Nghiên cứu tổng hợp virút cúm mới A/H5N1 và A/H3N2 tại Đại học Quốc gia Hà Nội

Luận văn thạc sĩ kỹ thuật nghiên cứu tổng hợp virút cúm mới từ virút cúm a h5n1 và a h3n2 bằng kỹ thuật di truyền ngược, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề xuất giải

• Tác giả: Lê Thị Thanh
• Người hướng dẫn: TS. Lê Thị Quỳnh Mai
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Tổng hợp virút cúm mới từ virút cúm A/H5N1 và A/H3N2
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2012
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Khái quát về virút cúm
• 1.2. Hệ gen của virút cúm A
• 1.3. Quá trình nhân lên của virút cúm A
• 1.4. Vai trò của hiện tượng trao đổi và tích hợp vật liệu di truyền trong các vụ đại dịch cúm trên thế giới
• 1.5. Ứng dụng kĩ thuật di truyền ngược tổng hợp virút cúm A
• 1.6. Cơ sở khoa học để thiết kế và thực hiện nghiên cứu
• 1.7. Vấn đề đạo đức và An toàn sinh học trong nghiên cứu
• 2. CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Vật liệu nghiên cứu
• 2.3. Plasmid pHW2000 và hệ thống plasmid chứng dương
• 2.4. Sinh phẩm và hóa chất
• 2.5. Hệ thống cảm nhiễm virút cúm
• 2.6. Trang thiết bị và dụng cụ
• 2.7. Phương pháp nghiên cứu
• 2.7.1. Lựa chọn chủng virút gốc
• 2.7.2. Chuẩn bị vector nhân dòng
• 2.7.3. Chuẩn bị ADN nhân dòng
• 2.7.4. Nhân dòng ADN đích vào plasmid pHW2000
• 2.7.5. Phản ứng xác định trình tự chuỗi nucleotide (sequence)
• 2.7.6. Chuẩn bị plasmid cho quá trình chuyển nhiễm
• 2.7.7. Chuyển nhiễm plasmid vào tế bào
• 2.7.8. Khuếch đại virút
• 2.7.9. Xác định hiệu giá virút
• 2.7.10. Xác định liều gây chết 50% động vật thí nghiệm (LD50)
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. TỔNG HỢP VIRÚT CÚM MỚI TỪ VIRÚT A/H5N1 VÀ A/H3N2
• 3.1.1. Lựa chọn chủng virút gốc
• 3.1.2. Chuẩn bị vector nhân dòng và ADN đích
• 3.1.2.1. Chuẩn bị vector nhân dòng
• 3.1.2.2. Chuẩn bị ADN đích
• 3.1.3. Xây dựng hệ thống chuyển nhiễm plasmid tạo virút cúm
• 3.1.4. Nhân dòng ADN đích
• 3.1.5. Hệ thống chuyển nhiễm tám plasmid tổng hợp virút cúm rg-A/H5N1
• 3.1.6. Tổng hợp virút cúm rg-A/H5N1 từ hệ thống chuyển nhiễm plasmid
• 3.1.7. Hệ gen của virút cúm rg-A/H5N1
• 3.2. Tìm hiểu đặc tính của virút cúm rg-A/H5N1 (gia cầm – người)
• 3.2.1. Khả năng thích ứng của virút rg-A/H5N1 với tế bào MDCK và trứng gà có phôi
• 3.2.2. Định lượng virút rg-A/H5N1 bằng kỹ thuật plaque (tạo đám hoại tử)
• 3.2.3. Khả năng gây bệnh của virút cúm rg-A/H5N1 trên động vật thí nghiệm

Tóm tắt

I. Tổng quan về virút cúm A H5N1 và A H3N2 Những điều cần biết

Virút cúm A/H5N1 và A/H3N2 là hai trong số các chủng virút cúm A gây ra dịch bệnh nghiêm trọng trên toàn cầu. Chúng thuộc họ Orthomyxoviridae và có khả năng lây lan nhanh chóng. Virút cúm A/H5N1 thường lây nhiễm từ gia cầm sang người, trong khi A/H3N2 chủ yếu lây lan giữa người với người. Sự hiểu biết về đặc điểm, cấu trúc và cơ chế lây nhiễm của hai loại virút này là rất quan trọng trong việc phát triển các biện pháp phòng ngừa và điều trị hiệu quả.

