Nghiên cứu thiết kế vector baculovirus chứa gen M1 virus H1N1 để phát triển vaccine thế hệ mới

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu thiết kế vector baculovirus chứa gen m1 của virus h1n1 bước đầu tạo vaccine thế hệ mới, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất biện pháp hoàn

• Tác giả: Vũ Thị Thanh Nhàn
• Người hướng dẫn: PGS.TS Đinh Duy Kháng
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Vaccine Thế Hệ Mới Từ Vector Baculovirus H1N1
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2011
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về virus cúm
• 1.2. Đặc điểm hình thái, cấu trúc của virus cúm
• 1.3. Đặc điểm các phân đoạn gen của virus
• 1.4. Cơ chế xâm nhiễm và gây bệnh của virus cúm trong tế bào vật chủ
• 1.5. Các kháng nguyên quan trọng của virus cúm
• 1.5.1. Hemagglutinin (HA)
• 1.5.2. Neurominidase (NA)
• 1.6. Matrix protein (M1) của virus cúm
• 1.7. Tình hình dịch bệnh H1N1
• 1.8. Vaccine phòng chống cúm
• 1.8.1. Đại cƣơng về vaccine. Tổng quan về VLPs
• 1.8.2. Hệ thống biểu hiện Baculovirus
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
• 2.2. Vector tách dòng
• 2.3. Vector biểu hiện trong tế bào côn trùng
• 2.4. Hóa chất và sinh phẩm
• 2.5. Trang thiết bị
• 2.6. Phƣơng pháp nghiên cứu
• 2.6.1. Tách chiết RNA tổng số
• 2.6.2. Kiểm tra RNA bằng quang phổ kế
• 2.6.3. Tổng hợp cDNA
• 2.6.4. Nhân gen M1 của virus cúm A/H1N1 bằng PCR
• 2.6.5. Điện di trên gel agarose
• 2.6.6. Tách dòng gen
• 2.6.7. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E. coli
• 2.6.8. Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn E. coli
• 2.6.9. Kiểm tra DNA plasmid bằng enzym giới hạn
• 2.6.10. Thu đoạn DNA từ gel agarose
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả tách chiết RNA tổng số
• 3.2. Thiết kế hộp gen M1 của virus cúm A/H1N1
• 3.3. Tách dòng hộp gen M1 vào vector pCR2
• 3.4. Gắn sản phẩm PCR chứa hộp gen M1 vào vector pCR2
• 3.5. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E.coli chủng DH5α
• 3.6. Tách chiết DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn E. coli
• 3.7. Chọn lọc vector tái tổ hợp bằng cắt với enzym giới hạn
• 3.8. Tinh sạch các plasmid tái tổ hợp
• 3.9. Kết quả xác định trình tự
• 3.10. Thiết kế vector biểu hiện baculovirus mang hộp gen M1
• 3.11. Thu nhận hộp gen M1 từ pCRM1 và chuẩn bị vector pBluBac4
• 3.12. Thiết kế vector biểu hiện pBluBac4.5/V5-His-TOPO mang hộp gen M1
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về vaccine thế hệ mới từ vector baculovirus H1N1

Vaccine thế hệ mới từ vector baculovirus H1N1 đang trở thành một trong những giải pháp tiềm năng trong việc phòng ngừa bệnh cúm A/H1N1. Với sự phát triển của công nghệ sinh học, việc thiết kế vaccine từ baculovirus không chỉ giúp tăng cường hiệu quả mà còn giảm thiểu chi phí sản xuất. Baculovirus là một loại virus có khả năng lây nhiễm cho côn trùng, được sử dụng như một vector để sản xuất protein tái tổ hợp, trong đó có protein kháng nguyên của virus H1N1. Việc sử dụng baculovirus trong sản xuất vaccine mang lại nhiều lợi ích, bao gồm khả năng sản xuất hàng loạt và tính an toàn cao cho người sử dụng.

1.1. Đặc điểm của virus H1N1 và vai trò của vaccine

Virus H1N1 thuộc họ Orthomyxoviridae, gây ra bệnh cúm A ở người và động vật. Vaccine H1N1 giúp kích thích hệ miễn dịch, tạo ra kháng thể chống lại virus, từ đó ngăn ngừa sự lây lan của bệnh. Việc phát triển vaccine hiệu quả là rất cần thiết, đặc biệt trong bối cảnh dịch bệnh có thể bùng phát bất cứ lúc nào.

