Vai trò của Sox4 trong việc điều chỉnh sự đóng khe màng và phát triển võng mạc

Tài liệu nghiên cứu The role of sox4 in regulating choroid fissure closure and retina, tổng hợp lý thuyết và thực hành, cung cấp kiến thức chuyên sâu về .

• Tác giả: Wen Wen
• Người hướng dẫn: Dr. Ann C. Morris, Associate Professor of Biology
• Trường học: University of Kentucky
• Chuyên ngành: Biology
• Đề tài: Vai Trò Của Sox4 Trong Việc Điều Chỉnh Sự Đóng Khe Màng Và Phát Triển Võng Mạc
• Loại tài liệu: Doctoral Dissertation
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Lexington

Mục lục chi tiết

• ACKNOWLEDGEMENTS
• ABSTRACT OF DISSERTATION
• TABLE OF CONTENTS
• 1. CHAPTER 1: KEEPING AN EYE ON SOXC PROTEINS: VERTEBRATE EYE DEVELOPMENT AND SOXC TRANSCRIPTION FACTORS
• 1.1. Origin and morphogenesis of the vertebrate eye
• 1.2. Optic primordium specification
• 1.3. Eye field segregation
• 1.4. Optic cup and optic stalk formation
• 1.5. Cellular differentiation of the vertebrate eye
• 1.5.1. The anterior segment
• 1.5.2. The retina and the retinal pigmented epithelium (RPE)
• 1.6. Hedgehog (Hh) signaling and vertebrate eye development
• 1.6.1. Vertebrate Hh signaling transduction
• 1.6.2. The role of Hh in vertebrate optic vesicle patterning
• 1.6.3. The role of Hh during the cellular differentiation of vertebrate eye
• 1.7. Zebrafish as a model for studying eye development
• 1.8. SoxC and eye development
• 1.8.1. Sox Subfamilies in vertebrates
• 1.8.2. SoxC proteins and their known target genes
• 1.8.3. SoxC expression in the developing vertebrate eye
• 1.8.4. Functional studies of SoxC proteins in animal models during eye development
• 1.9. SoxC and human ocular defects
• 1.10. Conclusions and perspective
• 1.11. Rationale, Hypothesis and Specific Aims
• 2. CHAPTER 2: SOX4 REGULATES CHOROID FISSURE CLOSURE BY LIMITING HEDGEHOG SIGNALING DURING OCULAR MORPHOGENESIS
• 2.1. Sox4a and sox4b are expressed in periocular tissues and the developing retina
• 2.2. Knockdown of sox4 causes ocular coloboma
• 2.3. Proximo-distal patterning of the optic vesicle is altered in Sox4-deficient zebrafish
• 2.4. Sox4-deficient retinas display ectopic cell proliferation
• 2.5. Hh signaling is elevated in Sox4-deficient zebrafish
• 2.6. Sox4 negatively regulates expression of Indian Hedgehog b (ihhb)
• 2.7. Bmp7 is a potential intermediate between sox4 and ihhb
• 2.8. Sox4 and sox11 have overlapping functions in regulating choroid fissure closure
• 2.9. Materials and methods
• 2.9.1. Zebrafish strains and maintenance
• 2.9.2. Whole mount in situ hybridization (WISH) and fluorescent in situ hybridization (FISH)
• 2.9.3. Morpholino and mRNA microinjection
• 2.9.4. CRISPR sgRNA and Cas9 mRNA synthesis and injection
• 2.9.6. Immunohistochemistry and TUNEL assay