1.1. Đặc điểm cấu trúc của virút cúm A H5N1 và A H3N2

Virút cúm A có cấu trúc phức tạp với hệ gen ARN phân đoạn. Virút A/H5N1 và A/H3N2 đều có hai glycoprotein bề mặt quan trọng là haemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA). HA giúp virút bám vào tế bào chủ, trong khi NA giúp giải phóng virút mới ra khỏi tế bào. Sự thay đổi trong cấu trúc của HA và NA có thể dẫn đến sự xuất hiện của các chủng virút mới, gây ra dịch bệnh.

1.2. Tình hình dịch cúm A H5N1 và A H3N2 trên thế giới

Tình hình dịch cúm A/H5N1 và A/H3N2 đã gây ra nhiều lo ngại trên toàn cầu. Các đợt bùng phát dịch cúm A/H5N1 thường xảy ra ở các khu vực có chăn nuôi gia cầm lớn, trong khi A/H3N2 thường xuất hiện theo mùa. Việc theo dõi và kiểm soát sự lây lan của các chủng virút này là rất cần thiết để bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

II. Vấn đề và thách thức trong việc kiểm soát virút cúm A H5N1 và A H3N2

Việc kiểm soát virút cúm A/H5N1 và A/H3N2 gặp nhiều thách thức. Sự biến đổi gen của virút khiến cho việc phát triển vaccine trở nên khó khăn. Ngoài ra, việc lây lan nhanh chóng của virút trong cộng đồng cũng làm tăng nguy cơ bùng phát dịch. Các biện pháp phòng ngừa như tiêm vaccine và theo dõi sức khỏe cộng đồng là rất cần thiết để giảm thiểu tác động của dịch bệnh.

2.1. Khó khăn trong việc phát triển vaccine cúm A H5N1 và A H3N2

Phát triển vaccine cho virút cúm A/H5N1 và A/H3N2 gặp nhiều khó khăn do sự biến đổi gen liên tục của virút. Vaccine cần phải được cập nhật thường xuyên để đảm bảo hiệu quả. Hơn nữa, sự khác biệt trong phản ứng miễn dịch giữa các cá nhân cũng làm cho việc phát triển vaccine trở nên phức tạp.

2.2. Tác động của dịch cúm đến sức khỏe cộng đồng

Dịch cúm A/H5N1 và A/H3N2 có thể gây ra các triệu chứng nghiêm trọng, thậm chí tử vong. Sự lây lan nhanh chóng của virút trong cộng đồng có thể dẫn đến tình trạng quá tải cho hệ thống y tế. Việc nâng cao nhận thức và giáo dục cộng đồng về phòng ngừa cúm là rất quan trọng.

III. Phương pháp nghiên cứu và giải pháp phòng ngừa virút cúm A H5N1 và A H3N2

Nghiên cứu về virút cúm A/H5N1 và A/H3N2 đã áp dụng nhiều phương pháp hiện đại, bao gồm kỹ thuật di truyền ngược. Phương pháp này cho phép tổng hợp các chủng virút mới để nghiên cứu tính chất và khả năng gây bệnh. Các giải pháp phòng ngừa như tiêm vaccine và theo dõi dịch tễ học cũng được triển khai để kiểm soát sự lây lan của virút.