1.2. Lợi ích của việc sử dụng vector baculovirus trong vaccine

Sử dụng vector baculovirus trong sản xuất vaccine mang lại nhiều lợi ích như khả năng sản xuất nhanh chóng, chi phí thấp và an toàn cho người sử dụng. Baculovirus có khả năng biểu hiện protein kháng nguyên một cách hiệu quả, giúp tăng cường khả năng miễn dịch cho cơ thể.

II. Thách thức trong việc phát triển vaccine H1N1 từ baculovirus

Mặc dù vaccine thế hệ mới từ vector baculovirus H1N1 có nhiều ưu điểm, nhưng vẫn tồn tại một số thách thức trong quá trình phát triển. Một trong những thách thức lớn nhất là khả năng biến đổi gen của virus H1N1, điều này có thể làm giảm hiệu quả của vaccine. Ngoài ra, việc tối ưu hóa quy trình sản xuất và đảm bảo tính an toàn cho người sử dụng cũng là những vấn đề cần được giải quyết.

2.1. Biến đổi gen của virus H1N1 và ảnh hưởng đến vaccine

Virus H1N1 có khả năng đột biến cao, điều này có thể dẫn đến sự xuất hiện của các chủng virus mới mà vaccine hiện tại không thể bảo vệ. Việc theo dõi và nghiên cứu sự biến đổi gen của virus là rất quan trọng để cập nhật và cải tiến vaccine kịp thời.

2.2. Quy trình sản xuất vaccine và tính an toàn

Quy trình sản xuất vaccine từ baculovirus cần được tối ưu hóa để đảm bảo hiệu quả và tính an toàn. Việc kiểm soát chất lượng trong từng giai đoạn sản xuất là rất quan trọng để đảm bảo vaccine đạt tiêu chuẩn trước khi đưa vào sử dụng.

III. Phương pháp sản xuất vaccine H1N1 từ vector baculovirus

Phương pháp sản xuất vaccine H1N1 từ vector baculovirus bao gồm nhiều bước quan trọng, từ việc thiết kế vector cho đến thu nhận protein kháng nguyên. Quá trình này đòi hỏi sự chính xác và kỹ thuật cao để đảm bảo vaccine đạt hiệu quả tối ưu. Việc sử dụng công nghệ sinh học hiện đại giúp tăng cường khả năng sản xuất và giảm thiểu thời gian cần thiết.

3.1. Thiết kế vector baculovirus chứa gen M1 của virus H1N1

Thiết kế vector baculovirus chứa gen M1 của virus H1N1 là bước đầu tiên trong quá trình sản xuất vaccine. Gen M1 đóng vai trò quan trọng trong việc kích thích phản ứng miễn dịch của cơ thể, từ đó tạo ra kháng thể chống lại virus.

3.2. Quy trình thu nhận protein kháng nguyên từ baculovirus

Quy trình thu nhận protein kháng nguyên từ baculovirus bao gồm các bước nuôi cấy tế bào, thu hoạch và tinh chế protein. Việc tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy giúp tăng cường hiệu suất sản xuất protein kháng nguyên, đảm bảo vaccine có hiệu quả cao.

IV. Ứng dụng thực tiễn của vaccine H1N1 từ baculovirus

Vaccine H1N1 từ baculovirus đã được nghiên cứu và thử nghiệm với nhiều kết quả khả quan. Việc ứng dụng vaccine này trong thực tiễn không chỉ giúp ngăn ngừa dịch bệnh mà còn góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Các nghiên cứu cho thấy vaccine có khả năng tạo ra phản ứng miễn dịch mạnh mẽ và bền vững.

4.1. Kết quả nghiên cứu về hiệu quả của vaccine

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng vaccine H1N1 từ baculovirus có khả năng tạo ra kháng thể cao, giúp bảo vệ cơ thể khỏi virus. Các thử nghiệm lâm sàng cho thấy vaccine an toàn và hiệu quả trong việc ngăn ngừa bệnh cúm A/H1N1.

4.2. Ứng dụng trong phòng chống dịch bệnh

Vaccine H1N1 từ baculovirus có thể được ứng dụng rộng rãi trong các chương trình tiêm chủng phòng chống dịch bệnh. Việc sử dụng vaccine này không chỉ giúp giảm thiểu tỷ lệ mắc bệnh mà còn góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

V. Kết luận và tương lai của vaccine thế hệ mới từ baculovirus H1N1

Vaccine thế hệ mới từ vector baculovirus H1N1 hứa hẹn sẽ là một giải pháp hiệu quả trong việc phòng ngừa bệnh cúm A/H1N1. Với những ưu điểm vượt trội, vaccine này có thể giúp giảm thiểu tác động của dịch bệnh đến sức khỏe cộng đồng. Tương lai của vaccine này phụ thuộc vào việc tiếp tục nghiên cứu và phát triển công nghệ sản xuất, cũng như việc theo dõi sự biến đổi gen của virus.

