Vai trò của Sox4 trong việc điều chỉnh sự đóng khe màng và phát triển võng mạc

Sox4 là một yếu tố phiên mã quan trọng trong sự phát triển của võng mạc. 210 trang · University of Kentucky · 2016.

• Tác giả: Wen Wen
• Người hướng dẫn: Dr. Ann C. Morris, Associate Professor of Biology
• Trường học: University of Kentucky
• Chuyên ngành: Biology
• Đề tài: Vai Trò Của Sox4 Trong Việc Điều Chỉnh Sự Đóng Khe Màng Và Phát Triển Võng Mạc
• Loại tài liệu: Doctoral Dissertation
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Lexington

Mục lục chi tiết

• ACKNOWLEDGEMENTS
• ABSTRACT OF DISSERTATION
• TABLE OF CONTENTS
• 1. CHAPTER 1: KEEPING AN EYE ON SOXC PROTEINS: VERTEBRATE EYE DEVELOPMENT AND SOXC TRANSCRIPTION FACTORS
• 1.1. Origin and morphogenesis of the vertebrate eye
• 1.2. Optic primordium specification
• 1.3. Eye field segregation
• 1.4. Optic cup and optic stalk formation
• 1.5. Cellular differentiation of the vertebrate eye
• 1.5.1. The anterior segment
• 1.5.2. The retina and the retinal pigmented epithelium (RPE)
• 1.6. Hedgehog (Hh) signaling and vertebrate eye development
• 1.6.1. Vertebrate Hh signaling transduction
• 1.6.2. The role of Hh in vertebrate optic vesicle patterning
• 1.6.3. The role of Hh during the cellular differentiation of vertebrate eye
• 1.7. Zebrafish as a model for studying eye development
• 1.8. SoxC and eye development
• 1.8.1. Sox Subfamilies in vertebrates
• 1.8.2. SoxC proteins and their known target genes
• 1.8.3. SoxC expression in the developing vertebrate eye
• 1.8.4. Functional studies of SoxC proteins in animal models during eye development
• 1.9. SoxC and human ocular defects
• 1.10. Conclusions and perspective
• 1.11. Rationale, Hypothesis and Specific Aims
• 2. CHAPTER 2: SOX4 REGULATES CHOROID FISSURE CLOSURE BY LIMITING HEDGEHOG SIGNALING DURING OCULAR MORPHOGENESIS
• 2.1. Sox4a and sox4b are expressed in periocular tissues and the developing retina
• 2.2. Knockdown of sox4 causes ocular coloboma
• 2.3. Proximo-distal patterning of the optic vesicle is altered in Sox4-deficient zebrafish
• 2.4. Sox4-deficient retinas display ectopic cell proliferation
• 2.5. Hh signaling is elevated in Sox4-deficient zebrafish
• 2.6. Sox4 negatively regulates expression of Indian Hedgehog b (ihhb)
• 2.7. Bmp7 is a potential intermediate between sox4 and ihhb
• 2.8. Sox4 and sox11 have overlapping functions in regulating choroid fissure closure
• 2.9. Materials and methods
• 2.9.1. Zebrafish strains and maintenance
• 2.9.2. Whole mount in situ hybridization (WISH) and fluorescent in situ hybridization (FISH)
• 2.9.3. Morpholino and mRNA microinjection
• 2.9.4. CRISPR sgRNA and Cas9 mRNA synthesis and injection
• 2.9.6. Immunohistochemistry and TUNEL assay
• 2.9.7. Real-time quantitative RT-PCR
• 2.9.9. SDS PAGE and western blots
• 3. CHAPTER 3: GENERATION AND CHARACTERIZATION OF SOX4A AND SOX4B MUTANT ZEBRAFISH LINES USING CLUSTERED REGULARLY INTERSPACED SHORT PALINDROMIC REPEATS (CRISPR)/ CRISPR-ASSOCIATED-9 (CAS9) SYSTEM
• 3.1. CRISPR/Cas adaptive immunity
• 3.2. Application of CRISPR/Cas9 system in zebrafish genome editing
• 3.3. Generating sox4a and sox4b mutant lines using CRISPR/Cas9 system
• 3.3.1. Single strand guide RNA (sgRNA) design
• 3.3.2. Sox4a and sox4b gene disruption in F0 sgRNA and Cas9 mRNA injected zebrafish
• 3.3.3. Establishment of stable sox4a and sox4b mutant lines
• 3.3.4. Identification of sox4 mutants: molecular defect and predicted effect on mRNA and protein
• 3.4. Characterization of sox4aC2 MZ mutant phenotype
• 3.4.1. Sox4a mRNA was significantly reduced in sox4aC2 MZ mutants
• 3.4.2. High percentage of sox4aC2 MZ mutant eggs were unfertilized due to loss of maternal sox4a
• 3.4.3. Developmental defects in sox4aC2 MZ mutant embryos
• 3.4.4. Microphthalmia is observed in 70% of sox4aC2 MZ mutants
• 3.4.5. Sox4aC2 MZ mutant embryos display increased cell death
• 3.4.6. Hh and BMP signaling are altered in sox4aC2 MZ mutants
• 3.5. Materials and methods
• 3.5.1. Zebrafish strains and maintenance
• 3.5.2. sgRNA and Cas9 mRNA synthesis and injection
• 3.5.3. Genomic DNA extraction
• 3.6. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)
• 3.7. Reverse transcript PCR and real-time quantitative RT-PCR
• 3.8. Acridine orange staining
• 3.9. Immunohistochemistry and cell counts
• 3.10. Whole mount in situ hybridization (WISH)
• 4. CHAPTER 4: LOSS OF SOX4 DELAYS ROD PHOTORECEPTOR DIFFERENTIATION
• 4.1. Persistent retinal neurogenesis in zebrafish
• 4.2. Rod lineage in zebrafish
• 4.3. Rod regeneration in response to rod photoreceptor loss in zebrafish
• 4.4. SoxC and rod photoreceptor neurogenesis
• 4.4.1. Sox4 is upregulated in Tg(XRho:gap43-mCFP) q13 chronic rod degeneration and regeneration transgenic adult zebrafish retina
• 4.4.2. Sox4 knockdown delays embryonic rod photoreceptor neurogenesis
• 4.4.2.1. Sox4 morphants exhibit fewer rod photoreceptors in the embryonic retina
• 4.4.2.2. Rod photoreceptor terminal differentiation is delayed in sox4 morphant retina
• 4.4.3. Sox4aC2 MZ mutants exhibit fewer rods in both embryonic and early juvenile retina
• 4.4.3.1. Comparison of embryonic rod photoreceptors among sox4 CRISPR mutant lines
• 4.4.3.2. The sox4aC2 MZ mutant retina has a specific reduction in the number of rod photoreceptors
• 4.5. Materials and Methods
• 4.5.1. Zebrafish strains and maintenance
• 4.5.2. Fluorescent in situ hybridization (FISH)
• 5. CHAPTER 5: SUMMARY AND DISCUSSION: RESEARCHING TODAY, SEEING TOMORROW
• LIST OF TABLES
• LIST OF FIGURES