3.1. Kỹ thuật di truyền ngược trong nghiên cứu virút cúm

Kỹ thuật di truyền ngược cho phép các nhà nghiên cứu tạo ra các chủng virút cúm mới với đặc điểm gen mong muốn. Phương pháp này giúp hiểu rõ hơn về cơ chế gây bệnh và khả năng lây lan của virút, từ đó phát triển các biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

3.2. Các biện pháp phòng ngừa hiệu quả đối với virút cúm

Các biện pháp phòng ngừa như tiêm vaccine, rửa tay thường xuyên và đeo khẩu trang là rất quan trọng trong việc ngăn chặn sự lây lan của virút cúm. Ngoài ra, việc theo dõi sức khỏe cộng đồng và phát hiện sớm các trường hợp nhiễm bệnh cũng giúp giảm thiểu tác động của dịch bệnh.

IV. Ứng dụng thực tiễn và kết quả nghiên cứu về virút cúm A H5N1 và A H3N2

Nghiên cứu về virút cúm A/H5N1 và A/H3N2 đã mang lại nhiều kết quả quan trọng trong việc hiểu rõ hơn về đặc tính của virút. Các ứng dụng thực tiễn từ nghiên cứu này bao gồm phát triển vaccine và các biện pháp phòng ngừa hiệu quả. Việc áp dụng các kết quả nghiên cứu vào thực tiễn sẽ giúp giảm thiểu tác động của dịch bệnh.

4.1. Kết quả nghiên cứu về virút cúm A H5N1

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng virút cúm A/H5N1 có khả năng lây nhiễm cao từ gia cầm sang người. Các đặc tính di truyền của virút này cũng đã được xác định, giúp phát triển các vaccine hiệu quả hơn.

4.2. Ứng dụng vaccine cúm A H3N2 trong phòng ngừa dịch bệnh

Vaccine cúm A/H3N2 đã được phát triển và áp dụng rộng rãi. Việc tiêm vaccine đã giúp giảm thiểu số ca mắc cúm và ngăn chặn sự lây lan của virút trong cộng đồng.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu virút cúm A H5N1 và A H3N2

Nghiên cứu về virút cúm A/H5N1 và A/H3N2 vẫn đang tiếp tục phát triển. Các phương pháp mới và công nghệ hiện đại sẽ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế gây bệnh và khả năng lây lan của virút. Tương lai của nghiên cứu này sẽ đóng vai trò quan trọng trong việc phát triển các biện pháp phòng ngừa và điều trị hiệu quả.

5.1. Tương lai của vaccine cúm A H5N1 và A H3N2

Tương lai của vaccine cúm A/H5N1 và A/H3N2 sẽ phụ thuộc vào khả năng phát hiện và ứng phó với các biến thể mới của virút. Việc nghiên cứu và phát triển vaccine cần được tiếp tục để đảm bảo hiệu quả trong việc phòng ngừa dịch bệnh.

5.2. Vai trò của nghiên cứu trong việc kiểm soát dịch cúm

Nghiên cứu về virút cúm A/H5N1 và A/H3N2 sẽ tiếp tục đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát dịch bệnh. Các kết quả nghiên cứu sẽ giúp xây dựng các chiến lược phòng ngừa và điều trị hiệu quả hơn trong tương lai.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Trong lịch sử y học, các đại dịch cúm xảy ra đều có căn nguyên là virút cúm A (Infuenza A virus). Virút cúm gây đại dịch / dịch là do có sự thay đổi đặc tính kháng nguyên. Sự thay đổi này có thể theo kiểu biến thể kháng nguyên (antigenic drift) do đột biến ngẫu nhiên xảy ra ở gen mã hóa cho haemagglutinin (HA) hoặc hoán vị kháng nguyên (antigenic shift) [3] do trao đổi và tích hợp di truyền (reassortment) giữa các chủng virút cúm khác nhau. Từ đầu thế kỷ XX đến nay đã có 5 đại dịch cúm được ghi nhận, trong đó 3 đại dịch (các năm 1957, 1968 và 2009) xảy ra do xuất hiện virut cúm mới nhờ hiện tượng trao đổi và tích hợp di truyền [2, 7, 14, 17, 25].