5.1. Triển vọng phát triển vaccine trong tương lai

Triển vọng phát triển vaccine H1N1 từ baculovirus trong tương lai rất sáng sủa. Các nghiên cứu đang được tiến hành để cải thiện hiệu quả và tính an toàn của vaccine, từ đó đáp ứng tốt hơn nhu cầu phòng ngừa dịch bệnh.

5.2. Vai trò của công nghệ sinh học trong sản xuất vaccine

Công nghệ sinh học đóng vai trò quan trọng trong việc phát triển vaccine thế hệ mới. Việc ứng dụng các công nghệ hiện đại giúp tăng cường khả năng sản xuất và cải thiện chất lượng vaccine, từ đó bảo vệ sức khỏe cộng đồng một cách hiệu quả.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh cúm A/H1N1 là một trong những bệnh nhiễm trùng đường hô hấp cấp tính do virus cúm A/H1N1 thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra, với khả năng lây lan nhanh và gây đại dịch toàn cầu. Từ khi xuất hiện lần đầu tại Mexico năm 2009, virus đã lan rộng ra hơn 214 quốc gia và vùng lãnh thổ, gây ra hơn 18.000 ca tử vong theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO). Tại Việt Nam, chỉ trong vòng 3 tháng sau khi dịch bùng phát, đã ghi nhận hơn 7.000 trường hợp nhiễm và 9 ca tử vong. Virus cúm A/H1N1 có khả năng đột biến cao, đặc biệt ở các gen mã hóa kháng nguyên HA và NA, làm giảm hiệu quả của các vaccine truyền thống và thuốc kháng virus hiện có. Do đó, việc phát triển vaccine thế hệ mới có tính an toàn cao, hiệu quả miễn dịch tốt và thời gian sản xuất nhanh là cấp thiết để ứng phó với các biến thể virus trong tương lai.

Mục tiêu nghiên cứu của luận văn là thiết kế vector baculovirus chứa gen M1 của virus H1N1, bước đầu tạo nền tảng cho vaccine thế hệ mới dựa trên công nghệ Virus Like Particles (VLPs). Nghiên cứu được thực hiện tại phòng Vi sinh vật học Phân tử, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, tập trung vào việc tách chiết, nhân dòng gen M1, thiết kế vector biểu hiện trong tế bào côn trùng và chuẩn bị các bước để tạo vaccine VLPs. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển vaccine phòng chống cúm A/H1N1 tại Việt Nam, góp phần nâng cao năng lực chủ động trong phòng chống dịch bệnh truyền nhiễm.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình nghiên cứu về virus cúm A/H1N1, đặc biệt tập trung vào:

• Cấu trúc và đặc điểm gen của virus cúm A/H1N1: Virus có hệ gen RNA sợi đơn âm gồm 8 phân đoạn, mã hóa 11 protein, trong đó protein M1 đóng vai trò quan trọng trong cấu trúc và quá trình nhân lên của virus. Protein M1 là thành phần nền, liên kết với vật chất di truyền và các protein vỏ, tham gia vào quá trình nảy chồi và giải phóng virus.
• Công nghệ VLPs (Virus Like Particles): VLPs là các hạt giả virus có cấu trúc tương tự virus tự nhiên nhưng không chứa vật liệu di truyền, do đó an toàn và có khả năng kích thích miễn dịch mạnh mẽ. VLPs được tạo ra bằng cách biểu hiện đồng thời các protein kháng nguyên của virus trong hệ thống tế bào biểu hiện tái tổ hợp, như tế bào côn trùng sử dụng baculovirus.
• Hệ thống biểu hiện baculovirus: Baculovirus là virus ký sinh trên côn trùng, được sử dụng làm vector biểu hiện gen trong tế bào côn trùng (như tế bào Sf9). Hệ thống này cho phép biểu hiện protein tái tổ hợp với hiệu suất cao, có khả năng sửa đổi sau dịch mã phù hợp với protein của virus cúm.