• 2.9.7. Real-time quantitative RT-PCR
• 2.9.9. SDS PAGE and western blots
• 3. CHAPTER 3: GENERATION AND CHARACTERIZATION OF SOX4A AND SOX4B MUTANT ZEBRAFISH LINES USING CLUSTERED REGULARLY INTERSPACED SHORT PALINDROMIC REPEATS (CRISPR)/ CRISPR-ASSOCIATED-9 (CAS9) SYSTEM
• 3.1. CRISPR/Cas adaptive immunity
• 3.2. Application of CRISPR/Cas9 system in zebrafish genome editing
• 3.3. Generating sox4a and sox4b mutant lines using CRISPR/Cas9 system
• 3.3.1. Single strand guide RNA (sgRNA) design
• 3.3.2. Sox4a and sox4b gene disruption in F0 sgRNA and Cas9 mRNA injected zebrafish
• 3.3.3. Establishment of stable sox4a and sox4b mutant lines
• 3.3.4. Identification of sox4 mutants: molecular defect and predicted effect on mRNA and protein
• 3.4. Characterization of sox4aC2 MZ mutant phenotype
• 3.4.1. Sox4a mRNA was significantly reduced in sox4aC2 MZ mutants
• 3.4.2. High percentage of sox4aC2 MZ mutant eggs were unfertilized due to loss of maternal sox4a
• 3.4.3. Developmental defects in sox4aC2 MZ mutant embryos
• 3.4.4. Microphthalmia is observed in 70% of sox4aC2 MZ mutants
• 3.4.5. Sox4aC2 MZ mutant embryos display increased cell death
• 3.4.6. Hh and BMP signaling are altered in sox4aC2 MZ mutants
• 3.5. Materials and methods
• 3.5.1. Zebrafish strains and maintenance
• 3.5.2. sgRNA and Cas9 mRNA synthesis and injection
• 3.5.3. Genomic DNA extraction
• 3.6. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)
• 3.7. Reverse transcript PCR and real-time quantitative RT-PCR
• 3.8. Acridine orange staining
• 3.9. Immunohistochemistry and cell counts
• 3.10. Whole mount in situ hybridization (WISH)
• 4. CHAPTER 4: LOSS OF SOX4 DELAYS ROD PHOTORECEPTOR DIFFERENTIATION
• 4.1. Persistent retinal neurogenesis in zebrafish
• 4.2. Rod lineage in zebrafish
• 4.3. Rod regeneration in response to rod photoreceptor loss in zebrafish
• 4.4. SoxC and rod photoreceptor neurogenesis
• 4.4.1. Sox4 is upregulated in Tg(XRho:gap43-mCFP) q13 chronic rod degeneration and regeneration transgenic adult zebrafish retina
• 4.4.2. Sox4 knockdown delays embryonic rod photoreceptor neurogenesis
• 4.4.2.1. Sox4 morphants exhibit fewer rod photoreceptors in the embryonic retina
• 4.4.2.2. Rod photoreceptor terminal differentiation is delayed in sox4 morphant retina
• 4.4.3. Sox4aC2 MZ mutants exhibit fewer rods in both embryonic and early juvenile retina
• 4.4.3.1. Comparison of embryonic rod photoreceptors among sox4 CRISPR mutant lines
• 4.4.3.2. The sox4aC2 MZ mutant retina has a specific reduction in the number of rod photoreceptors
• 4.5. Materials and Methods
• 4.5.1. Zebrafish strains and maintenance
• 4.5.2. Fluorescent in situ hybridization (FISH)
• 5. CHAPTER 5: SUMMARY AND DISCUSSION: RESEARCHING TODAY, SEEING TOMORROW
• LIST OF TABLES
• LIST OF FIGURES