Tóm tắt

I. Tổng quan về vai trò của Sox4 trong phát triển võng mạc

Sox4 là một yếu tố phiên mã quan trọng trong sự phát triển của võng mạc. Nó đóng vai trò trong việc điều chỉnh sự đóng khe màng và sự phát triển của các tế bào thần kinh trong mắt. Nghiên cứu cho thấy Sox4 không chỉ ảnh hưởng đến sự sống sót của tế bào mà còn tham gia vào quá trình phân hóa tế bào trong các mô khác nhau. Việc hiểu rõ vai trò của Sox4 có thể giúp phát triển các phương pháp điều trị cho các bệnh lý về mắt.

1.1. Sox4 và sự phát triển của võng mạc

Sox4 có vai trò quan trọng trong sự phát triển của võng mạc, đặc biệt là trong việc điều chỉnh sự phát triển của các tế bào thần kinh. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự thiếu hụt Sox4 có thể dẫn đến các khuyết tật trong sự phát triển của võng mạc.

1.2. Cơ chế hoạt động của Sox4 trong sự phát triển mắt

Sox4 hoạt động như một yếu tố phiên mã, điều chỉnh các gen liên quan đến sự phát triển của mắt. Nó tương tác với các tín hiệu bên ngoài như Hedgehog để điều chỉnh sự đóng khe màng.

II. Thách thức trong nghiên cứu vai trò của Sox4

Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu về Sox4, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong việc hiểu rõ cơ chế hoạt động của nó. Các khuyết tật trong sự phát triển mắt có thể do nhiều yếu tố khác nhau, và việc xác định vai trò cụ thể của Sox4 trong bối cảnh này là rất khó khăn.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến nghiên cứu Sox4

Nghiên cứu về Sox4 gặp khó khăn do sự phức tạp trong các tương tác gen và môi trường. Các yếu tố bên ngoài như dinh dưỡng và môi trường sống cũng có thể ảnh hưởng đến sự biểu hiện của Sox4.

2.2. Khó khăn trong việc xác định vai trò của Sox4

Việc xác định vai trò của Sox4 trong sự phát triển mắt cần nhiều phương pháp nghiên cứu khác nhau, từ mô hình động vật đến phân tích gen. Điều này đòi hỏi sự hợp tác giữa các nhà nghiên cứu trong nhiều lĩnh vực.

III. Phương pháp nghiên cứu vai trò của Sox4 trong phát triển võng mạc

Để nghiên cứu vai trò của Sox4, các nhà khoa học đã sử dụng nhiều phương pháp khác nhau, bao gồm kỹ thuật CRISPR/Cas9 để tạo ra các dòng cá zebrafish đột biến Sox4. Những nghiên cứu này giúp làm sáng tỏ cơ chế mà Sox4 điều chỉnh sự phát triển của võng mạc.

3.1. Sử dụng CRISPR Cas9 trong nghiên cứu Sox4

Kỹ thuật CRISPR/Cas9 cho phép các nhà nghiên cứu tạo ra các dòng cá zebrafish đột biến Sox4, từ đó quan sát các ảnh hưởng của sự thiếu hụt Sox4 đến sự phát triển của võng mạc.

3.2. Phân tích biểu hiện gen trong nghiên cứu Sox4

Phân tích biểu hiện gen giúp xác định các gen mục tiêu mà Sox4 điều chỉnh. Điều này cung cấp thông tin quan trọng về cách Sox4 ảnh hưởng đến sự phát triển của võng mạc.

IV. Kết quả nghiên cứu về vai trò của Sox4 trong phát triển võng mạc

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng Sox4 có vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh sự đóng khe màng và sự phát triển của các tế bào thần kinh trong võng mạc. Sự thiếu hụt Sox4 dẫn đến các khuyết tật nghiêm trọng trong sự phát triển mắt.

4.1. Tác động của Sox4 đến sự đóng khe màng

Sox4 điều chỉnh các tín hiệu Hedgehog, ảnh hưởng đến sự đóng khe màng. Sự thiếu hụt Sox4 dẫn đến sự gia tăng tín hiệu Hedgehog, gây ra các khuyết tật trong sự phát triển mắt.

4.2. Vai trò của Sox4 trong sự phát triển tế bào thần kinh

Sox4 không chỉ ảnh hưởng đến sự đóng khe màng mà còn tham gia vào sự phát triển của các tế bào thần kinh trong võng mạc. Sự thiếu hụt Sox4 dẫn đến sự chậm phát triển của các tế bào thần kinh.

V. Ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu Sox4 trong y học

Nghiên cứu về Sox4 có thể mở ra hướng đi mới trong việc điều trị các bệnh lý về mắt. Việc hiểu rõ vai trò của Sox4 có thể giúp phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả cho các khuyết tật về mắt.

5.1. Tiềm năng điều trị từ nghiên cứu Sox4

Nghiên cứu về Sox4 có thể dẫn đến việc phát triển các liệu pháp gen nhằm điều chỉnh sự biểu hiện của Sox4, từ đó cải thiện sự phát triển của võng mạc.

5.2. Ứng dụng trong điều trị các bệnh lý về mắt

Các phát hiện từ nghiên cứu Sox4 có thể được áp dụng trong điều trị các bệnh lý như coloboma và các khuyết tật khác liên quan đến sự phát triển mắt.

VI. Kết luận và tương lai của nghiên cứu về Sox4

Nghiên cứu về Sox4 vẫn đang tiếp tục phát triển. Việc hiểu rõ hơn về vai trò của Sox4 trong sự phát triển võng mạc có thể giúp mở ra những hướng đi mới trong nghiên cứu và điều trị các bệnh lý về mắt.

6.1. Tương lai của nghiên cứu Sox4

Nghiên cứu về Sox4 sẽ tiếp tục được mở rộng để khám phá các cơ chế phức tạp hơn trong sự phát triển mắt. Các nghiên cứu tiếp theo có thể giúp làm sáng tỏ vai trò của Sox4 trong các bệnh lý khác.