Các khái niệm chính bao gồm: gen M1, vector pCR2.1 và pBluBac4.5/V5-His-TOPO, enzym giới hạn BamH I và Hind III, kỹ thuật PCR, cloning, biến nạp DNA plasmid, và kỹ thuật điện di gel agarose.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng chủng virus cúm A/H1N1 đã được bất hoạt, lấy RNA tổng số làm mẫu. Các bước chính gồm:

• Tách chiết RNA tổng số: Sử dụng dung dịch Trizol, quy trình tách chiết RNA được thực hiện trong điều kiện vô trùng, tránh nhiễm RNase. Nồng độ RNA đo bằng quang phổ kế với kết quả khoảng 104 ng/µl, độ tinh sạch cao (tỷ lệ A260/A280 = 1,87).
• Tổng hợp cDNA: Sử dụng enzym phiên mã ngược (reverse transcriptase) và mồi ngẫu nhiên để tổng hợp cDNA từ RNA virus.
• Nhân gen M1 bằng PCR: Sử dụng cặp mồi đặc hiệu gắn thêm trình tự Kozak để tăng hiệu quả biểu hiện trong tế bào côn trùng. Phản ứng PCR được thực hiện với 30 chu kỳ, sản phẩm có kích thước khoảng 780 bp.
• Cloning và biến nạp: Sản phẩm PCR được gắn vào vector pCR2.1, biến nạp vào tế bào E.coli chủng DH5α, chọn lọc khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp dựa trên màu sắc khuẩn lạc (trắng – mang gen M1, xanh – không mang gen).
• Tách chiết và kiểm tra plasmid: DNA plasmid được tách chiết từ vi khuẩn, kiểm tra bằng enzym giới hạn BamH I và Hind III, xác định kích thước gen M1 đúng khoảng 780 bp.
• Giải trình tự DNA: Xác nhận trình tự gen M1 bằng máy giải trình tự tự động ABI 3100, kết quả cho thấy độ tương đồng 99,5-100% với gen M1 đã công bố trên Genbank.
• Thiết kế vector biểu hiện baculovirus: Gen M1 được cắt ra từ vector pCR2.1 và gắn vào vector biểu hiện pBluBac4.5/V5-His-TOPO tại vị trí enzym giới hạn tương ứng, tạo vector tái tổ hợp pBluBacM1 để biểu hiện trong tế bào côn trùng.

Quá trình nghiên cứu được thực hiện trong khoảng thời gian năm 2010-2011 tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Tách chiết RNA và tổng hợp cDNA thành công: Nồng độ RNA đạt khoảng 104 ng/µl với độ tinh sạch cao (A260/A280 = 1,87), đủ điều kiện cho tổng hợp cDNA và các bước tiếp theo.
2. Nhân gen M1 đặc hiệu bằng PCR: Sản phẩm PCR có kích thước khoảng 780 bp, phù hợp với kích thước lý thuyết của gen M1 có gắn trình tự Kozak, chứng tỏ nhân dòng gen thành công.
3. Cloning và biến nạp vector tái tổ hợp: Khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp chiếm tỷ lệ cao, được chọn lọc dựa trên màu sắc khuẩn lạc (khuẩn lạc trắng). Kiểm tra enzym giới hạn cho thấy các plasmid tái tổ hợp có đoạn gen M1 đúng kích thước 780 bp.
4. Xác nhận trình tự gen M1: Trình tự gen M1 phân lập có độ tương đồng 99,5-100% so với trình tự gen M1 đã công bố, đảm bảo tính chính xác và bảo thủ của gen.
5. Thiết kế vector biểu hiện baculovirus thành công: Gen M1 được gắn vào vector pBluBac4.5/V5-His-TOPO, tạo vector tái tổ hợp pBluBacM1 sẵn sàng cho biểu hiện protein M1 trong tế bào côn trùng.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy quy trình tách chiết RNA, tổng hợp cDNA, nhân dòng gen M1 và thiết kế vector biểu hiện baculovirus được thực hiện thành công với độ chính xác cao. Việc sử dụng trình tự Kozak trong thiết kế mồi PCR giúp tăng hiệu quả biểu hiện protein trong tế bào côn trùng, phù hợp với mục tiêu tạo vaccine VLPs. So với các nghiên cứu trước đây, việc sử dụng hệ thống baculovirus để biểu hiện protein M1 là phương pháp hiện đại, cho phép sản xuất protein tái tổ hợp với số lượng lớn và chất lượng cao.