Trao đổi và tích hợp vật liệu di truyền (reassortment) là một trong những đặc điểm của virút cúm A. Nhờ đó, khi có hai hay nhiều chủng virút, khác biệt về mặt di truyền, cùng lúc xâm nhiễm vào một tế bào sẽ tạo ra chủng virút mới có cấu trúc hệ gen pha trộn giữa hệ gen virút “bố” và “mẹ” chúng. Virút mới (đặc tính kháng nguyên mới) sẽ kháng lại kháng thể đã được hình thành trong đáp ứng miễn dịch lần trước và có khả năng lây nhiễm vào vật chủ mới mà chủng “bố - mẹ” chúng không có khả năng gây nhiễm. Chủng virút mới có thể là nguyên nhân gây dịch / đại dịch cúm [3].

Ở Việt Nam, ngoài các phân típ virút cúm A lưu hành ở người theo mùa (A/H3N2, A/H1N1) đã ghi nhận nhiều bệnh nhân nhiễm virút cúm gia cầm độc lực cao H5N1 (HPAI H5N1) [10, 12]. Sự xuất hiện virút cúm A/H5N1 thường xuyên trong đàn gia cầm cùng với tập quán chăn nuôi gia cầm tại hộ gia đình của người Việt Nam có thể sẽ làm tăng nguy cơ trao đổi và tích hợp di truyền giữa virút cúm gia cầm và virút cúm người. Ngoài ra, tần suất thay đổi đặc tính kháng nguyên của virút cúm A/H3N2 (4 lần) nhiều hơn so với virút cúm A/H1N1 (2 lần) tại miền Bắc Việt nam (giai đoạn 2001-2008) [1,31], cho phép nghĩ đến khả năng dễ trao đổi và tích hợp giữa virút cúm A/H3N2 với virút cúm A khác khi có điều kiện thuận lợi. 1 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Trên cơ sở tiến bộ khoa học trong lĩnh vực sinh học phân tử, rất nhiều các phương pháp mới đã được áp dụng trong nghiên cứu virút cúm, một trong số đó là di truyền ngược (reverse genetic).

Kỹ thuật di truyền ngược cho phép chủ động tổng hợp virút cúm có đặc điểm hệ gen mong muốn nhằm tìm hiểu khả năng xuất hiện trong tự nhiên, khả năng gây bệnh cho người của virut này, từ đó chủ động xây dựng các biện pháp phòng chống hữu hiệu. Trên thế giới, di truyền ngược đã được áp dụng nhiều trong việc nghiên cứu độc lực virút cũng như phát triển vaccine cúm [30, 38, 45, 48, 51]. Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài nghiên cứu: “Tổng hợp virút cúm mới từ virút cúm A/H5N1 và A/H3N2 bằng kỹ thuật di truyền ngƣợc” với mục đích: 1. Xây dựng hệ thống chuyển nhiễm plasmid có khả năng tạo virút cúm A.

Tổng hợp virút cúm mới từ virút cúm A/H5N1 (cúm gia cầm) và A/H3N2 (cúm người) bằng hệ thống chuyển nhiễm plasmid. Tìm hiểu đặc tính cơ bản của virút cúm mới. 2 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Chƣơng 1 - TỔNG QUAN 1. Khái quát về virút cúm Đặc điểm chung Họ Orthomyxoviridae gồm năm chi: virút cúm A, virút cúm B, virút cúm C, virút Isa và virút Thogoto [21].

Virút cúm A lưu hành phổ biến trên người, gia cầm, chim hoang dại và một số động vật khác như lợn, ngựa, hải cẩu…, là căn nguyên gây các đại dịch cúm trên toàn cầu. Virút cúm B và C lưu hành chủ yếu ở người và thường chỉ gây nên các vụ dịch vừa và nhỏ. Virút cúm A được chia thành các phân típ (subtype) dựa trên hai glycoprotein bề mặt là haemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA). HA được chia thành 16 phân típ (từ H1 đến H16) và NA được chia thành 9 phân típ (từ N1 đến N9).

