ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay trên thế giới có hàng triệu ngƣời mất tích do chiến tranh, thiên tai, tai nạn máy bay… chƣa xác định đƣợc danh tính. Riêng ở Việt Nam, dù chiến tranh đã kết thúc hơn 40 năm, nhƣng hậu quả chiến tranh để lại vô cùng nặng nề. Theo số liệu của Cục Ngƣời có công, Bộ Lao Động, Thƣơng binh và Xã hội có 1,1 triệu liệt sĩ hy sinh có khoảng 500.000 hài cốt liệt sĩ chƣa đƣợc định danh, trong đó hơn 300.000 hài cốt đã đƣợc quy tập và an táng tại các nghĩa trang liệt sĩ và khoảng 200.000 hài cốt chƣa đƣợc quy tập về các nghĩa trang liệt sĩ mà nằm rải rác ở các tỉnh phía Nam, Lào và Campuchia [1][2]. Thông thƣờng, hệ gen nhân cho phép định danh chính xác đến từng cá thể thông qua các đoạn lặp từ 2-6 nucleotide STR (Short Tandem Repeat) trên các locus khác nhau của bộ nhiễm sắc thể.
Tuy nhiên, đối với các mẫu hài cốt lâu năm, các phần mô, xƣơng bị phân hủy mạnh do ảnh hƣởng bởi các điều kiện môi trƣờng (nhiệt độ, UV, pH, các thành phần vô cơ và hệ vi sinh vật), dẫn đến toàn bộ ADN của hệ gen nhân gần nhƣ bị phân hủy hoàn toàn và không có khả năng phân tích. Chính vì vậy, hiện nay, việc giám định hài cốt liệt sĩ hoàn toàn dựa vào phân tích ADN ty thể (Mitochondiral DNA - mtADN), bởi cấu trúc dạng vòng giúp loại ADN này bền hơn dƣới tác động của môi trƣờng [3]. Việc xác định danh tính dựa trên việc so sánh các nucleotide ở vùng siêu biến (HV1, HV2 và HV3) thuộc hệ gen ty thể của hài cốt với thân nhân. Phƣơng pháp giải trình tự ADN ty thể dùng trong giám định đang đƣợc sử dụng ph biến ở Việt Nam hiện nay, cũng nhƣ ở một số phòng thí nghiệm trên thế giới đều dựa trên nguyên lý Sanger.
Ƣu điểm của phƣơng pháp này là dễ thực hiện, giá thành rẻ. Tuy nhiên, giải trình tự Sanger đọc đƣợc ít mẫu, độ lặp lại thấp, chất lƣợng tín hiệu không n định nên gây rất nhiều khó khăn cho việc phân tích các điểm Heteroplasmies và Poly-Cytosine. Hơn nữa, nồng độ ADN sử dụng cho phản ứng giải trình tự bằng phƣơng pháp Sanger tƣơng đối cao (~10 ng/µl) [4]. Do đó, nhằm nâng cao năng suất, độ chính xác cũng nhƣ tận dụng đƣợc các ƣu thế vƣợt trội của hệ thống đọc trình tự thế hệ mới (NGS) trong công 2 tác giám định hài cốt liệt sĩ ở Việt Nam, chúng tôi thực hiện đề tài “Ứng dụng công nghệ giải trình tự thế mới Ion Torrent S5XLTM trong việc giám định hài cốt lâu năm”.
Nghiên cứu này sử dụng bộ kit Precision ID mtADN Control Region Panel (Thermofisher) dựa trên hệ thống giải trình tự thế hệ mới (NGS) IonS5-XL. Thông qua việc sử dụng 14 cặp mồi với các biến thể khác nhau, đã tạo điều kiện thuận lợi cho đọc trình tự 1,2 kb cả 3 vùng HV1, HV2 và HV3. Không những vậy, phƣơng pháp vẫn cho kết quả tối đa từ các mẫu với nồng độ ADN đầu vào chỉ khoảng 2 pg. Với coverage ~ 200x, phƣơng pháp này có thể giải quyết khó khăn khi phân tích các điểm Heteroplasmies and Poly-Cytosine [5].
