Tuyển chọn chủng vi khuẩn kháng nấm Fusarium sp. - ĐH Công nghiệp TP.HCM

Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng kháng nấm mốc Fusarium sp gây bệnh trên thực vật, giúp nâng cao hiệu quả phòng trừ sinh học.

• Tác giả: Nguyễn Thị Kim Huệ
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Ngọc Ẩn
• Trường học: Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng kháng nấm mốc Fusarium sp. trên thực vật
• Loại tài liệu: Đề tài nghiên cứu khoa học
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt

I. Tổng quan về tuyển chọn vi khuẩn kháng nấm mốc Fusarium sp

Nấm mốc Fusarium sp. là tác nhân nguy hiểm gây bệnh trên nhiều loại cây trồng nông nghiệp. Chúng gây ra hiện tượng thối rễ, vàng lá và héo rũ mạch dẫn. Bệnh làm giảm năng suất cây trồng nghiêm trọng. Việc lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học để diệt nấm đang gây ô nhiễm môi trường đất và nguồn nước. Thuốc hóa học còn gây hiện tượng kháng thuốc ở vi nấm và tồn dư chất độc trong nông sản. Do đó, việc tìm kiếm giải pháp sinh học an toàn trở nên cấp thiết. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn đối kháng tự nhiên là hướng đi bền vững. Vi khuẩn bản địa trong đất và vùng rễ có khả năng cạnh tranh dinh dưỡng mạnh mẽ. Chúng tiết ra các enzyme phân hủy thành tế bào nấm hoặc hợp chất kháng sinh tự nhiên. Các chủng vi khuẩn như Bacillus hay Pseudomonas thể hiện tiềm năng kiểm soát sinh học vượt trội. Nghiên cứu sàng lọc tập trung vào việc thu thập mẫu đất, phân lập khuẩn thuần và kiểm tra vùng ức chế nấm. Đây là nền tảng quan trọng để phát triển các chế phẩm vi sinh phục vụ canh tác nông nghiệp hữu cơ hiện đại.

1.1. Nguy cơ từ nấm Fusarium đối với nông nghiệp

Nấm Fusarium sp. tồn tại lâu dài trong đất dưới dạng bào tử hậu. Khi gặp điều kiện thuận lợi, sợi nấm xâm nhập qua rễ và phá hủy hệ thống mạch dẫn của cây. Quá trình vận chuyển nước và khoáng chất bị tắc nghẽn hoàn toàn. Cây trồng biểu hiện triệu chứng héo rũ nhanh chóng và chết khô. Nấm còn sản sinh các độc tố mycotoxin nguy hiểm gây hại cho người và vật nuôi khi tiêu thụ nông sản nhiễm bệnh. Việc kiểm soát Fusarium bằng biện pháp canh tác truyền thống gặp nhiều trở ngại lớn do tính bền vững của bào tử nấm trong đất trồng trọt qua nhiều mùa vụ.

1.2. Tiềm năng của vi sinh vật đối kháng bản địa

Hệ vi sinh vật vùng rễ cây trồng chứa nguồn tài nguyên vi khuẩn đối kháng vô cùng phong phú. Các loài trực khuẩn Gram dương và Gram âm có tốc độ sinh trưởng nhanh. Chúng nhanh chóng chiếm lĩnh không gian sống và cạnh tranh nguồn sắt với nấm bệnh thông qua hợp chất siderophore. Bên cạnh đó, vi khuẩn vùng rễ còn kích thích hệ thống miễn dịch tự nhiên của cây trồng. Việc khai thác các chủng vi khuẩn bản địa giúp nâng cao hiệu quả phòng bệnh sinh học, duy trì cân bằng hệ sinh thái đất và giảm thiểu tối đa sự phụ thuộc vào hóa chất nông nghiệp độc hại.