Các loài chim thủy sinh là ổ chứa tự nhiên của tất cả các phân típ virút cúm A. Các phân típ gây bệnh cho người chủ yếu là H1, H2, H3 và N1, N2 [5]. Danh pháp quốc tế được quy định cho virút cúm gồm những thông tin sau: típ virút/viết tắt vật chủ (nếu là động vật)/nơi phân lập/mã số phòng thí nghiệm phân lập/năm phân lập. Với virút cúm A, có thể bao gồm thêm thông tin về phân típ HA và NA của chủng virút [53].

Ví dụ: A/swine/Taiwan/l/70 (H3N2). Hình thái và cấu trúc virion virút cúm Virion virút cúm đa hình, có thể hình cầu, hình trứng hoặc đôi khi có hình sợi kéo dài tới 2000 nm, đường kính trung bình từ 80-120 nm. 3 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail. Mô hình cấu trúc virion virút cúm Nguồn: http://www.com/nrg/journal/v8/n3/full/nrg2053.html [36] [20] Virút cúm có hệ gen là ARN đơn, âm, phân đoạn.

Mỗi sợi ARN liên kết với các protein NP, PA, PB1, PB2 để tạo thành phức hệ ribonucleoprotein (vRNP) (mô hình a hoặc b hình 1.1) có chức năng sao chép và phiên mã. Phức hệ này được bao bọc bởi màng protein nền và lớp vỏ ngoài có nguồn gốc từ màng sinh chất tế bào chủ. Trên vỏ có 2 gai glycoprotein là haemagglutinnin và neuraminidase. Hệ gen của virút cúm A Hệ gen virút cúm A gồm tám phân đoạn ARN có chiều dài không giống nhau, đoạn ngắn nhất là 890 nucleotide (phân đoạn 8) và đoạn dài nhất là 2341 nucleotide (phân đoạn 1 và 2).

Trên tám phân đoạn ARN của virút cúm đều có những trình tự nucleotide bảo tồn. Đầu tận cùng của tất cả các đoạn ARN đều có chung một trình tự gồm 13 nucleotide ở đầu 5’ và một trình tự gồm 12 nucleotide ở đầu 3’. Hai vùng bảo tồn này có trình tự ngược nhau và bổ sung một phần cho nhau. Đặc điểm này có vai trò trong quá trình phiên mã và sao chép ARN: polymerase có thể nhận biết trình tự bảo tồn ở đầu 3’của sợi ARN(-) và ở đầu 3’của sợi ARN(+) để khởi đầu quá trình tổng hợp.

Một trình tự phổ biến thứ ba có ở cả tám phân đoạn ARN là trình tự uridine cách đầu 4 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] 5’ khoảng 15-21 nucleotide, đây là tín hiệu khởi đầu cho quá trình gắn chuỗi polyA trong quá trình tổng hợp sợi ARN thông tin [27, 33, 52]. Các phân đoạn ARN và protein của virút cúm A [8, 9, 24, 26]. Phân đoạn Nucleotide Protein Axit amin ARN 1 2341 Polymerase cơ bản 2 (PB2) 759 Polymerase cơ bản 1 (PB1) 757 2 2341 PB1 – F2 87 / 90 3 2233 Polymerase acid (PA) 716 4 1778 Haemagglutinin (HA) 566 5 1565 Nucleoprotein (NP) 498 6 1413 Neuraminidase (NA) 454 Protein matrix 1 (M1) 252 7 1027 Protein matrix 2 (M2) 97 Protein không cấu trúc (NS1) 230 8 890 Protein không cấu trúc (NS2) 121 5 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Phân đoạn 1, 2 và 3: protein PB2, PB1, PB1-F2 và PA Phân đoạn ARN 1, 2 và 3 mã hóa cho các protein PB2, PB1, PB1-F2 và PA. Phân đoạn ARN 1 và 2 có chiều dài 2341 nucleotide.