Đề tài đƣợc thực hiện tại Trung tâm Giám định ADN, Viện Công nghệ Sinh học với hai mục tiêu: 1. Xây dựng quy trình chạy và bước đầu áp dụng phương pháp giải trình tự thế hệ mới (NGS) để giám định ADN hài cốt lâu năm. Phân tích được dữ liệu vùng siêu biến ADN ty thể của các mẫu nghiên cứu từ các kết quả thu được thông qua hệ thống giải trình tự thế hệ mới (NGS). TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ĐẶC ĐIỂM GIẢI PHẪU VÀ MÔ HỌC XƢƠNG 1.1 Thành phần và cấu trúc của bộ xƣơng Bộ xƣơng ngƣời trƣởng thành gồm 206 xƣơng (phần lớn là xƣơng đôi) đƣợc phân thành 3 nhóm chính [6]: Hình 1.1: Bộ xương người (nhìn từ phía trước) [7] + Xƣơng mình gồm có: - Cột sống: có 32 đốt sống, trong đó có 5 đốt sống cùng dính liền nhau tạo nên xƣơng cùng và 3 đốt sống cụt cũng dính liền nhau tạo nên xƣơng cụt (hình 1.
4 - Lồng ngực: Gồm có đoạn cột sống ngực, xƣơng ức và 12 đôi xƣơng sƣờn. + Xƣơng sọ mặt: Gồm 8 xƣơng sọ và 14 xƣơng mặt họp thành hộp sọ và khối xƣơng mặt. + Xƣơng chi trên và xƣơng chi dƣới: Chi trên dính vào thân bởi đai vai (gồm xƣơng đòn và xƣơng vai); Chi dƣới dính vào thân bởi đai chậu (gồm 2 xƣơng chậu dính thẳng vào xƣơng cùng của cột sống). Mỗi chi có 3 đoạn: cánh tay hoặc đùi, cẳng tay hoặc cẳng chân, bàn tay hoặc bàn chân (gồm có c tay hoặc c chân, bàn tay hoặc bàn chân, ngón tay hoặc ngón chân) [6].
Cấu trúc xƣơng đƣợc tạo thành từ hai loại mô xƣơng: xƣơng vò và xƣơng ống Hình 1.2 Cấu trúc xương ống [8] Xƣơng là loại mô liên kết đặc biệt đã bị canxi hóa và có cấu trúc dạng lá. Cấu tạo xƣơng gồm tế bào, chất căn bản và sợi liên kết (chất căn bản và sợi liên kết gọi chung là chất nền ngoại bào xƣơng hay chất nền xƣơng hay chất căn bản xƣơng), chiếm tỷ lệ lớn. Lá xƣơng là đơn vị cấu tạo của mô xƣơng, cấu tạo gồm tế bào xƣơng và chất nền xƣơng [9]. 5 Xƣơng có chức năng chống đỡ và vận động, ngoài ra còn bảo vệ, hỗ trợ quá trình tạo huyết và chuyển hóa phospho-calci.
Mô xƣơng là thành phần quan trọng nhất trong cấu tạo của bộ xƣơng. Về mặt đại thể xƣơng gồm 2 dạng (loại) cấu tạo: - Xƣơng dẹt và đầu của xƣơng dài: gồm có một lớp bên ngoài vững chắc (vỏ xƣơng) bao quanh một mạng lƣới chịu lực hình thành từ lá xƣơng tạo thành một hệ thống vách mỏng không đều đƣợc gọi là bè xƣơng, xếp theo nhiều hƣớng khác nhau và có thể nối với nhau gọi là mô xốp. Giữa các bè có những hốc chứa tủy xƣơng. - Xƣơng dài: Phần thân xƣơng có các lá xƣơng xếp đồng tâm tạo thành những cấu trúc đặc biệt đƣợc gọi là hệ thống Havers.
Mỗi hệ thống có dạng hình trụ, gồm những lá xƣơng xếp vòng, ở chính giữa khối trụ đó là ống Havers chứa mạch máu, mô liên kết. Ở mức độ hiển vi, xƣơng cấu tạo từ vật liệu cứng, đồng nhất, bên trong hoặc xen lẫn giữa chúng là ba loại tế bào đặc trƣng bao gồm: tạo cốt bào, cốt bào và hủy cốt bào. Những tế bào này phân bố đều khắp các bề mặt của xƣơng, tùy thuộc vào trạng thái sinh lý của mô xƣơng (đang trong quá trình hình thành bè xƣơng, khoáng hóa chất nền xƣơng hay sửa chữa).3: Ba loại tế bào xương [6] Tạo cốt bào (osteoblast – nguyên bào xƣơng) là những tế bào đơn nhân chƣa trƣởng thành chịu trách nhiệm cho sự hình thành xƣơng, về sau tự nằm trong xƣơng khi đã tạo ra chất nền xung quanh nó và trở thành cốt bào. Nằm 6 trên bề mặt của giá đỡ tạo xƣơng, chúng tiết osteoid (một loại hỗn hợp các protein) mà sau này bị canxi hóa bằng cách liên kết với hydroxyt apatite (HA - một chất carbon chƣa cân bằng hóa học) để hình thành các bè xƣơng.