Tóm tắt

I. Tổng quan về vai trò của Sox4 trong phát triển võng mạc

Sox4 là một yếu tố phiên mã quan trọng trong sự phát triển của võng mạc. Nó đóng vai trò trong việc điều chỉnh sự đóng khe màng và sự phát triển của các tế bào thần kinh trong mắt. Nghiên cứu cho thấy Sox4 không chỉ ảnh hưởng đến sự sống sót của tế bào mà còn tham gia vào quá trình phân hóa tế bào trong các mô khác nhau. Việc hiểu rõ vai trò của Sox4 có thể giúp phát triển các phương pháp điều trị cho các bệnh lý về mắt.

1.1. Sox4 và sự phát triển của võng mạc

Sox4 có vai trò quan trọng trong sự phát triển của võng mạc, đặc biệt là trong việc điều chỉnh sự phát triển của các tế bào thần kinh. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự thiếu hụt Sox4 có thể dẫn đến các khuyết tật trong sự phát triển của võng mạc.

1.2. Cơ chế hoạt động của Sox4 trong sự phát triển mắt

Sox4 hoạt động như một yếu tố phiên mã, điều chỉnh các gen liên quan đến sự phát triển của mắt. Nó tương tác với các tín hiệu bên ngoài như Hedgehog để điều chỉnh sự đóng khe màng.

II. Thách thức trong nghiên cứu vai trò của Sox4

Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu về Sox4, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong việc hiểu rõ cơ chế hoạt động của nó. Các khuyết tật trong sự phát triển mắt có thể do nhiều yếu tố khác nhau, và việc xác định vai trò cụ thể của Sox4 trong bối cảnh này là rất khó khăn.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến nghiên cứu Sox4

Nghiên cứu về Sox4 gặp khó khăn do sự phức tạp trong các tương tác gen và môi trường. Các yếu tố bên ngoài như dinh dưỡng và môi trường sống cũng có thể ảnh hưởng đến sự biểu hiện của Sox4.

2.2. Khó khăn trong việc xác định vai trò của Sox4

Việc xác định vai trò của Sox4 trong sự phát triển mắt cần nhiều phương pháp nghiên cứu khác nhau, từ mô hình động vật đến phân tích gen. Điều này đòi hỏi sự hợp tác giữa các nhà nghiên cứu trong nhiều lĩnh vực.

III. Phương pháp nghiên cứu vai trò của Sox4 trong phát triển võng mạc

Để nghiên cứu vai trò của Sox4, các nhà khoa học đã sử dụng nhiều phương pháp khác nhau, bao gồm kỹ thuật CRISPR/Cas9 để tạo ra các dòng cá zebrafish đột biến Sox4. Những nghiên cứu này giúp làm sáng tỏ cơ chế mà Sox4 điều chỉnh sự phát triển của võng mạc.

3.1. Sử dụng CRISPR Cas9 trong nghiên cứu Sox4

Kỹ thuật CRISPR/Cas9 cho phép các nhà nghiên cứu tạo ra các dòng cá zebrafish đột biến Sox4, từ đó quan sát các ảnh hưởng của sự thiếu hụt Sox4 đến sự phát triển của võng mạc.

3.2. Phân tích biểu hiện gen trong nghiên cứu Sox4

Phân tích biểu hiện gen giúp xác định các gen mục tiêu mà Sox4 điều chỉnh. Điều này cung cấp thông tin quan trọng về cách Sox4 ảnh hưởng đến sự phát triển của võng mạc.

IV. Kết quả nghiên cứu về vai trò của Sox4 trong phát triển võng mạc

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng Sox4 có vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh sự đóng khe màng và sự phát triển của các tế bào thần kinh trong võng mạc. Sự thiếu hụt Sox4 dẫn đến các khuyết tật nghiêm trọng trong sự phát triển mắt.

4.1. Tác động của Sox4 đến sự đóng khe màng

Sox4 điều chỉnh các tín hiệu Hedgehog, ảnh hưởng đến sự đóng khe màng. Sự thiếu hụt Sox4 dẫn đến sự gia tăng tín hiệu Hedgehog, gây ra các khuyết tật trong sự phát triển mắt.

4.2. Vai trò của Sox4 trong sự phát triển tế bào thần kinh

Sox4 không chỉ ảnh hưởng đến sự đóng khe màng mà còn tham gia vào sự phát triển của các tế bào thần kinh trong võng mạc. Sự thiếu hụt Sox4 dẫn đến sự chậm phát triển của các tế bào thần kinh.

V. Ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu Sox4 trong y học

Nghiên cứu về Sox4 có thể mở ra hướng đi mới trong việc điều trị các bệnh lý về mắt. Việc hiểu rõ vai trò của Sox4 có thể giúp phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả cho các khuyết tật về mắt.

5.1. Tiềm năng điều trị từ nghiên cứu Sox4

Nghiên cứu về Sox4 có thể dẫn đến việc phát triển các liệu pháp gen nhằm điều chỉnh sự biểu hiện của Sox4, từ đó cải thiện sự phát triển của võng mạc.

5.2. Ứng dụng trong điều trị các bệnh lý về mắt

Các phát hiện từ nghiên cứu Sox4 có thể được áp dụng trong điều trị các bệnh lý như coloboma và các khuyết tật khác liên quan đến sự phát triển mắt.