6.2. Hướng đi mới trong điều trị bệnh lý mắt

Việc phát triển các liệu pháp điều trị dựa trên nghiên cứu Sox4 có thể mang lại hy vọng cho những bệnh nhân mắc các khuyết tật về mắt, mở ra cơ hội cho các phương pháp điều trị mới.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Sự phát triển của mắt ở động vật có xương sống là một quá trình được điều hòa chặt chẽ bởi các tín hiệu di truyền chính xác. Từ một mầm mắt đơn lẻ ban đầu ở tấm thần kinh trước, phôi hình thành nên cấu trúc mắt hai bên đối xứng với tổ chức tế bào và mạng lưới chức năng phức tạp. Quá trình này đòi hỏi sự phân chia, di chuyển và tương tác tế bào liên tục giữa các lớp ngoại bì và trung bì nhằm hoàn thiện quá trình tạo hình nhãn cầu (ocular morphogenesis), tiếp nối bởi sự biệt hóa của các dòng tế bào thần kinh võng mạc (retinal neurogenesis). Những khiếm khuyết trong các con đường truyền tín hiệu hoặc các yếu tố phiên mã nội tại có thể dẫn đến các dị tật bẩm sinh nghiêm trọng như mắt nhỏ (microphthalmia), không có mắt (anophthalmia) hoặc khuyết thị giác (ocular coloboma). Khuyết thị giác là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây mù lòa bẩm sinh ở trẻ em, chiếm khoảng 5–10% các ca mù lòa ở trẻ em và ảnh hưởng đến khoảng 7,5 trên 10.000 trẻ sinh sống trên toàn thế giới. Dị tật này xuất phát từ việc khe thị giác (choroid fissure) không thể đóng kín hoàn toàn trong quá trình phát triển phôi.

Mặc dù nhiều yếu tố ngoại bào và nội bào đã được xác định, cơ chế phân tử điều hòa quá trình đóng khe thị giác và sự biệt hóa tế bào cảm quang vẫn còn nhiều khoảng trống. Yếu tố phiên mã Sox4 thuộc phân họ SoxC (nhóm các protein mang miền liên kết DNA HMG-box) được biết đến với vai trò kích hoạt phiên mã, điều hòa sự sống sót và biệt hóa tế bào ở nhiều mô phôi. Tuy nhiên, cơ chế tác động của Sox4 trong quá trình phát triển mắt ở động vật có xương sống chưa được làm sáng tỏ đầy đủ.

Luận án của nghiên cứu sinh Wen Wen tập trung giải quyết các mục tiêu và giả thuyết nghiên cứu cụ thể sau:

1. Xác định hồ sơ biểu hiện theo không gian và thời gian của hai gen đồng chuyển mã (co-orthologs) sox4a và sox4b trong các mô quanh mắt và võng mạc đang phát triển ở cá ngựa vằn (Danio rerio).
2. Kiểm tra giả thuyết rằng Sox4 đóng vai trò thiết yếu trong việc đóng khe thị giác thông qua việc điều hòa tiêu cực con đường truyền tín hiệu Hedgehog (Hh).
3. Ứng dụng hệ thống chỉnh sửa bộ gen CRISPR/Cas9 để tạo lập các dòng cá ngựa vằn đột biến sox4a và sox4b, từ đó phân tích các khiếm khuyết phát triển do mất nguồn gen mẹ (maternal) và hợp tử (zygotic).
4. Khảo sát vai trò của Sox4 đối với quá trình sinh thần kinh võng mạc, đặc biệt là quá trình biệt hóa của tế bào cảm quang que (rod photoreceptor).

Đối tượng nghiên cứu của luận án là mô hình cá ngựa vằn (Danio rerio), bao gồm các dòng hoang dã, dòng chuyển gen phóng xạ huỳnh quang Tg(XRho:gap43-mCFP)q13, XOPS:GFP, và các dòng đột biến mất chức năng được tạo ra bằng kỹ thuật can thiệp gen. Phạm vi nghiên cứu bao gồm các giai đoạn phát triển phôi thai từ 3 giờ sau thụ tinh (hpf), 12 hpf, 16 hpf, 24 hpf, 32 hpf, 48–60 hpf, 72 hpf, 96 hpf cho đến giai đoạn cá non và cá trưởng thành, tập trung vào cấu trúc mầm mắt, túi thị giác, biểu mô sắc tố võng mạc (RPE), tế bào trung mô quanh mắt (POM), các lớp tế bào võng mạc và vùng rìa thể mi (CMZ).

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã tổng thuật toàn diện các nghiên cứu nền tảng về cơ chế sinh học phát triển mắt và mạng lưới phân tử điều hòa ở động vật có xương sống:

• Cơ chế xác định và phân tách trường mắt: Adelmann (1936), Li và cộng sự (1997), Pera & Kessel (1997) chứng minh trung nội bì trước dây sống (prechordal mesendoderm) tiết ra các tín hiệu Nodal/TGF-β và Hh thiết yếu cho sự phân tách trường mắt; các công trình của Barth và cộng sự (1999), Zuber (2010), Cavodeassi và cộng sự phân tích vai trò đối kháng của BMP (Chordin, Noggin, Follistatin, Cerberus) và sự phối hợp giữa tín hiệu Wnt kinh điển (Wnt8/Fz8) với Wnt không kinh điển (Wnt11/Fz5). Các yếu tố phiên mã trường mắt (EFTFs) gồm otx2, rx/rax, pax6, six3/six6, lhx2, ET/tbx3, hesx1, nr2e1 (Chow & Lang, 2001; Graw, 2010; Shaham và cộng sự, 2012; Zuber và cộng sự, 2003) có sự tương đồng tiến hóa sâu sắc với các gen quy định mắt ở ruồi giấm Drosophila như toy, ey, so, optix (Quiring và cộng sự, 1994; Loosli và cộng sự, 1998).
• Con đường truyền tín hiệu Hedgehog (Hh) trong tạo hình mắt: Nghiên cứu của Chiang và cộng sự (1996), Ekker và cộng sự (1995), Macdonald và cộng sự (1995), Take-uchi (2003) chỉ ra tín hiệu Hh từ đường giữa bụng quy định ranh giới biểu hiện giữa pax2 (ở cuống thị giác/phần gần) và pax6 (ở túi thị giác/phần xa), cũng như cảm ứng biểu hiện các gen vax ở phần bụng nhãn cầu. Trong quá trình sinh thần kinh võng mạc, các nghiên cứu của Neumann (2000), Kay và cộng sự (2001, mô hình đột biến ath5/lakritz), Zhang & Yang (2001a), Stenkamp và cộng sự (2002, 2003) chứng minh Hh điều phối các đợt biệt hóa tế bào hạch võng mạc (RGC) và tế bào cảm quang.
• Mạng lưới gen gây dị tật khuyết thị giác (Coloboma Gene Network - CGN): Tổng hợp bởi Gregory-Evans và cộng sự (2004, 2011), Schimmenti và cộng sự (2003), Lee & Gross (2007) cho thấy khuyết thị giác liên quan đến các đột biến ở các gen SHH, PAX2, VAX1/2, PTCH1 (dòng đột biến blowout/blw ở cá ngựa vằn), các phân tử chất nền ngoại bào và kết dính tế bào như N-cadherin (pac mutant), laminin beta 1 (lamb1), laminin gamma 1 (lamc1), α-catenin (Chen và cộng sự, 2012).
• Đặc tính sinh học và chức năng của nhóm yếu tố phiên mã SoxC: Nhóm SoxC gồm ba thành viên không chứa intron là SOX4, SOX11, SOX12 (Penzo-Mendez, 2010; Bowles và cộng sự, 2000; Schepers và cộng sự, 2002). Các mục tiêu phiên mã đã biết bao gồm Tubb3 (Bergsland và cộng sự, 2006), Tead2 (Bhattaram và cộng sự, 2010), CD2 (Wotton và cộng sự, 1999), Nestin khi phối hợp với Brn1/Brn2 (Tanaka và cộng sự, 2004), và tương tác acetyl hóa bảo vệ p53 (Pan và cộng sự, 2009). Các nghiên cứu trên mô hình chuột của Dy và cộng sự (2008), Sock và cộng sự (2004), Wurm và cộng sự (2008), Jiang và cộng sự (2013b), Usui và cộng sự (2013b) cho thấy sự thiếu hụt SoxC dẫn đến chết phôi do dị tật tim, đồng thời gây tật Peter's anomaly, mắt nhỏ, khuyết thị giác và suy giảm tế bào RGC. Ở cá ngựa vằn và ếch Xenopus, sox4 và sox11 biểu hiện liên tục tại vùng CMZ và tham gia vào quá trình biệt hóa RGC và thể thủy tinh (Cizelsky và cộng sự, 2013; Pillai-Kastoori và cộng sự, 2014; Morris và cộng sự, 2011).

Khoảng trống nghiên cứu: Trước luận án này, mối liên hệ phân tử trực tiếp giữa Sox4 và các con đường truyền tín hiệu hình thái học mắt (đặc biệt là con đường Hh và BMP) trong việc kiểm soát sự đóng khe thị giác chưa từng được chứng minh. Đồng thời, ảnh hưởng của sự mất chức năng hoàn toàn sox4 (bao gồm nguồn gốc gen mẹ và hợp tử) lên sự phát triển của các dòng tế bào thụ cảm ánh sáng que in vivo vẫn còn là một vấn đề chưa có lời giải rõ ràng.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

Luận án dựa trên lý thuyết điều hòa phiên mã và sinh học phát triển hệ thần kinh - giác quan ở động vật có xương sống. Cấu trúc protein Sox4 gồm hai miền chức năng chính: miền HMG box ở đầu N chịu trách nhiệm liên kết đặc hiệu vào rãnh nhỏ của chuỗi xoắn kép DNA tại chuỗi nhận diện 5'-(A/T)(A/T)CAA(A/T)G-3', và miền hoạt hóa phiên mã (TAD) ở đầu C. Khung phân tích tập trung vào chuỗi tương tác phân tử: Sox4 kiểm soát mức độ hoạt động của các phối tử Hedgehog, qua đó thiết lập ranh giới biểu hiện của các gen xác định vị trí (pax2, pax6, vax2) và các protein chất nền ngoại bào (laminin) tại khe thị giác; đồng thời Sox4 điều biến sự chuyển tiếp của tế bào tiền thân que sang giai đoạn biệt hóa tận cùng.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Luận án kết hợp các phương pháp sinh học phân tử, di truyền học chức năng và phân tích hình thái tế bào:

1. Can thiệp biểu hiện gen:
   • Knockdown bằng Morpholino (MO): Sử dụng các đoạn oligo antisense biến tính đặc hiệu nhằm ức chế dịch mã hoặc can thiệp vị trí ghép nối exon (splice-blocking) của sox4a, sox4b, và sox11.
   • Biểu hiện quá mức (Overexpression): Vi tiêm in vitro tổng hợp mRNA của sox4 vào hợp tử cá ngựa vằn giai đoạn 1–2 tế bào.
   • Chỉnh sửa bộ gen bằng CRISPR/Cas9: Thiết kế các đoạn RNA dẫn đường đơn (sgRNA) đặc hiệu nhắm vào các vị trí trên exon của sox4a và sox4b, đồng tiêm cùng Cas9 mRNA vào phôi để tạo các đột biến mất đoạn/thay đổi khung đọc mã (InDel).
2. Kỹ thuật sinh học phân tử và phân tích di truyền:
   • Chiết tách DNA bộ gen từ phôi đơn và cá thể trưởng thành.
   • Phân tích đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (RFLP) và giải trình tự Sanger để sàng lọc kiểu gen đột biến ở thế hệ F0, F1, F2 và F3.
   • Bán định lượng RT-PCR và RT-PCR định lượng thời gian thực (qRT-PCR) nhằm đo lường mức độ biểu hiện tương đối của các bản phiên mã mục tiêu.
   • Điện di protein biến tính SDS-PAGE và phân tích Western blot.
3. Phân tích mô học, biểu hiện không gian và hình ảnh:
   • Lai tại chỗ toàn phôi (WISH) với các mẫu dò RNA gắn digoxigenin và lai huỳnh quang tại chỗ (FISH).
   • Nhuộm hóa mô miễn dịch (IHC) trên lát cắt đông lạnh sử dụng các kháng thể đặc hiệu tế bào (Zpr-1 cho tế bào nón đôi, Zpr-3 và 4C12 cho tế bào que, HuC/D cho tế bào hạch và amacrine, Zrf-1 cho tế bào Müller glia, anti-PH3 phát hiện tế bào đang phân chia, anti-Laminin kiểm tra màng đáy khe thị giác).
   • Đánh giá tế bào chết theo chương trình bằng nhuộm Acridine Orange sống và thử nghiệm TUNEL.
   • Kỹ thuật đếm tế bào định lượng và phân tích thống kê hình ảnh hiển vi huỳnh quang và đồng tiêu (confocal microscopy).