II. Phân tích tác hại và thách thức từ nấm mốc Fusarium sp

Nấm mốc Fusarium sp. tạo ra thách thức lớn đối với nền sản xuất nông nghiệp toàn cầu. Chủng nấm này có phổ ký chủ rất rộng, tấn công từ cây lương thực đến cây ăn trái và rau màu. Khả năng tồn tại dai dẳng của cấu trúc hạch nấm và bào tử trong đất khiến việc xử lý triệt để trở nên vô cùng phức tạp. Đất canh tác nhiễm nấm thường bị suy thoái và giảm năng suất qua từng mùa vụ. Biện pháp luân canh cây trồng chỉ mang lại hiệu quả hạn chế do bào tử nấm có thể ngủ nghỉ nhiều năm. Việc phun thuốc trừ nấm hóa học liên tục dẫn đến suy thoái cấu trúc đất, tiêu diệt cả các vi sinh vật có ích và làm tăng chi phí đầu vào của người nông dân. Hơn nữa, nấm Fusarium có khả năng thích nghi nhanh và hình thành tính kháng thuốc cao. Tình trạng tồn dư hóa chất trong nông sản xuất khẩu cũng gây rào cản thương mại lớn. Do đó, việc chuyển đổi sang phương pháp kiểm soát sinh học bằng vi khuẩn đối kháng là yêu cầu bức thiết của nền nông nghiệp sạch.

2.1. Cơ chế gây bệnh héo rũ mạch dẫn của Fusarium

Nấm Fusarium tấn công trực tiếp vào chóp rễ và các vết thương cơ giới của hệ rễ. Sợi nấm phát triển mạnh trong các mạch gỗ xylem. Chúng ngăn cản dòng vận chuyển nhựa nguyên từ rễ lên thân lá. Đồng thời, nấm tiết ra độc tố fusaric acid làm tổn thương màng tế bào thực vật, gây mất nước nghiêm trọng. Cây trồng xuất hiện hiện tượng héo rũ cục bộ, lá vàng úa từ gốc lên ngọn và thân cây bị thâm đen. Cây suy kiệt và chết rụi chỉ sau một thời gian ngắn nhiễm bệnh nặng nề.

2.2. Hạn chế của các biện pháp phòng trừ hóa học

Thuốc trừ nấm hóa học mang lại tác dụng ức chế nhanh nhưng để lại nhiều hệ lụy tiêu cực. Hóa chất tiêu diệt quần thể vi sinh vật có lợi trong đất, làm phá vỡ cân bằng sinh học tự nhiên. Cấu trúc đất canh tác trở nên chai cứng, bạc màu và suy giảm độ phì nhiêu. Dư lượng hóa chất độc hại ngấm sâu vào nguồn nước ngầm và tích tụ trong nông sản thu hoạch. Áp lực chọn lọc từ thuốc hóa học còn thúc đẩy sự xuất hiện của các biến chủng Fusarium đột biến có khả năng kháng thuốc cao hơn.

III. Phương pháp tuyển chọn vi khuẩn kháng nấm mốc Fusarium sp

Quy trình tuyển chọn vi khuẩn kháng nấm mốc Fusarium sp. đòi hỏi phương pháp nghiên cứu thực nghiệm nghiêm ngặt và chuẩn xác. Các mẫu đất vùng rễ khỏe mạnh được thu thập từ những vùng trồng chuyên canh. Mẫu đất được pha loãng theo nồng độ thích hợp và cấy gạt trên môi trường thạch dinh dưỡng để phân lập vi khuẩn thuần khiết. Các chủng vi khuẩn thu nhận sau đó được kiểm tra khả năng đối kháng với nấm Fusarium qua phương pháp đồng nuôi cấy trên đĩa thạch PDA. Hoạt tính kháng nấm được xác định dựa trên đường kính vòng ức chế sự phát triển của khuẩn ty nấm. Những chủng vi khuẩn có hiệu lực ức chế cao nhất, như LH20, LH31, N9 hay R4, được chọn lọc để khảo sát sâu hơn. Nghiên cứu tiến hành nhuộm Gram, quan sát hình thái khuẩn lạc và phân tích đặc điểm sinh hóa. Bước tiếp theo là đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào như chitinase, protease và glucanase có chức năng phân giải vách nấm. Phương pháp này giúp xác định chính xác những chủng vi khuẩn ưu việt nhất cho ứng dụng thực tiễn.