Dữ liệu có thể được trình bày qua các biểu đồ điện di gel agarose thể hiện kích thước sản phẩm PCR, plasmid và vector tái tổ hợp, cũng như bảng so sánh trình tự gen M1 với các chủng virus khác. Kết quả này mở ra hướng đi mới trong phát triển vaccine thế hệ mới, khắc phục hạn chế của vaccine truyền thống về thời gian sản xuất và hiệu quả miễn dịch.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Tiếp tục biểu hiện và tinh sạch protein M1 trong tế bào côn trùng: Thực hiện biểu hiện protein M1 từ vector pBluBacM1 trong tế bào Sf9, tinh sạch protein để chuẩn bị cho bước tạo VLPs. Mục tiêu tăng sản lượng protein đạt mức đủ cho thử nghiệm tiền lâm sàng trong vòng 6-12 tháng.
2. Phát triển quy trình tạo VLPs chứa protein M1, HA và NA: Kết hợp biểu hiện đồng thời các protein kháng nguyên để tạo hạt VLPs hoàn chỉnh, đánh giá tính ổn định và cấu trúc hạt. Thời gian dự kiến 12-18 tháng.
3. Thử nghiệm đánh giá tính an toàn và hiệu quả miễn dịch của vaccine VLPs trên mô hình động vật: Tiến hành thử nghiệm trên chuột hoặc thỏ để đánh giá đáp ứng miễn dịch và khả năng bảo vệ chống lại virus H1N1. Thời gian 12 tháng.
4. Xây dựng quy trình sản xuất vaccine VLPs quy mô phòng thí nghiệm và tiền công nghiệp: Chuẩn bị các điều kiện sản xuất, kiểm soát chất lượng và quy trình đóng gói vaccine. Thời gian 18-24 tháng.
5. Hợp tác với các cơ quan y tế và doanh nghiệp để phát triển thương mại vaccine: Đẩy mạnh nghiên cứu ứng dụng, xin cấp phép thử nghiệm lâm sàng và sản xuất đại trà. Chủ thể thực hiện là Viện Công nghệ sinh học phối hợp với các đơn vị sản xuất vaccine trong nước.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành sinh học phân tử, vi sinh vật học: Nghiên cứu chi tiết về kỹ thuật tách chiết RNA, nhân dòng gen, cloning và biểu hiện protein tái tổ hợp trong hệ thống baculovirus.
2. Chuyên gia phát triển vaccine và công nghệ sinh học: Tham khảo quy trình thiết kế vector biểu hiện, ứng dụng công nghệ VLPs trong phát triển vaccine thế hệ mới.
3. Cơ quan y tế và quản lý dịch bệnh: Hiểu rõ cơ sở khoa học và tiềm năng ứng dụng vaccine VLPs trong phòng chống dịch cúm A/H1N1 và các dịch bệnh virus khác.
4. Doanh nghiệp sản xuất vaccine và dược phẩm sinh học: Áp dụng công nghệ baculovirus và VLPs để phát triển sản phẩm vaccine mới, nâng cao năng lực sản xuất và đáp ứng nhu cầu thị trường.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao chọn gen M1 để thiết kế vaccine VLPs?
   Gen M1 mã hóa protein nền quan trọng trong cấu trúc và quá trình nhân lên của virus cúm, có tính bảo thủ cao và khả năng kích thích miễn dịch tốt, làm nền tảng cho việc tạo hạt VLPs giống virus tự nhiên nhưng an toàn.

2. Ưu điểm của hệ thống biểu hiện baculovirus là gì?
   Hệ thống này cho phép biểu hiện protein tái tổ hợp với số lượng lớn, có khả năng sửa đổi sau dịch mã phù hợp, thời gian sản xuất nhanh (vài tuần đến vài tháng), và an toàn do không gây bệnh cho người.

3. Công nghệ VLPs khác gì so với vaccine truyền thống?
   VLPs không chứa vật liệu di truyền nên không gây nhiễm bệnh, kích thích miễn dịch mạnh mẽ hơn, sản xuất nhanh và chi phí thấp hơn so với vaccine bất hoạt hoặc giảm độc lực truyền thống.

4. Làm thế nào để kiểm tra thành công việc nhân dòng gen M1?
   Sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu, kiểm tra sản phẩm trên gel agarose, biến nạp vào E.coli, chọn lọc khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp dựa trên màu sắc và enzym giới hạn, cuối cùng xác nhận bằng giải trình tự DNA.