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Keeping an Eye on SoxC Proteins: Vertebrate Eye Development and SoxC Transcription Factors

Chương 1 cung cấp cái nhìn tổng quan có hệ thống về các giai đoạn phát triển mắt ở động vật có xương sống, cấu trúc phân loại của họ gen Sox và vị trí của các protein nhóm SoxC. Tác giả phân tích chi tiết tiến trình biến đổi hình thái từ tấm thần kinh trước (12 hpf ở cá ngựa vằn), sự tách đôi trường mắt, hình thành túi thị giác, sự uốn nếp tạo cốc thị giác hai lớp (24 hpf) và quá trình đóng khe thị giác (hoàn tất ở 48–60 hpf).

Chương này tổng kết vị trí biểu hiện của các thành viên SoxC qua các nghiên cứu đối chiếu giữa động vật có vú, chim, ếch và cá ngựa vằn (Bảng 1). Tại võng mạc, các gen SoxC biểu hiện khởi đầu tại những tế bào tiền thân chuẩn bị thoát khỏi chu kỳ tế bào để biệt hóa thành RGC, sau đó lan sang lớp nhân trong (INL). Ở cá ngựa vằn và ếch, sox4 và sox11 duy trì biểu hiện suốt đời tại vùng tế bào gốc CMZ. Đồng thời, chương này đặt nền móng lý thuyết về mối liên hệ tiềm tàng giữa đột biến SoxC và các bệnh lý nhãn khoa bẩm sinh ở người như hội chứng CHARGE (đột biến CHD7).

Vùng giải phẫu mô mắt	sox4	sox11	sox12
Biểu mô sắc tố võng mạc (RPE)	Có biểu hiện (chuột, cá ngựa vằn)	Không biểu hiện / biểu hiện yếu	Không mô tả rõ
Lớp tế bào hạch (GCL)	Biểu hiện mạnh trong quá trình phát triển	Biểu hiện mạnh (chuột, ếch, cá)	Biểu hiện mức độ thấp
Lớp nhân trong (INL)	Biểu hiện ở tế bào amacrine non	Biểu hiện ở tế bào amacrine non	Biểu hiện yếu
Vùng rìa thể mi (CMZ)	Duy trì liên tục ở cá ngựa vằn, ếch	Duy trì liên tục ở cá ngựa vằn, ếch	Không mô tả rõ
Thể thủy tinh (Lens)	Biểu hiện yếu ở túi thể thủy tinh	Biểu hiện mạnh ở bọng thể thủy tinh	Biểu hiện yếu
Trung mô quanh mắt (POM)	Có biểu hiện	Có biểu hiện	Biểu hiện yếu

Chương 2: Sox4 Regulates Choroid Fissure Closure by Limiting Hedgehog Signaling During Ocular Morphogenesis

Chương 2 trình bày các phát hiện thực nghiệm về vai trò của Sox4 trong quá trình đóng khe thị giác:

• Đặc điểm biểu hiện: Cả hai gen sox4a và sox4b đều biểu hiện tại các mô quanh mắt, biểu mô sắc tố võng mạc và các tế bào võng mạc đang phân chia trong suốt quá trình phát triển phôi sớm.
• Hình thành dị tật khuyết thị giác khi ức chế sox4: Knockdown sox4a hoặc sox4b bằng Morpholino (sox4-MO) dẫn đến kiểu hình khuyết thị giác rõ rệt với việc khe thị giác mở rộng và không đóng kín ở thời điểm 48–72 hpf. Sự tồn dư của kháng nguyên Laminin tại khe thị giác ở các phôi morphant chứng minh màng đáy không bị tiêu biến sinh lý.
• Rối loạn trục phân cực gần - xa và tăng sinh lạc chỗ: Phôi thiếu hụt Sox4 có sự mở rộng vùng biểu hiện của dấu ấn cuống thị giác pax2 về phía xa và thu hẹp vùng biểu hiện của dấu ấn võng mạc pax6. Đồng thời, nhuộm kháng thể Phospho-Histone H3 (PH3) ghi nhận sự gia tăng phân bào lạc chỗ tại lớp tế bào hạch (GCL).
• Tăng hoạt tính con đường Hedgehog thông qua ihhb: Tín hiệu Hh gia tăng rõ rệt ở phôi thiếu hụt Sox4, thể hiện qua sự tăng mạnh các bản phiên mã đích gli1 và ptch2. Phân tích sâu chỉ ra Sox4 ức chế biểu hiện của phối tử indian hedgehog b (ihhb). Ngược lại, biểu hiện quá mức mRNA sox4 dẫn đến ức chế biểu hiện phối tử Hh và gây ra kiểu hình mắt dính liền (cyclopia).
• Bmp7b là chất trung gian tiềm năng: Mức độ biểu hiện của bmp7b bị suy giảm đáng kể trong các phôi sox4 morphants, cho thấy Sox4 điều hòa dương tính tín hiệu BMP để gián tiếp hoặc trực tiếp kiềm chế ihhb.
• Tác động hiệp đồng giữa Sox4 và Sox11: Thử nghiệm đồng tiêm Morpholino liều dưới ngưỡng của sox4 và sox11 làm tăng vọt tỷ lệ dị tật khuyết thị giác, chứng minh hai yếu tố này có chức năng trùng lặp và tương tác bổ trợ trong tạo hình mắt.

Nhóm nghiệm thức phôi	Mức biểu hiện ihhb / Tín hiệu Hh	Ranh giới pax2 / pax6	Kiểu hình khe thị giác
Đối chứng (Hoang dã / Mismatch-MO)	Bình thường (sinh lý)	Ranh giới xác định rõ ràng	Đóng kín hoàn toàn (48–60 hpf)
Knockdown Sox4 (sox4a/b-MO)	Tăng cao (gli1, ptch2 tăng)	pax2 mở rộng, pax6 giảm	Khuyết thị giác (Coloboma), tồn dư Laminin
Biểu hiện quá mức sox4 (mRNA injection)	Bị ức chế mạnh	Mất phân định bình thường	Dị tật một mắt / Mắt dính (Cyclopia)
Đồng can thiệp liều thấp Sox4 + Sox11	Tăng hoạt hóa Hh	Rối loạn định hình túi thị	Khuyết thị giác mức độ nặng (hiệp đồng)

Chương 3: Generation and Characterization of Sox4a and Sox4b Mutant Zebrafish Lines Using Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-Associated-9 (Cas9) System