3.1. Kỹ thuật phân lập và sàng lọc đối kháng in vitro

Kỹ thuật phân lập bắt đầu bằng việc xử lý mẫu đất vùng rễ trong dung dịch đệm vô trùng. Dịch huyền phù được cấy trải đều trên môi trường NA hoặc LB. Các khuẩn lạc có hình thái đặc trưng được cấy truyền nhiều lần để đạt độ thuần khiết cao. Sau đó, thử nghiệm đối kháng in vitro được tiến hành bằng cách đặt đĩa thạch chứa tản nấm Fusarium ở tâm và cấy các chủng vi khuẩn xung quanh. Sau 3 đến 5 ngày ủ ở nhiệt độ phòng, kích thước vùng kháng khuẩn được đo lường chính xác để đánh giá hiệu lực ức chế nấm của từng dòng vi khuẩn thử nghiệm.

3.2. Đánh giá cơ chế sinh hóa và enzyme phân giải nấm

Các chủng vi khuẩn có hoạt tính cao tiếp tục được kiểm tra cơ chế tác động sinh hóa. Vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường thạch bổ sung cơ chất đặc hiệu để phát hiện enzyme ngoại bào. Khả năng sinh chitinase và protease đóng vai trò cốt lõi trong việc phá hủy cấu trúc vách tế bào nấm mốc. Ngoài ra, thử nghiệm sinh hợp chất siderophore giúp xác định khả năng cạnh tranh ion sắt với mầm bệnh. Những chỉ số sinh hóa này là cơ sở khoa học then chốt để tuyển chọn các chủng vi sinh vật đối kháng có tính ổn định và hoạt lực mạnh mẽ nhất.

IV. Kết luận và ứng dụng vi khuẩn đối kháng Fusarium sp

Nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn kháng nấm Fusarium sp. đã mang lại những kết quả khoa học thực tiễn giá trị. Các chủng vi khuẩn ưu tú phân lập từ đất như trực khuẩn Gram dương biểu hiện khả năng ức chế nấm bệnh vượt trội. Hiệu lực đối kháng thể hiện rõ qua đường kính vòng kháng nấm rộng và hoạt tính enzyme phân giải mạnh mẽ. Kết quả này chứng minh tiềm năng to lớn của vi sinh vật bản địa trong việc kiểm soát bệnh cây trồng. Các chủng vi khuẩn tuyển chọn có thể được nhân nuôi sinh khối quy mô lớn để sản xuất chế phẩm sinh học dạng bột hoặc dạng lỏng. Chế phẩm vi sinh ứng dụng trực tiếp vào đất giúp bảo vệ bộ rễ cây trồng ngay từ giai đoạn vườn ươm. Biện pháp này không chỉ ngăn ngừa bệnh thối rễ, héo vàng mà còn cải tạo hệ vi sinh vật đất và kích thích sinh trưởng cây trồng tự nhiên. Ứng dụng rộng rãi chế phẩm sinh học là bước tiến then chốt nhằm thúc đẩy nền nông nghiệp tuần hoàn, an toàn và phát triển bền vững trong tương lai.

4.1. Tiềm năng sản xuất chế phẩm sinh học bảo vệ cây

Các chủng vi khuẩn có hoạt lực đối kháng mạnh được tối ưu hóa điều kiện lên men để thu nhận sinh khối mật độ cao. Sinh khối vi khuẩn được phối trộn với các chất mang hữu cơ như than bùn, bột cám hoặc phụ gia sinh học để tạo chế phẩm thương mại. Chế phẩm sinh học hoàn thiện có hạn sử dụng dài, mật độ bào tử ổn định và dễ dàng hòa tan khi tưới. Khi đưa vào đất canh tác, các tế bào vi khuẩn nhanh chóng định cư quanh vùng rễ, tạo thành hàng rào sinh học bảo vệ cây trước sự xâm nhiễm của nấm mốc Fusarium.