VI. Kết luận và tương lai của nghiên cứu về Sox4

Nghiên cứu về Sox4 vẫn đang tiếp tục phát triển. Việc hiểu rõ hơn về vai trò của Sox4 trong sự phát triển võng mạc có thể giúp mở ra những hướng đi mới trong nghiên cứu và điều trị các bệnh lý về mắt.

6.1. Tương lai của nghiên cứu Sox4

Nghiên cứu về Sox4 sẽ tiếp tục được mở rộng để khám phá các cơ chế phức tạp hơn trong sự phát triển mắt. Các nghiên cứu tiếp theo có thể giúp làm sáng tỏ vai trò của Sox4 trong các bệnh lý khác.

6.2. Hướng đi mới trong điều trị bệnh lý mắt

Việc phát triển các liệu pháp điều trị dựa trên nghiên cứu Sox4 có thể mang lại hy vọng cho những bệnh nhân mắc các khuyết tật về mắt, mở ra cơ hội cho các phương pháp điều trị mới.

Trích đoạn nội dung tài liệu

University of Kentucky UKnowledge Theses and Dissertations--Biology Biology 2016 The Role of Sox4 in Regulating Choroid Fissure Closure and Retinal Neurogenesis Wen Wen University of Kentucky, wen.edu Digital Object Identifier: http://dx.180 Right click to open a feedback form in a new tab to let us know how this document benefits you. Recommended Citation Wen, Wen, "The Role of Sox4 in Regulating Choroid Fissure Closure and Retinal Neurogenesis" (2016). Theses and Dissertations--Biology.edu/biology_etds/35 This Doctoral Dissertation is brought to you for free and open access by the Biology at UKnowledge. It has been accepted for inclusion in Theses and Dissertations--Biology by an authorized administrator of UKnowledge.

For more information, please contact UKnowledge@lsv. STUDENT AGREEMENT: I represent that my thesis or dissertation and abstract are my original work. Proper attribution has been given to all outside sources. I understand that I am solely responsible for obtaining any needed copyright permissions.

I have obtained needed written permission statement(s) from the owner(s) of each third-party copyrighted matter to be included in my work, allowing electronic distribution (if such use is not permitted by the fair use doctrine) which will be submitted to UKnowledge as Additional File. I hereby grant to The University of Kentucky and its agents the irrevocable, non-exclusive, and royalty-free license to archive and make accessible my work in whole or in part in all forms of media, now or hereafter known. I agree that the document mentioned above may be made available immediately for worldwide access unless an embargo applies. I retain all other ownership rights to the copyright of my work.

I also retain the right to use in future works (such as articles or books) all or part of my work. I understand that I am free to register the copyright to my work. REVIEW, APPROVAL AND ACCEPTANCE The document mentioned above has been reviewed and accepted by the student’s advisor, on behalf of the advisory committee, and by the Director of Graduate Studies (DGS), on behalf of the program; we verify that this is the final, approved version of the student’s thesis including all changes required by the advisory committee. The undersigned agree to abide by the statements above.

Wen Wen, Student Dr. Morris, Major Professor Dr. Westneat, Director of Graduate Studies THE ROLE OF SOX4 IN REGULATING CHOROID FISSURE CLOSURE AND RETINAL NEUROGENESIS __________________________ DISSERTATION __________________________ A dissertation submitted in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy in the College of Arts and Sciences at the University of Kentucky By Wen Wen Lexington, Kentucky Director: Ann C. Morris, Associate Professor of Biology Lexington, Kentucky 2016 Copyright © Wen Wen 2016 ABSTRACT OF DISSERTATION THE ROLE OF SOX4 IN REGULATING CHOROID FISSURE CLOSURE AND RETINAL NEUROGENESIS The development of the vertebrate eye is tightly controlled by precise genetic regulations.

From a single ocular primordium to bilateral eyes with complex structures and cell types, it requires intensive proliferation and migration for cells in both the ectoderm and mesoderm to accomplish ocular morphogenesis, and during this process cell differentiation and interaction takes place to establish the complex composition of ocular cell types and cellular connections. Genetic defects can lead to severe abnormalities in eye morphogenesis and cell differentiation during ocular development. A tremendous amount of work has been done to identify both intrinsic and extrinsic factors that regulate ocular development. However, much more work is needed to fully understand this complex process.