Chương 3 công bố quy trình tạo lập và phân tích kiểu hình các dòng cá ngựa vằn đột biến sox4a và sox4b bằng hệ thống CRISPR/Cas9:

• Tạo dòng đột biến: Thiết kế sgRNA đặc hiệu đã tạo ra các đột biến dịch mã hiệu quả ở thế hệ F0. Tác giả đã thiết lập thành công các dòng đột biến ổn định qua dòng mầm, trong đó dòng sox4aC2 mang đột biến mất đoạn 4 cặp base (4-bp deletion) dẫn đến việc xuất hiện mã kết thúc sớm và làm mất toàn bộ cấu trúc protein Sox4a chức năng. Mức độ mRNA của sox4a trong dòng đột biến này giảm sút nghiêm trọng do cơ chế phân hủy bản sao mang mã vô nghĩa (nonsense-mediated mRNA decay).
• Đặc trưng kiểu hình đột biến mẹ và hợp tử (MZ - Maternal Zygotic): Do sox4a và sox4b đều có sự tích lũy mRNA nguồn gốc mẹ ở giai đoạn 3 hpf, tác giả đã tạo phôi đột biến mẹ - hợp tử dòng sox4aC2 (sox4aC2 MZ mutants).
• Tỷ lệ trứng không thụ tinh: Sự mất hoàn toàn sox4a từ mẹ dẫn đến tỷ lệ rất cao trứng không thể thụ tinh hoặc thoái hóa sớm trước khi bước vào giai đoạn phân cắt đều.
• Khiếm khuyết cấu trúc ở phôi MZ: Khoảng 20%–30% phôi sox4aC2 MZ sống sót biểu hiện dị tật uốn cong trục thân đuôi, phù nề màng ngoài tim, cùng dị tật mắt nhỏ và khuyết thị giác. Đo đạc đường kính mắt cho thấy 70% phôi sox4aC2 MZ biểu hiện kiểu hình mắt nhỏ (microphthalmia).
• Tăng chết tế bào và rối loạn tín hiệu: Nhuộm Acridine Orange và thử nghiệm TUNEL cho thấy mật độ tế bào chết theo chương trình gia tăng rõ rệt tại vùng đầu và mắt phôi đột biến. Tương tự như kết quả ở phôi morphant, các gen con đường Hh (gli1, ptch2) tăng biểu hiện, trong khi các gen con đường BMP (bmp4, bmp7b) bị giảm biểu hiện ở thể đột biến sox4aC2 MZ.

Chương 4: Loss of Sox4 Delays Rod Photoreceptor Differentiation

Chương 4 khảo sát chi tiết vai trò của Sox4 đối với quá trình sinh thần kinh võng mạc:

• Tăng biểu hiện trong tái sinh tế bào que: Trong mô hình cá ngựa vằn chuyển gen trưởng thành Tg(XRho:gap43-mCFP)q13 (mô hình thoái hóa và tái sinh tế bào que mạn tính), mức độ biểu hiện của cả sox4a và sox4b đều tăng cao đáng kể, cho thấy Sox4 tham gia vào mạng lưới tái tạo dòng tế bào này.
• Chậm biệt hóa tế bào cảm quang que ở phôi morphant: Can thiệp knockdown Sox4 làm giảm số lượng tế bào que trưởng thành biểu hiện Rhodopsin (nhuộm kháng thể 4C12 và Zpr-3) tại thời điểm 48–72 hpf. Tế bào que bị định vị lệch chỗ ở những mắt bị khuyết thị giác. Tuy nhiên, đến thời điểm 96 hpf, số lượng tế bào que trong phôi morphant có sự phục hồi trở lại, chứng tỏ Sox4 kiểm soát tốc độ và thời gian biệt hóa tận cùng chứ không triệt tiêu hoàn toàn tiềm năng tạo tế bào que.
• Giảm tế bào que đặc hiệu ở cá đột biến sox4aC2 MZ: Phân tích định lượng trên nền cá chuyển gen XOPS:GFP khẳng định phôi đột biến sox4aC2 MZ có số lượng tế bào que giảm rõ rệt ở cả giai đoạn phôi thai và giai đoạn cá non.
• Tính đặc hiệu đối với dòng tế bào que: Sự biệt hóa của các tế bào nón (nhuộm kháng thể Zpr-1), tế bào hạch (HuC/D), tế bào amacrine và tế bào đệm Müller glia (Zrf-1) không bị suy giảm số lượng trong võng mạc đột biến sox4aC2 MZ (trừ những cá thể bị mắt nhỏ và khuyết thị giác mức độ nặng). Các tế bào tiền thân que và tế bào dẫn xuất dòng que vẫn được xác định đầy đủ, xác nhận khiếm khuyết nằm ở bước chuyển tiếp biệt hóa chức năng sau cùng.

Chương 5: Summary and Discussion: Researching Today, Seeing Tomorrow

Chương 5 tích hợp toàn bộ các kết quả thực nghiệm để xây dựng mô hình cơ chế hoàn chỉnh:

• Sox4 đóng vai trò là một mắt xích kiểm soát cân bằng âm bản đối với tín hiệu Hedgehog (Hedgehog signaling limiter) trong quá trình phát triển phôi sớm. Bằng cách kìm hãm phối tử ihhb (thông qua hoặc phối hợp với bmp7b), Sox4 bảo vệ ranh giới định hình túi thị giác, tạo điều kiện cho sự tiêu biến màng đáy và kết nối liền mạch của hai mép khe thị giác.
• Trong quá trình sinh thần kinh võng mạc, Sox4 hoạt động như một yếu tố cần thiết cho tiến trình thành thục của tế bào cảm quang que, phối hợp giữa tín hiệu nội tại và môi trường vi mô võng mạc để đảm bảo sự tích hợp quang thụ giác hoàn chỉnh.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp về mặt lý luận và cơ chế sinh học

1. Xác lập cơ chế kìm hãm tín hiệu Hedgehog của Sox4: Luận án lần đầu tiên chứng minh Sox4 hoạt động như một yếu tố điều hòa tiêu cực đối với con đường tín hiệu Hedgehog thông qua việc ức chế biểu hiện của phối tử ihhb. Sự điều hòa này là điều kiện bắt buộc để duy trì ranh giới phân cực gần - xa (pax2/pax6) và kiểm soát sự phân chia tế bào bình thường tại cốc thị giác.
2. Làm sáng tỏ cơ chế bệnh sinh của dị tật khuyết thị giác (Coloboma): Luận án chỉ ra rằng sự thiếu hụt Sox4 dẫn đến tăng hoạt tính Hh, làm duy trì bất thường lớp màng đáy Laminin tại rãnh thị giác bụng, ngăn cản sự hợp nhất của hai mép khe thị giác và gây ra dị tật khuyết thị giác.
3. Phát hiện vai trò của nguồn gen Sox4 từ mẹ (maternal Sox4): Phân tích kiểu hình đột biến sox4aC2 MZ cung cấp bằng chứng cho thấy bản sao sox4a có nguồn gốc từ trứng mẹ đóng vai trò không thể thay thế đối với sự thành công của quá trình thụ tinh và phát triển phôi sớm.
4. Xác định vai trò chuyên biệt của Sox4 đối với tế bào cảm quang que: Luận án chứng minh Sox4 cần thiết cho sự biệt hóa đoạn cuối (terminal differentiation) của tế bào que ở động vật có xương sống mà không làm gián đoạn sự phân định số phận của các loại tế bào thần kinh võng mạc khác.