Phân đoạn 1 mã hóa cho protein tương ứng gồm 759 axit amin; phân đoạn 2 mã hóa cho hai protein là PB1 gồm 757 axit amin và PB1-F2 (87 hoặc 90 axit amin) [8, 26]. Phân đoạn 3 có chiều dài 2233 nucleotide và mã hóa cho protein gồm 716 axit amin. Kết quả từ một số nghiên cứu in vitro về quá trình phiên mã và sao chép ARN đã gợi ý rằng PB2 tham gia vào quá trình tổng hợp ARN thông tin, gắn vào cấu trúc mũ của ARN thông tin của tế bào chủ; PA liên quan đến quá trình tổng hợp sợi ARN virút (vRNA); PB1 có vai trò khởi đầu quá trình sao chép; PB1-F2 làm chết các tế bào miễn dịch đáp ứng quá trình nhiễm virút [8]. Phân đoạn 4: Hemagglutinin (HA) HA là một glycoprotein gắn trên màng virút, có vai trò trong quá trình hấp phụ và xâm nhập vào tế bào của virút.

Tên gọi của protein này bắt nguồn từ khả năng ngưng kết hồng cầu bằng cách gắn vào glycoprotein đặc hiệu chứa acid neuraminic trên bề mặt tế bào hồng cầu. HA là kháng nguyên virút quan trọng nhất chống lại các kháng thể trung hòa, sự thay đổi về tính kháng nguyên của HA là nhân tố tạo thành vụ dịch cúm. Chuỗi polypeptide HA tiền thân (HA0) có thể tạo thành hai chuỗi polypeptide HA1 và HA2 nếu liên kết disµlfide bị cắt. Sự phân cắt này không ảnh hưởng đến hoạt tính gắn vào thụ cảm thể mà ảnh hưởng đến quá trình dung hợp với màng tế bào để virút xâm nhập vào tế bào vật chủ.

HA1 chứa phần tận cùng N của HA, HA2 chứa phần tận cùng C, là vùng kị nước, gắn vào màng virút và có tính bảo tồn cao giữa các chủng virút. HA2 được cho rằng có vai trò giúp virút xâm nhập vào tế bào. Phân đoạn ARN 4 dài 1765 nucleotide, HA1 gồm 328 axit amin, HA2 gồm 221 axit amin. 6 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Phân đoạn 5: protein nucleocapsid (NP) Protein NP tương tác không chỉ với chính nó và ARN trong phức hệ nucleocapsid mà còn tương tác với các protein PB2, PB1 và PA để hình thành đơn vị sao chép.

Phân đoạn 5 có chiều dài 1565 nucleotidetide, chuỗi polypeptide gồm 498 axit amin. Nucleoprotein có vai trò bảo vệ vRNA khỏi sự phân huỷ của các enzyme phân huỷ ribonucleotide (ribonuclease). Phân đoạn 6: Neuraminidase (NA) Phân đoạn 6 mã hóa cho neuraminidase - protein gắn màng. Neuraminidase sẽ phân cắt liên kết glycosidic gắn với nhóm keto của acid N-acetylneuraminic (acid sialic) thành D-galactose hoặc D-galactosamine.

NA có dạng hình nấm, gồm 4 chuỗi polypeptide giống nhau, gắn với nhau bằng liên kết disµlfide. Trong quá trình nhân lên của virút, NA giúp giải phóng các hạt virút đang nảy chồi ra khỏi màng tế bào vật chủ. NA có thể cũng giúp bộc lộ vị trí phân cắt của phân tử HA. Hoạt tính neuraminidase cũng cho phép virút tránh các sialoglycoprotein ức chế có mặt trong đường hô hấp, cho phép virút tìm đường đến các tế bào biểu mô đích.

Kháng thể kháng NA không trung hòa hoạt tính lây nhiễm của virút mà hạn chế chu trình nhân lên của virút và làm suy giảm triệu chứng bệnh. Trình tự nucleotide của đoạn ARN 6, với phân típ N1 và N2, có chiều dài 1413 nucleotide, protein gồm 453 axit amin. Phân đoạn 7: protein M1 và M2 Phân đoạn 7 mã hóa cho hai protein là M1, M2 và có thể protein thứ ba là M3.