5. Tiềm năng ứng dụng của nghiên cứu này trong thực tế?
   Nghiên cứu mở ra hướng phát triển vaccine thế hệ mới tại Việt Nam, giúp chủ động sản xuất vaccine phòng chống cúm A/H1N1, giảm thiểu tác động dịch bệnh và nâng cao năng lực y tế công cộng.

Kết luận

• Đã thành công trong việc tách chiết RNA, tổng hợp cDNA và nhân dòng gen M1 của virus cúm A/H1N1 với độ chính xác cao.
• Thiết kế và tạo vector biểu hiện baculovirus pBluBacM1 mang gen M1 phù hợp cho biểu hiện protein trong tế bào côn trùng.
• Kết quả mở ra tiền đề cho việc phát triển vaccine VLPs thế hệ mới, có ưu điểm về an toàn, hiệu quả miễn dịch và thời gian sản xuất nhanh.
• Nghiên cứu góp phần nâng cao năng lực nghiên cứu và sản xuất vaccine tại Việt Nam, đáp ứng nhu cầu phòng chống dịch bệnh cúm.
• Các bước tiếp theo bao gồm biểu hiện protein, tạo VLPs, thử nghiệm tiền lâm sàng và phát triển quy trình sản xuất vaccine quy mô lớn.

Khuyến khích các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp trong lĩnh vực vaccine tiếp tục phát triển và ứng dụng công nghệ này để nâng cao hiệu quả phòng chống dịch bệnh truyền nhiễm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Những thập niên về trƣớc, thế giới đã có một thời gian sống khá yên ổn với các bệnh do các loại virus gây ra nhờ thành quả của các vaccine, thuốc kháng sinh. Nhƣng từ những năm 1970 đã có các nghiên cứu cảnh báo sự xuất hiện của các vi và siêu vi trùng có thể gây đại dịch do khả năng kháng vaccine và thuốc. Sau đó, từ các năm TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn 1980 đến nay thì cộng đồng y tế thế giới đã phải đƣơng đầu với nhiều dịch bệnh xảy ra nhƣ dịch AIDS và tiếp theo là các dịch bệnh khác kể cả SARS, cúm gà H5N1, cúm lợn H1N1, dịch bò điên, Ebola v. Theo dự đoán các bệnh dịch sẽ còn tiếp tục phát triển do hậu quả từ việc thay đổi khí hậu và môi trƣờng trên thế giới.

Bệnh cúm A/ H1N1 là bệnh nhiễm trùng đƣờng hô hấp cấp tính do virus cúm A/H1N1 thuộc họ Othomyxoviridae gây ra, xuất phát từ Mêxico, Hoa Kỳ, và một số quốc gia khác. Ban đầu chỉ thấy nhiễm trên lợn nhƣng sau đó phát hiện loại virus này còn nhiễm trên nhiều đối tƣợng động vật khác. Virus đƣợc phân chia thành nhiều phân type khác nhau dựa trên kháng nguyên HA và NA có trên bề mặt của hạt virus. Nhóm virus cúm A có 17 loại kháng nguyên HA (từ H1 đến H17) và 9 loại kháng nguyên NA (từ N1 đến N9) [25].

Sự tái tổ hợp giữa hai loại kháng nguyên này sẽ tạo ra nhiều phân type cúm khác nhau về độc tính và khả năng gây bệnh. Mặt khác, virus cúm A dễ dàng đột biến trong gen/ hệ gen (đặc biệt ở gen mã hóa NA và HA) hoặc trao đổi các gen kháng nguyên với nhau trong quá trình xâm nhiễm, tồn tại và lây truyền giữa các loài vật chủ để tạo biến thể mới [30]. Các vaccine truyền thống tuy đã mang lại những kết quả hữu ích cho việc ngăn ngừa và chống dịch bệnh, tuy nhiên, việc sử dụng thuốc và cơ chế hoạt động biến đổi của virus A/H1N1 trong tế bào vật chủ đã gây ra những hạn chế về tính hiệu quả của vaccine. Ngoài ra chi phí cho sản xuất vaccine khá cao và thời gian tƣơng đối dài.