Đóng góp về mặt thực tiễn và phương pháp

1. Thiết lập các dòng cá đột biến chuyển gen ổn định: Tạo lập thành công dòng cá đột biến khuyết đoạn sox4aC2 bằng CRISPR/Cas9, cung cấp công cụ mô hình động vật có giá trị cho các nghiên cứu tiếp theo về bệnh lý nhãn khoa và sinh học tế bào gốc võng mạc.
2. Định hướng nghiên cứu bệnh học nhãn khoa ở người: Các kết quả cung cấp cơ sở dữ liệu di truyền để sàng lọc các đột biến trên họ gen SOXC và các thành phần liên quan đến IHH/BMP ở những bệnh nhân mắc dị tật khuyết thị giác, mắt nhỏ và thoái hóa võng mạc chưa rõ nguyên nhân.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế được ghi nhận từ phạm vi nghiên cứu

• Do hiện tượng nhân đôi bộ gen ở cá xương (teleost genome duplication), cá ngựa vằn mang hai gen đồng chuyển mã là sox4a và sox4b, dẫn đến sự bù trừ chức năng bán phần làm phức tạp hóa việc phân tích kiểu hình đột biến đơn lẻ.
• Tỷ lệ trứng không thụ tinh rất cao ở dòng đột biến sox4aC2 MZ gây cản trở về số lượng mẫu phôi sống sót phục vụ cho các phân tích hóa sinh và mô học ở quy mô lớn.
• Cơ chế liên kết phân tử trực tiếp giữa protein Sox4 với vùng khởi động (promoter) hoặc vùng tăng cường (enhancer) của gen ihhb hoặc bmp7b chưa được xác định bằng kỹ thuật ChIP-seq hay EMSA đặc hiệu trong khuôn khổ mô mắt in vivo.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Thực hiện các thử nghiệm kết tủa miễn dịch nhiễm sắc chất (ChIP) và phân tích reporter luciferase để làm rõ Sox4 liên kết trực tiếp hay gián tiếp lên các vùng điều hòa phiên mã của ihhb và bmp7b.
• Nghiên cứu cơ chế tương tác giữa Sox4 và các yếu tố phiên mã định hướng tế bào que chuyên biệt như Nrl, Nr2e3 và Crx trong quá trình hoạt hóa các gen cấu trúc của tế bào que (chẳng hạn như rhodopsin).
• Tạo dòng đột biến kép hoàn toàn cả hai gen sox4a và sox4b để khảo sát toàn diện sự triệt tiêu chức năng Sox4 trong quá trình phát triển mắt và tái sinh võng mạc ở cá trưởng thành.

---

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu chuyên khảo có giá trị cao cho các đối tượng và lĩnh vực sau:

• Nghiên cứu sinh và nhà nghiên cứu sinh học phát triển: Cung cấp phương pháp luận chuẩn mực trong việc kết hợp can thiệp Morpholino, biểu hiện quá mức mRNA, chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 và các kỹ thuật mô học huỳnh quang định lượng trên mô hình cá ngựa vằn.
• Giảng viên và chuyên gia di truyền học nhãn khoa: Chương 1 và Chương 2 là nguồn tham khảo chi tiết về mạng lưới tương tác giữa các con đường truyền tín hiệu hình thái học (Hedgehog, BMP, Wnt, FGF, Retinoic Acid) và các yếu tố phiên mã kiểm soát sự đóng khe thị giác và phân tầng võng mạc.
• Các bác sĩ và nhà nghiên cứu y học dịch tễ/chẩn đoán di truyền: Dữ liệu về mối liên hệ giữa Sox4, Hedgehog và dị tật Coloboma cung cấp cơ sở khoa học để đánh giá biến thể di truyền ở bệnh nhân mắc dị tật bẩm sinh vùng mắt và các hội chứng đa dị tật (như CHARGE, Renal-coloboma).

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao sự thiếu hụt Sox4 lại dẫn đến dị tật khuyết thị giác (Coloboma) ở cá ngựa vằn?

Thiếu hụt Sox4 dẫn đến sự mất kìm hãm và tăng biểu hiện của phối tử indian hedgehog b (ihhb), làm gia tăng hoạt tính con đường truyền tín hiệu Hedgehog (gli1, ptch2 tăng cao). Sự tăng hoạt Hh làm rối loạn ranh giới trục gần - xa của túi thị giác (mở rộng dấu ấn cuống thị giác pax2 và giảm dấu ấn võng mạc pax6), đồng thời ngăn cản sự tiêu biến sinh lý của màng đáy Laminin tại khe thị giác, khiến hai mép khe không thể hợp nhất.

2. Sự khác biệt về vai trò của nguồn gen sox4a từ mẹ (maternal) và từ hợp tử (zygotic) là gì?

Cả sox4a và sox4b đều có sự hiện diện của bản sao mRNA từ mẹ trong trứng ở giai đoạn 3 hpf trước khi bộ gen hợp tử được kích hoạt. Sự mất hoàn toàn sox4a nguồn gốc mẹ ở dòng đột biến sox4aC2 MZ dẫn đến tỷ lệ rất cao trứng không thể thụ tinh hoặc thoái hóa sớm; những phôi sống sót biểu hiện kiểu hình dị tật nặng bao gồm mắt nhỏ (70%), khuyết thị giác, cong thân và phù tim, chứng minh sox4a từ mẹ là thiết yếu cho sự phát triển phôi ban đầu.