Sox4 is known as a transcription activator that regulates cell survival and differentiation in multiple embryonic tissues during development. Evidence of its requirement during ocular development has recently emerged, but the mechanism by which Sox4 regulates ocular development is far from elucidated. Chapter 1 of this dissertation provides an overview of different stages in embryonic eye development and known genetic interactions during each stage. It also reviews recent knowledge about SoxC proteins and their roles in ocular development.

Chapter 2 presents data characterizing the expression profile of the zebrafish sox4 co-orthologs, sox4a and sox4b, in the developing eye. Additionally, it presents data from morpholino-mediated sox4 knockdown in zebrafish, which indicate that Sox4 deficiency leads to defects in choroid fissure closure through elevation in the Hedgehog (Hh) signaling pathway. Sox4 knockdown causes upregulation of the Hh ligand indian hedgehog b (ihhb), which alters the proximal-distal boundary of the optic vesicle and inhibits choroid fissure closure. Chapter 3 presents data reporting the generation of sox4 mutant zebrafish lines using the CRISPR/Cas9 genome editing system.

Characterization of one sox4a maternal zygotic (MZ) mutant line confirms Sox4’s role in negative regulation of Hh signaling and reveals new evidence that maternal and zygotic sox4 are both critical for ocular development. Chapter 4 presents data demonstrating that sox4 is required for rod photoreceptor neurogenesis. Rod photoreceptor terminal differentiation is delayed in both sox4 morphants and sox4 CRISPR mutants, while rod progenitor and precursor cells are properly specified. In Chapter 5, the roles of Sox4 in regulating ocular development are summarized based on the results, and implications of the results are discussed to expand our understanding of the genetic regulation of ocular morphogenesis and retinal neurogenesis.

KEYWORDS: Sox4, Eye development, Coloboma, Hedgehog signaling, Rod photoreceptor, CRISPR/Cas9 Wen Wen Student’s Signature April 26, 2016 Date THE ROLE OF SOX4 IN REGULATING CHOROID FISSURE CLOSURE AND RETINAL NEUROGENESIS By Wen Wen Ann C. Morris Director of Dissertation David F. Westneat Director of Graduate Studies April 26, 2016 Date To Mama, Baba, and Qi ACKNOWLEDGEMENTS My six years of graduate study was like an adventure in the science ocean that was full of excitement and challenge. I would like to give my sincere thanks to many who were like the lighthouse that guided my direction and gave me tremendous amount of supports throughout my voyage.

First and foremost I would like to convey my deepest gratitude to my doctoral advisor Dr. She is my role model in any aspects of science and life. She sets an incredible example as an excellent scientist, mentor and friend that influences me every day. Ann, thank you for leading me into the fascinating world of zebrafish eye development, thank you for teaching me how to do science, talk science, write science and enjoy science, thank you for encouraging me to explore science freely with your endless supports and guidance, and thank you for walking me through the ups and downs during both my graduate study and personal life.

Your enthusiastic attitude towards life and science is also deeply rooted in my heart that made me believe that one day I can also become a great scientist like you. No word can express my appreciations to you; all in all I would like to say that you are the one true Queen in the seven kingdoms of my scientific world. I would also like to express my gratitude to my doctoral committee members. Vinnie, thank you for sharing your wisdom and broad knowledge with me and thanks for all the things you have done for us from writing great recommendation letters, raising our stipend to holding annual Christmas parties at your house.

Thanks for holding everybody from Biology together as a big family. Bruce, thank you very much for encouraging me and give me insightful suggestions throughout my graduate training. Pete, thank you very much not only for teaching me how to do critical thinking, but also how to pass my passion to science and research to the younger generation through teaching. I will carry your philosophy of learning and teaching for the rest of my scientific career.

JJ, thank you very much for providing me so much priceless advices toward my graduate study and career development. I would also like to thank all the faculties from Biology. I am so grateful for your patience with my millions of questions and generosity for sharing your lab equipment whenever I need to use. Also, I want to thank Dr.