Do vậy vấn đề cấp thiết là cần phải phát triển các công nghệ hiện đại để nhanh chóng tạo ra vaccine thế hệ mới nhằm đối phó với những hiểm họa cho cộng đồng trong tƣơng lai. VLPs (Virus like particles) vaccine là một trong những hƣớng đi mới trong công nghệ sản xuất vaccine thế hệ mới có nhiều tính ƣu việt so với vaccine thế hệ trƣớc đây. 1 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn Từ những yêu cầu cấp thiết từ thực tế, chúng tôi thực hiện đề tài : “Thiết kế vector baculovirus chứa gen M1 của virus H1N1, bước đầu tạo vaccine thế hệ mới”. Đề tài đƣợc thực hiện tại phòng Vi sinh vật học Phân tử, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về virus cúm 1. Đặc điểm hình thái, cấu trúc của virus cúm Bệnh cúm là bệnh của loài chim và động vật có vú do siêu vi trùng dạng RNA thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra. Họ Orthomyxoviridae đã đƣợc phát hiện, bao gồm 4 nhóm virus: nhóm virus cúm A, cúm B, cúm C và nhóm Thogotovirus.

Các nhóm virus khác nhau bởi kháng nguyên bề mặt capsid: ở virus cúm A và B là Hemagglutinin, ở virus cúm C là Hemagglutinin Esterase Fusion, và ở Thogotovirus là Glycoprotein. Virus cúm A có cấu tạo hình cầu hoặc hình khối đa diện, đôi khi cũng có dạng hình sợi, đƣờng kính 80 – 120 nm, khối lƣợng phân tử khoảng 250 triệu Da (Hình 1. Kết quả phân tích thành phần hóa học cho thấy một hạt virus có chứa khoảng 0,8 - 1,1% RNA; 70 – 75% protein; 20 – 24% lipid và 5 – 8% carbonhydrate [25]. Hệ gen virus cúm A là RNA sợi đơn âm (-) ssRNA, bao gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt, mã hóa cho 11 protein khác nhau của virus gồm: HA, NA, M (M1 và M2), NP, NS (NS1 và NS2), PA, PB1, PB1 - F2 và PB2 [7].

Mỗi phân đoạn RNA của virus cúm A có cấu trúc bậc 2, xoắn α đối xứng, dài 50 – 100 nm, đƣờng kính 9 – 10 nm, đƣợc bao bọc bởi nucleoprotein có bản chất là lipoprotein, tạo thành cấu trúc ribonucleoprotein (RNP) (Hình 1. Mỗi RNP kết hợp với 3 protein enzym polymerase chịu trách nhiệm trong quá trình phiên mã và sao chép RNA của virus. Các phân đoạn của hệ gen virus cúm A nối với nhau bằng các cầu nối peptide tạo dạng vòm tại giới hạn cuối của mỗi phân đoạn và tạo thành một sợi RNA duy nhất có tổng độ dài từ 10kb – 15 kb (tuỳ theo từng chủng virus cúm A), chứa khoảng 13,5 kb thông tin di truyền và có cấu trúc xoắn α bên trong vỏ virus [25]. Bao bọc hạt virus là một lớp vỏ lipid kép có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm đƣợc gắn protein màng của virus, đóng vai trò bảo vệ vật chất di truyền RNA của 3 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn virus.

Bề mặt ngoài của vỏ đƣợc bao phủ bởi các glycoprotein phân bố dày đặc. Mỗi glycoprotein có kích thƣớc dài khoảng 10 – 14 nm, đƣờng kính 4 – 6 nm. Virus cúm có hai loại protein kháng nguyên đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus là haemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA). Các phân tử HA và NA phân bố không đồng đều (cứ 4 – 5 phân tử HA thì có 1 phân tử NA) [25].

Ngoài ra trên bề mặt vỏ còn có protein M2 nằm xuyên qua màng lipit kép và hoạt động nhƣ kênh vận chuyển ion. Xen giữa hạt virus và vỏ là lớp protein nền M1 (matrix).1: Virus cúm A/H1N1 chụp bằng kính hiển vi (A) và hình ảnh mô phỏng cấu trúc ribonucleoprotein (B). Virus cúm A/H1N1 tƣơng đối nhạy cảm với các tác nhân vật lí và hóa học. Nguyên nhân vì lớp vỏ ngoài có bản chất là lớp lipid kép nên dễ bị phá hủy bởi các dung môi hòa tan lipid, chất tẩy rửa và các chất sát trùng.