3. Sox4 ảnh hưởng cụ thể như thế nào đến quá trình sinh thần kinh tế bào cảm quang que (rod photoreceptors)?

Sox4 không làm thay đổi sự xác định số phận ban đầu của các tế bào tiền thân que, nhưng sự thiếu hụt Sox4 (ở cả phôi morphant và thể đột biến sox4aC2 MZ) làm trì hoãn quá trình biệt hóa đoạn cuối (terminal differentiation) của tế bào que, khiến số lượng tế bào que trưởng thành biểu hiện Rhodopsin bị suy giảm rõ rệt trong giai đoạn phôi thai và cá non. Quá trình sinh các loại tế bào thần kinh khác (tế bào nón, tế bào hạch, tế bào amacrine, tế bào Müller) không bị ảnh hưởng trực tiếp.

4. Bằng chứng nào cho thấy có sự tương tác chức năng giữa Sox4 và Sox11 trong tạo hình mắt?

Trong Chương 2, tác giả thực hiện thử nghiệm đồng tiêm Morpholino ức chế sox4 và sox11 ở mức liều dưới ngưỡng (nồng độ thấp không gây kiểu hình khi tiêm đơn lẻ). Kết quả cho thấy việc ức chế đồng thời cả hai gen tạo ra sự gia tăng vọt về tỷ lệ và mức độ nghiêm trọng của dị tật khuyết thị giác, chứng minh Sox4 và Sox11 có chức năng hiệp đồng và trùng lặp trong việc kiểm soát sự đóng khe thị giác.

---

Kết luận

Luận án của Wen Wen đã làm sáng tỏ vai trò thiết yếu của yếu tố phiên mã Sox4 trong quá trình phát triển mắt ở động vật có xương sống thông qua hai cơ chế phân tử then chốt: giới hạn tín hiệu Hedgehog để điều hòa sự đóng khe thị giác và kiểm soát tiến trình biệt hóa đoạn cuối của tế bào cảm quang que võng mạc. Bằng việc kết hợp các kỹ thuật can thiệp gen, giải trình tự phân tử và tạo dòng đột biến CRISPR/Cas9 trên mô hình cá ngựa vằn, công trình đã xác lập vị trí của Sox4 như một mắt xích ức chế tiêu cực đối với phối tử ihhb, đồng thời chứng minh tầm quan trọng của nguồn gen sox4a từ mẹ đối với sự phát triển phôi sớm. Các phát hiện này mở rộng hiểu biết về mạng lưới điều hòa di truyền trong tạo hình nhãn cầu và cung cấp cơ sở sinh học thực nghiệm phục vụ nghiên cứu các bệnh lý dị tật mắt bẩm sinh ở người.

Trích đoạn nội dung tài liệu

University of Kentucky UKnowledge Theses and Dissertations--Biology Biology 2016 The Role of Sox4 in Regulating Choroid Fissure Closure and Retinal Neurogenesis Wen Wen University of Kentucky, wen.edu Digital Object Identifier: http://dx.180 Right click to open a feedback form in a new tab to let us know how this document benefits you. Recommended Citation Wen, Wen, "The Role of Sox4 in Regulating Choroid Fissure Closure and Retinal Neurogenesis" (2016). Theses and Dissertations--Biology.edu/biology_etds/35 This Doctoral Dissertation is brought to you for free and open access by the Biology at UKnowledge. It has been accepted for inclusion in Theses and Dissertations--Biology by an authorized administrator of UKnowledge.

For more information, please contact UKnowledge@lsv. STUDENT AGREEMENT: I represent that my thesis or dissertation and abstract are my original work. Proper attribution has been given to all outside sources. I understand that I am solely responsible for obtaining any needed copyright permissions.

I have obtained needed written permission statement(s) from the owner(s) of each third-party copyrighted matter to be included in my work, allowing electronic distribution (if such use is not permitted by the fair use doctrine) which will be submitted to UKnowledge as Additional File. I hereby grant to The University of Kentucky and its agents the irrevocable, non-exclusive, and royalty-free license to archive and make accessible my work in whole or in part in all forms of media, now or hereafter known. I agree that the document mentioned above may be made available immediately for worldwide access unless an embargo applies. I retain all other ownership rights to the copyright of my work.

I also retain the right to use in future works (such as articles or books) all or part of my work. I understand that I am free to register the copyright to my work. REVIEW, APPROVAL AND ACCEPTANCE The document mentioned above has been reviewed and accepted by the student’s advisor, on behalf of the advisory committee, and by the Director of Graduate Studies (DGS), on behalf of the program; we verify that this is the final, approved version of the student’s thesis including all changes required by the advisory committee. The undersigned agree to abide by the statements above.

Wen Wen, Student Dr. Morris, Major Professor Dr. Westneat, Director of Graduate Studies THE ROLE OF SOX4 IN REGULATING CHOROID FISSURE CLOSURE AND RETINAL NEUROGENESIS __________________________ DISSERTATION __________________________ A dissertation submitted in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy in the College of Arts and Sciences at the University of Kentucky By Wen Wen Lexington, Kentucky Director: Ann C. Morris, Associate Professor of Biology Lexington, Kentucky 2016 Copyright © Wen Wen 2016 ABSTRACT OF DISSERTATION THE ROLE OF SOX4 IN REGULATING CHOROID FISSURE CLOSURE AND RETINAL NEUROGENESIS The development of the vertebrate eye is tightly controlled by precise genetic regulations.

From a single ocular primordium to bilateral eyes with complex structures and cell types, it requires intensive proliferation and migration for cells in both the ectoderm and mesoderm to accomplish ocular morphogenesis, and during this process cell differentiation and interaction takes place to establish the complex composition of ocular cell types and cellular connections. Genetic defects can lead to severe abnormalities in eye morphogenesis and cell differentiation during ocular development. A tremendous amount of work has been done to identify both intrinsic and extrinsic factors that regulate ocular development. However, much more work is needed to fully understand this complex process.

Sox4 is known as a transcription activator that regulates cell survival and differentiation in multiple embryonic tissues during development. Evidence of its requirement during ocular development has recently emerged, but the mechanism by which Sox4 regulates ocular development is far from elucidated. Chapter 1 of this dissertation provides an overview of different stages in embryonic eye development and known genetic interactions during each stage. It also reviews recent knowledge about SoxC proteins and their roles in ocular development.

Chapter 2 presents data characterizing the expression profile of the zebrafish sox4 co-orthologs, sox4a and sox4b, in the developing eye. Additionally, it presents data from morpholino-mediated sox4 knockdown in zebrafish, which indicate that Sox4 deficiency leads to defects in choroid fissure closure through elevation in the Hedgehog (Hh) signaling pathway.