Tạo cốt bào cũng sản xuất enzyme tham gia vào quá trình canxi hóa, nhƣ prostaglandin (ức chế hoạt động của hủy cốt bào) hoặc alkaline phosphate (tăng khả năng di động của hủy cốt bào làm tăng hủy xƣơng). Nguồn gốc của chúng là từ một loại tế bào trung mô chƣa biệt hóa gọi là tế bào sinh xƣơng [10]. Chúng có nguồn gốc từ các tạo cốt bào. Hủy cốt bào (osteoclasts) là những tế bào đa nhân lớn, có thể từ 3 đến vài chục nhân, nằm trên vách xƣơng trong một cấu trúc gọi là Howship (hay hố tái hấp thu), trong bào tƣơng có nhiều ti thể, các bào quan khác kém phát triển.
Chúng là tế bào tiêu hủy xƣơng và hủy sụn nhiễm can xi với cƣờng độ cao, đóng vai trò quyết định trong việc tu sửa xƣơng. Các hủy cốt bào có nguồn gốc từ một dòng tế bào đơn nhân (mono bào) đặc biệt trong tủy xƣơng. Thành phần hóa học của xƣơng chứa 70% là chất vô cơ (gồm thành phần vô định hình là muối phốtphát canci [Ca9(PO4)6], và thành phần tinh thể dạng hình que hoặc hình ống là hydroxytapatít - HA) và 30% chất hữu cơ (osteroid) bao gồm chủ yếu collagen loại I, các protein không collagen và các glycoprotein nhƣ: glycosaminoglycan, osteocalcin, osteonectin, ostepontin, sialoprotein xƣơng và các bào quan khác). Xƣơng cứng chắc là do chất nền xƣơng chứa collagen đã bị calci hóa và glycosaminoglycan [11].
Calci hóa collagen ban đầu diễn ra tại các vùng GZ, các tinh thể HA dạng tiểu cầu điền vào các vùng trống và mở rộng dọc theo các kênh trong những sợi giữa các phân tử tropocollagen liền kề. Trong giai đoạn cuối của calci hóa, tinh thể HA phát triển và lấp đầy khoảng giữa các sợi, các ion khoáng thay thế dần các phân tử nƣớc liên kết trên các sợi. Do đó phần lớn các chất khoáng sẽ nằm trong không gian này. Mô xƣơng hoàn toàn trƣởng thành chứa khoảng 46% collagen, 46% HA (hydroxytapatít) và 8% nƣớc [12].
Phân bố ADN trong xƣơng Thời gian tồn tại của mô xƣơng sau khi cơ thể chết phụ thuộc điều kiện môi trƣờng nhƣ chôn trong đất, phơi trực tiếp trong không khí hay ngâm trong nƣớc (mặn hoặc ngọt). Dƣới tác động của các tác nhân, quá trình phân hủy xƣơng diễn ra theo một cơ chế xác định, ví dụ nhƣ trong đất thì xƣơng phân hủy do nấm, vi khuẩn trong đất xâm nhập vào các khe hở màng xƣơng và bắt đầu phân hủy ma trận khoáng, chất nền xƣơng sau một vài năm, trong môi trƣờng nƣớc thì vi khuẩn lam có vai trò quyết định, chúng đẩy nhanh sự phân hủy bằng cách tăng độ xốp của xƣơng. Mặc dù cơ chế phân hủy của mô xƣơng đã đƣợc nghiên cứu rõ ràng nhƣng sự thoái hóa của ADN trong xƣơng theo thời gian, đặc biệt là nguồn gốc và vị trí ADN nằm trong xƣơng lại chƣa đƣợc làm rõ. Hiện nay còn tồn tại nhiều giả thuyết khác nhau, đôi khi trái ngƣợc nhau.
Tuy nhiên, hầu hết các giả thuyết đều thống nhất rằng ADN trong mô xƣơng mới phần lớn có nguồn gốc từ các tế bào xƣơng, còn với các xƣơng lâu năm ADN có nguồn gốc từ ma trận khoáng. Sự tồn tại ADN lâu dài trong xƣơng là nhờ vào ma trận khoáng và quá trình calci hóa đóng vai trò quan trọng trong việc “lƣu trữ, bảo quản” ADN. Đây cũng là cơ sở khoa học của bƣớc decalci (khử khoáng) đƣợc áp dụng trong hầu hết các phƣơng pháp tách chiết ADN từ xƣơng [13].