Các hạt virus tồn tại thích hợp trong khoảng pH từ 6,5 đến 7,9. Virus cúm A dễ dàng bị tiêu diệt hoàn toàn ở 100 o C và ở 60 oC trong 30 phút, bị bất hoạt ở 0 oC trong 30 ngày, chỉ tồn tại trong cơ thể ngƣời trong 7 – 8 ngày. Đặc điểm các phân đoạn gen của virus Virus cúm có hệ gen là RNA sợi đơn âm gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt mang tên từ 1 – 8 theo thứ tự giảm dần của kích thƣớc phân tử, mã hóa tổng hợp cho 11 protein (Hình 1. Trong hệ gen các phân đoạn 1; 2; 3; 5; 7; 8 có độ dài tƣơng đối ổn 4 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn định và có tính bảo thủ cao.

Hai phân đoạn 4 và 6 mã hóa cho các protein bề mặt của virus (HA và NA) có độ dài không ổn định và đặc trƣng theo từng chủng virus [7].2: Mô hình cấu trúc virus cúm A/H1N1.  Phân đoạn 1 có kích thƣớc 2431 bp, mã hóa tổng hợp protein enzym PB2. Enzym này có khối lƣợng phân tử khoảng 84 kDa, là tiểu đơn vị thành phần trong phức hợp enzym polymerase chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã RNA của virus. Tính thích nghi nhiệt độ cơ thể loài vật chủ có liên quan đến vị trí amino axít 627 ở protein PB2.

 Phân đoạn 2 có kích thƣớc 2431 bp, mã hóa tổng hợp enzym PB1. PB1 có khối lƣợng phân tử khoảng 87 kDa, là tiểu đơn vị xúc tác của phức hợp enzym polymerase chịu trách nhiệm gắn mũ RNA trong quá trình tổng hợp RNA virus [5]. Gần đây, các nhà khoa học đã phát hiện thêm một protein PB1 - F2 đƣợc mã hóa bởi một khung đọc mở khác của phân đoạn 2 [24].  Phân đoạn 3 có kích thƣớc 2233 bp, mã hóa tổng hợp protein enzym PA.

PA có khối lƣợng phân tử khoảng 83 kDa, là một tiểu đơn vị của enzym polymerase chịu trách nhiệm kéo dài sự phiên mã RNA trong quá trình tổng hợp RNA của virus. Phân đoạn gen này có tính bảo tồn cao.  Phân đoạn 4 chịu trách nhiệm mã hóa tổng hợp protein HA - kháng nguyên bề mặt virus cúm. Phân đoạn này gồm hai tiểu phần là HA1 và HA2 có độ dài thay đổi tuỳ 5 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn theo từng chủng virus cúm A, ở A/H1N1 là 1778 bp.

Protein HA có khối lƣợng phân tử khoảng 63 kDa, đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus và có khả năng gây ngƣng kết hồng cầu. Vùng nối giữa HA1 và HA2 là một số amino axít mang tính kiềm đƣợc mã hóa bởi một chuỗi oligonucleotide. Vùng này chứa vị trí nhận biết và cắt đặc hiệu của một số enzym protease của vật chủ và là vùng quyết định độc lực của virus [11].  Phân đoạn 5 có kích thƣớc khoảng 1556 bp, mã hóa tổng hợp nucleoprotein (NP).

Protein NP là thành phần của phức hệ phiên mã chịu trách nhiệm vận chuyển RNA giữa nhân và bào tƣơng tế bào chủ, có khối lƣợng phân tử khoảng 56 kDa, tồn tại trong các hạt virus ở dạng kết hợp với mỗi phân đoạn RNA trong hệ gen virus tạo cấu trúc nucleocapsid đối xứng xoắn bền vững.  Phân đoạn 6 mã hóa tổng hợp protein NA - kháng nguyên bề mặt capsid của virus. Chiều dài phân đoạn gen này thay đổi theo từng chủng virus cúm A (ở cúm A/H6N2 là 1413 bp, ở cúm A/H5N1 thay đổi khoảng từ 1350 – 1410 bp). Cùng với kháng nguyên HA, NA đóng vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy sự lây nhiễm của virus trong tế bào vật chủ, giúp quá trình nhân lên của virus diễn ra nhanh hơn và giải phóng hạt virus ra khỏi tế bào bị nhiễm [31].

 Phân đoạn 7 có kích thƣớc khoảng 1027 bp, mã hóa cho protein M của virus gồm hai tiểu phần là M1 và M2 đƣợc dịch mã từ những khung đọc mở khác nhau của cùng một phân đoạn RNA. Protein M1 là protein nền, thành phần chính của virus có chức năng bao bọc RNA tạo nên phức hợp RNP và tham gia vào quá trình nảy chồi của virus [25]. Protein M2 là chuỗi polypeptide có khối lƣợng phân tử là 11 kDa.