4.2. Định hướng phát triển nông nghiệp hữu cơ bền vững

Sử dụng vi khuẩn đối kháng là giải pháp trọng tâm trong chiến lược quản lý dịch hại tổng hợp IPM. Biện pháp sinh học này giúp bảo vệ môi trường sinh thái, duy trì độ phì của đất và bảo vệ đa dạng sinh học. Nông sản sau thu hoạch đảm bảo an toàn tuyệt đối, không chứa tồn dư thuốc bảo vệ thực vật hóa học độc hại. Đây là tiêu chí quan trọng để đáp ứng các tiêu chuẩn xuất khẩu nông sản khắt khe của thị trường quốc tế. Việc mở rộng ứng dụng vi sinh vật đối kháng góp phần xây dựng nền nông nghiệp xanh bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Người Việt coi trọng nghề nông, minh triết của người Việt coi nông nghiệp là gốc của mọi thứ trong xã hội, „canh nông vi bản‟. Ngày nay nông nghiệp không chỉ giúp ổn định cuộc sống cho phần lớn người nông dân Việt, mà còn là nền tảng cho phát triển kinh tế-xã hội và ổn định chính trị, tạo tiền đề để hiện thực hóa khát vọng công nghiệp hóa, hiện đại hóa đất nước từ một quốc gia có nền nông nghiệp còn chưa phát triển. Bên cạnh đó, Việt Nam nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa, mưa nhiều, độ ẩm cao, đất đai màu mỡ, nguồn nước dồi dào và đa dạng sinh học là những điều kiện quan trọng để sau 40 năm “Đổi mới” thực hiện cải cách kinh tế, ngành nông nghiệp Việt Nam đã phát triển theo hướng thương mại đa dạng, đáp ứng nhu cầu trong nước và thế giới. Những năm gần đây ngành nông nghiệp nước ta đã đạt được những thành tựu to lớn.

Từ một đất nước từng bị nạn đói đe dọa, Việt Nam hiện đứng thứ 2 ở Đông Nam Á và thứ 15 trên toàn cầu về xuất khẩu nông sản [1]. Kim ngạch xuất khẩu nông sản tăng vọt từ 4,2 tỷ đô la Mỹ năm 2004 [2] lên 41,3 tỷ đô la Mỹ năm 2019, chiếm 15,68% tổng kim ngạch xuất khẩu quốc gia [3]. Các nông sản xuất khẩu hàng đầu của Việt Nam là gạo, cà phê, hạt tiêu, chè, hạt điều, cao su, sắn, thủy sản,… [4]. Thị trường xuất khẩu nông sản của Việt Nam chủ yếu là Trung Quốc, Châu Âu, Mỹ, ASEAN, Nhật Bản và Hàn Quốc [5].

Tuy nhiên, trước tác động của biến đổi khí hậu và xu thế cạnh tranh của nền kinh tế thị trường, ngành nông nghiệp Việt Nam cũng gặp không ít khó khăn vì thiên tai, dịch hại do sâu bệnh, nấm bệnh, … đã làm giảm năng suất và chất lượng nông sản. Hiện nay, nấm bệnh xuất hiện ngày càng nhiều ở cây công nghiệp và gây ra những tổn thất to lớn cho sản xuất nông nghiệp. Tính đến năm 2005, thì có khoảng 14% các khoản thiệt hại trên thế giới hoàn toàn là từ các bệnh hại cây trồng gây ra, và hơn 50% các bệnh hại cây trồng là do nấm gây ra với hàng tỷ Euro thiệt hại mỗi năm (Agrios, 2005). Ở Việt Nam, các bệnh do Fusarium sp.

gây ra là vấn đề quan trọng (gây thối dưa hấu, thối củ khoai tây, thối bắp, thối các cây họ đậu. Vì thế các loài nấm Fusarium sp. đã được nghiên cứu từ khoảng đầu thế kỷ XIX. Đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về 3 nấm Fusarium sp.

đã được công bố và có ý nghĩa lớn trong sự phát triển của khoa học kỹ thuật. Một số công trình nghiên cứu như: - Theo Binder và Hutchinson (1959) cà chua bị bệnh héo vàng do nấm Fusarium sp. sẽ chết nhanh và thiệt hại lớn khi cùng bị tuyến trùng (Meloidogine incognita) xâm nhập vì tuyến trùng làm giảm tính chống bệnh của cà chua đối với nấm Fusarium sp. - Theo Nguyễn Văn Viên (1997) cho biết vụ đông xuân 1994 ở Tiên Dương – Đông Anh tỷ lệ cây nhiễm bệnh héo vàng trung bình 4.0%, cà chua trồng trên đất phèn tỷ lệ cây nhiễm bệnh là 5.8%, ở chân đất cao tỷ lệ cây nhiễm bệnh là 2.