Downie, my outside defense committee member. Thank you so much for editing my dissertation and giving me valuable suggestions to make it better. I would like to thank all past and present Morris lab students. Lakshmi, Marie, Stephen, Hannah, CC, and Becky, thank you all for your friendship and support.

You made my daily life in iii the lab full of joyful memories! You are like my sisters and brothers in the lab. I cannot forget all the ‘crazy’ things and all the good science we have done together. Thanks very much for sharing your scientific ideas and encouragement with me. Sara, thank you so much for taking care of our fishroom and lab business.

You are the most important core of our daily lab business. None of our research will be done smoothly without your hard work and great support! The same appreciation to Tony, our previous ‘fish man’. Also, thanks to my wonderful undergraduate trainee Joanna and Abi. I am so proud of you two.

Your bright and hardworking minds will bring you success whatever future careers you choose. I also offer my sincere gratitude to the members of the academic staff for their support and help. Jacqueline Burke, Jaclyn Gibson, Jacqueline Lee, Michael Adams, Seth Taylor, George White, Beverly Taulbee, Monica Decker, Cheryl Edwards, thank you so much for keeping our department running smoothly so that we students could only focus on our study and research. You make our department a warm family to everyone.

The degree will benefit me for my career, but the friendship I earn will be with me for my entire life. I would like to thank all my friends who I will always love and remember. Qian, Min, Ye, Lina, Lingfeng, Ting, Wenhui, Houfu, Gang, Zheng, Hui, Yuechen, Qingchao, Yuting, Weikai, Dangdang, Shang, Diao, Yifeng, Bingwei, Chanung, Swagata, Deep, thank you for being there for me whenever I need you. I also want to give special thanks to the Nannan family.

They gave me tremendous amount of love and support. They made it home for me ever since the first night I landed in Lexington. Thank you for all the things you have done for me! Finally, I would like to thank my family: mom, dad and my husband Qi. My dissertation is dedicated for them.

Even the most beautiful word cannot express my love to them. Their love and encouragement always accompany with me and make me who I am today. iv TABLE OF CONTENTS ACKNOWLEDGEMENTS. iii TABLE OF CONTENTS.

v LIST OF TABLES. ix LIST OF FIGURES. x CHAPTER 1: KEEPING AN EYE ON SOXC PROTEINS: VERTEBRATE EYE DEVELOPMENT AND SOXC TRANSCRIPTION FACTORS .3 Origin and morphogenesis of the vertebrate eye.1 Optic primordium specification .2 Eye field segregation.3 Optic cup and optic stalk formation .4 Cellular differentiation of the vertebrate eye .1 The anterior segment.2 The retina and the retinal pigmented epithelium (RPE).6 Hedgehog (Hh) signaling and vertebrate eye development .1 Vertebrate Hh signaling transduction .2 The role of Hh in vertebrate optic vesicle patterning .3 The role of Hh during the cellular differentiation of vertebrate eye .7 Zebrafish as a model for studying eye development.8 SoxC and eye development .1 Sox Subfamilies in vertebrates.2 SoxC proteins and their known target genes .3 SoxC expression in the developing vertebrate eye .4 Functional studies of SoxC proteins in animal models during eye development .9 SoxC and human ocular defects .10 Conclusions and perspective .11 Rationale, Hypothesis and Specific Aims. 37 v CHAPTER 2: SOX4 REGULATES CHOROID FISSURE CLOSURE BY LIMITING HEDGEHOG SIGNALING DURING OCULAR MORPHOGENESIS .1 Sox4a and sox4b are expressed in periocular tissues and the developing retina .2 Knockdown of sox4 causes ocular coloboma .3 Proximo-distal patterning of the optic vesicle is altered in Sox4-deficient zebrafish.4 Sox4-deficient retinas display ectopic cell proliferation.5 Hh signaling is elevated in Sox4-deficient zebrafish .6 Sox4 negatively regulates expression of Indian Hedgehog b (ihhb).7 Bmp7 is a potential intermediate between sox4 and ihhb .8 Sox4 and sox11 have overlapping functions in regulating choroid fissure closure .5 Materials and methods .1 Zebrafish strains and maintenance .