanthus roseus (L. Đặc điểm sinh học của cây dừa cạn Cây dừa cạn là cây thân thảo sống lâu năm, cao 40cm – 60cm, phân nhiều cành, cây có bộ rễ phát triển, thân gỗ ở phía gốc, mềm ở phần trên. Thân hình trụ có 4 khía dọc, lông ngắn, thân non màu xanh lục nhạt sau chuyển sang màu hồng tím có bộ rễ rất phát triển, thân gỗ ở phía gốc, mềm ở phần trên.
Cây dừa cạn mọc thành bụi dày có cành đứng. Lá mọc đối, thuôn dài, đầu lá hơi nhọn, phía cuống hẹp nhọn, kích thước của lá thường biến động tùy từng vùng phân bố dài 3cm - 6cm, rộng 2cm - 3cm. Cuống lá ngắn 3 - 5mm. Gân lá hình lông chim lồi mặt dưới, gồm 12 - 14 cặp gân phụ hơi lồi mặt dưới.
Mỗi cành thường có 8 - 15 cặp lá, lá có phiến bầu dục màu xanh thẫm, mặt trên nhẵn mặt dưới có nhiều lông. Mùa hoa và quả vào tháng 4 - 5 và tháng 9 - 10 hàng năm [5]. Hoa đều, lưỡng tính, mẫu 5; cuống hoa dài 4 - 5mm. Lá đài 5, hơi dính nhau ở dưới, trên chia thành 5 thùy hình tam giác hẹp, có lông ở mặt ngoài, dài 3 - 4mm.
Cánh hoa 5, dính. Ống tràng màu xanh, cao 2 - 4cm, hơi phình ở gần họng, mặt ngoài có 5 chấm lồi; 5 thùy có màu đỏ hay hồng tím, trắng, …. Mặt trên và mặt dưới của hoa màu trắng, dài 1,5 - 1,7cm, miệng ống tràng có nhiều lông và có màu khác phiến (màu vàng hay đỏ nếu hoa trắng, màu đỏ sẫm hay vàng nếu hoa màu hồng tím). Nhị 5, rời, đính ở phần phình của ống tràng, xen Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – 4ĐHTN http://www.vn kẽ cánh hoa, chỉ nhị ngắn.
Hoa có mùi thơm, mọc riêng lẻ ở các kẽ lá phía trên. Quả gồm hai đại dài 2cm - 4cm, rộng 2mm – 3mm, mọc thẳng đứng hơi ngả hai bên, trên vỏ có vạch dọc, đầu quả hơi tù. Trong quả chứa 12 - 20 hạt nhỏ màu nâu nhạt, hình trứng, trên mặt hạt có các hột nổi thành đường chạy dọc [4], [2]. Rễ thường chỉ có một rễ cái và chùm rễ phụ.
Rễ cái đâm thẳng xuống đất có thể đạt chiều dài 30cm – 40cm, rễ phụ mọc thành chùm thưa ngắn, phát triển theo chiều ngang [4], [5]. Tác dụng của cây dừa cạn Trong tất cả các bộ phận của cây dừa cạn đều chứa alkaloid. Người ta đã chiết, phân lập ra trên 150 alkaloid khác nhau, chủ yếu là vinblastine, vincristine, tetrahydroalstonine, pirinine, vindoline, catharanthine, vindolinine, ajmalicine… chúng được sử dụng làm nguyên liệu điều trị bệnh ung thư [5]. Theo kinh nghiệm dân gian ở Việt Nam và Trung Quốc, có nơi dùng thân và lá phơi khô sắc uống để thông tiểu tiện, chữa bệnh đi tiểu đỏ và ít, làm thuốc điều kinh, tẩy giun, chữa sốt, săn da, chữa bệnh ngoài da.
Một số bài thuốc dân gian chữa bệnh ung thư của cây dừa cạn [4]: Tăng huyết áp: Lấy 20g thân lá dừa cạn khô sao vàng và 20g lá dâu, sắc lấy nước, chia uống từ 2 – 3 lần mỗi ngày. Cách khác, lấy 6g hoa dừa cạn, 10g nụ hoa hoè (hoặc 10g cúc hoa), hãm với nước sôi trong bình kín khoảng 20 phút. Uống thay nước trà mỗi ngày. Ung thư máu, viêm đại tràng: Lấy từ 15 – 20g thân lá dừa cạn khô sao vàng và sắc uống từ 2 – 3 lần trong ngày.
Mất ngủ: Lấy 20g thân lá dừa cạn khô sao vàng, 12g lá vông nem, 12g hạt muồng sao đen, sắc uống trước khi đi ngủ. Rong kinh: Lấy từ 20 – 30g dừa cạn sao vàng (toàn cây có cả hoa và rễ), sắc lấy nước, uống liên tục từ 3 – 5 ngày. Chữa bỏng nước sôi: Lá dừa cạn tươi lượng vừa đủ, giã nát, nhuyễn với chút gạo, đắp lên vết thương bỏng. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – 5ĐHTN http://www.vn Trị bệnh bạch cầu lympho cấp: Dùng 15g dừa cạn sắc nước uống.
Y học đã chiết được vinblastine từ lá dừa cạn và dưới dạng thuốc tiêm vinblastine sulfate để chữa bệnh này. Cây dừa cạn chữa bạch cầu cấp (bệnh máu trắng) bằng cách sắc dùng thân và lá cây dừa cạn (khoảng 15 gam thân, lá khô/ngày) sắc uống. Điều trị zona: Dừa cạn (sao vàng hạ thổ) 16g, thổ linh 16g, bạch linh 10g, kinh giới 12g, chi tử 10g, nam tục đoạn 16g, cam thảo đất 16g, hạ khô thảo 16g. Sắc uống ngày 1 thang, sắc 3 lần, uống 3 lần.
Thuốc đắp: lá dừa cạn kết hợp với lá cây hòe. Hai thứ lượng bằng nhau, giã nhỏ đắp lên các tổn thương, băng lại. Tác dụng làm giảm đau nhức. Điều trị lị trực trùng: Đi ngoài nhiều lần, bụng đau từng cơn, phân có chất nhầy, có máu mũi, sút cân nhanh.
Bài thuốc: dừa cạn (sao vàng hạ thổ) 20g, cỏ sữa 20g, cỏ mực 20g, chi tử 10g, lá khổ sâm 20g, hoàng liên 10g, rau má 20g, đinh lăng 20g. Đổ 3 bát nước sắc lấy 1,5 bát, chia 3 lần uống trong ngày.