Trên môi trường PDA thuốc Benlate 0.1% có tác dụng ức chế sự phát triển của tản nấm Fusarium oxysporum. Tuy nhiên, những công trình nghiên cứu nấm mốc Fusarium sp. vẫn chưa được ứng dụng rộng rãi và chưa đưa lại hiệu quả cao. Vì người nông dân thường sử dụng các loại thuốc bảo vệ thực vật hóa học trong nông nghiệp gây ảnh hưởng tiêu cực đến môi trường, dẫn đến mất cân bằng trong quần thể vi sinh vật đất có ích, tạo môi trường bất lợi đối với các sinh vật có ích phát triển, và tạo điều kiện để nấm bệnh, các loài côn trùng có hại kháng thuốc hơn, đồng thời cũng tiêu diệt các loài thiên địch có ích.

Chính vì vậy, để hạn chế tác hại của dịch bệnh và đảm bảo an toàn cho hệ sinh thái, môi trường và sức khỏe con người thì việc nghiên cứu tạo ra các sản phẩm có nguồn gốc sinh học là rất cần thiết. Hiện nay đã có một số công trình nghiên cứu vi sinh vật có lợi để tiêu diệt bệnh hại ở cây, sử dụng vi khuẩn ức chế nấm gây bệnh là một trong các hướng nghiên cứu mới góp phần bảo vệ năng suất cây trồng và thân thiện với môi trường. Vi khuẩn có nhiều tiềm năng vì sự phong phú, đa dạng và phân bố rộng rãi trong tự nhiên và có khả năng sản sinh các chất kháng nấm mạnh và đó cũng là lý do chúng tôi lựa chọn đề tài nghiên cứu: “Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng kháng nấm mốc Fusarium sp. trên thực vật”.

Mục tiêu nghiên cứu Phân lập và tuyển chọn được các chủng vi khuẩn có khả năng kháng nấm mốc Fusarium sp. trên thực vật. Nội dung nghiên cứu 4  Phân lập các chủng vi khuẩn từ các nguồn khác nhau.  Xác định khả năng đối kháng nấm mốc Fusarium sp.

gây bệnh của các chủng vi sinh vật phân lập được và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có hoạt tính đối kháng mạnh nhất với nấm mốc Fusarium sp.  Khảo sát đặc điểm kháng mốc Fusarium sp. của vi khuẩn trên sự nảy mầm và hệ sợi tơ nấm. Phƣơng pháp nghiên cứu 4.

Phương pháp lấy mẫu  Chọn điểm thu mẫu đất: các mẫu đất được lấy ở những khu vực khác nhau (đất gò cao, khu vực có nhiều gỗ cây bị hoai mục, đất khu vực ẩm ướt, bờ ruộng, khu vực xung quanh chuồng gà, chuồng lợn, …) thuộc 2 tỉnh Bình Dương và Thành phố Hồ Chí Minh.  Cách lấy mẫu: dùng dao lấy khoảng 10-15 g đất ở độ sâu 10-15 cm ở các vị trí trên, cho vào túi nylon đã khử trùng, buộc kín, ghi ngày và vị trí lấy mẫu. Mẫu đất được bảo quản ở 4°C, sau 2 ngày tiến hành phân lập vi khuẩn [6]. Phân lập vi khuẩn từ đất [7] Cân 1 g đất cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nước cất vô trùng (hoặc nước muối sinh lý), mix đều trên máy Vortex.

Tiến hành pha loãng thập phân: dùng pipette vô trùng hút 1 ml dịch đất sang ống nghiệm có chứa 9 ml nước vô trùng và tiếp tục pha loãng đến nồng độ thích hợp. Chọn 3 nồng độ pha loãng liên tiếp 10-3 đến 10-5, hút 0.1 ml chuyển sang đĩa petri chứa môi trường LB agar. Dùng que trang trải đều, đậy đĩa petri, gói lại rồi lật sấp và đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ 30 trong 48 giờ. Chọn các khuẩn lạc đặc trưng, cấy chuyền bằng phương pháp cấy ria cho đến khi có chủng vi khuẩn thuần khiết.

Tiến hành quan sát và phân biệt khuẩn lạc vi khuẩn với các loại vi sinh vật khác. Các chủng vi khuẩn phân lập được giữ giống trong Glycerol 50% ở -80. Quan sát đặc điểm hình thái của vi khuẩn Quan sát đại thể: Vi khuẩn được cấy ria trên môi trường Luria Bertani (LB), ủ ở nhiệt độ phòng, quan sát các đặc điểm về đại thể sau 2 ngày nuôi cấy (kích thước, hình dạng, đặc điểm của bề mặt, rìa, màu sắc khuẩn lạc mặt trên, mặt dưới). 5 Quan sát vi thể: Vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường LB theo phương pháp nhuộm Gram, nhuộm bào tử và quan sát dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần [7].

Sàng lọc, tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng đối kháng với nấm mốc Fusarium sp. Nguyên tắc: Hoạt tính đối kháng của dịch nuôi cấy vi khuẩn đối với nấm Fusarium oxysporum được thể hiện thông qua khả năng ức chế sự lan tơ của nấm bệnh tạo nên vùng ức chế. Cách tiến hành: Nuôi cấy vi khuẩn trong 5 ml môi trường LB broth, lắc 150 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng và thu nhận dịch nuôi cấy. Sau đó, nấm Fusarium sp.

(đường kính d=5 mm) được cấy lên đĩa thạch Potato Glucose Agar (PGA) (cách mép đĩa petri 4 cm) trong 48 giờ ở nhiệt độ phòng. Nhỏ 5 µl dịch vi khuẩn vào môi trường PGA đã cấy nấm bệnh vào phía đối diện vị trí cấy nấm. Để ở nhiệt độ phòng, sau 3 ngày tiến hành kiểm tra kết quả dựa vào kích thước vòng đối kháng [8]. Tỷ lệ phần trăm khả năng vi khuẩn ức chế sự phát triển của nấm Fusarium sp.

(PIRG) được tính như sau [9]: PIRG = x 100 R1: trung bình độ lan của hệ sợi tơ nấm ở đĩa đối chứng. R2: trung bình độ lan của hệ sợi tơ nấm khi nuôi cấy chung với vi khuẩn. Thí nghiệm được bố trí lặp lại 3 lần. Phương pháp khảo sát sự ảnh hưởng của vi khuẩn lên sự nảy mầm của bào tử và sự phát triển của hệ sợi tơ nấm Fusarium sp.

[10] Dịch vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường LB broth ở 24 giờ, nhiệt độ phòng sẽ được ly tâm tốc độ 13,000 rpm ở 4°C trong 10 phút. Lọc qua màng lọc với kích thước lỗ lọc là 0,22 µm để loại bỏ bào tử vi khuẩn. Khảo sát sự tác động của dịch nuôi cấy vi khuẩn lên bào tử nấm Fusarium oxysporum: Nấm F. oxysporum sau 5 ngày cấy trên môi trường PGA sẽ được thu nhận bào tử bằng PGB.

Que cấy vô trùng được sử dụng với mục đích giúp bào tử thoát ra khỏi hệ sợi tơ. Phần dịch huyền phù được thu nhận và ly tâm với tốc 6 độ 5,000 rpm ở 4°C trong 5 phút, thu nhận phần dịch nổi chứa bào tử mốc. Dịch bào tử nấm F. oxysporum với mật độ 106 bào tử/ml sẽ được ủ với dịch vi khuẩn, trong đó lô đối chứng là bào tử nấm F.

oxysporum sẽ được ủ với môi trường LB broth. Quan sát sự phát triển của bào tử nấm F. oxysporum ở 2 nghiệm thức từ 0- 24 giờ dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000X. Sau đó tiến hành đánh giá khả năng tác động của dịch nuôi cấy vi khuẩn lên sự nảy mầm của bào tử nấm Đồng thời cấy trải dịch lên môi trường PGA ủ 48 giờ ở nhiệt độ phòng để xác định số lượng khuẩn lạc nấm mốc phát triển của mẫu có trộn dịch vi khuẩn so với đối chứng.

Phương pháp định danh vi khuẩn Mẫu vi khuẩn được gửi đến Công ty Trách nhiệm hữu hạn Nam Khoa để giải trình tự. Sau khi có trình tự gene của chủng vi khuẩn nghiên cứu, tiến hành xây dựng cây phát sinh loài bằng cách so sánh với các trình tự gene tương đồng trên ngân hàng dữ liệu NCBI. Sắp giống trình tự gene của chủng vi khuẩn nghiên cứu với các trình tự gene tương đồng trên ngân hàng dữ liệu.