Tổng quan luận án

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Trong lĩnh vực y dược hiện đại, phần lớn các hoạt chất điều trị ung thư và các hợp chất hữu cơ có hoạt tính sinh học cao đều gặp phải rào cản lớn về độ hòa tan kém trong môi trường nước, dẫn đến sinh khả dụng đường uống hoặc đường tiêm thấp. Bên cạnh đó, khi đưa vào cơ thể qua hệ tuần hoàn, các phân tử thuốc phân bố không chọn lọc trên toàn bộ cơ thể, gây ra độc tính tế bào nghiêm trọng và tác dụng phụ bất lợi lên các mô và tế bào lành.

Để khắc phục những nhược điểm này, các hệ dẫn truyền thuốc kích thước nano (như liposome, micelle polymer, dendrimer) đã được nghiên cứu và phát triển. Tuy nhiên, các hệ hạt nano truyền thống vẫn tồn tại các hạn chế kỹ thuật:

  • Micelle polymer: Độ bền cấu trúc trong môi trường nước thấp, dễ bị phân ly khi pha loãng trong máu, dung lượng tải thuốc hạn chế.
  • Liposome: Kém ổn định trong môi trường sinh lý, hiệu quả mang thuốc thấp, độ bền trong huyết tương kém và khó bảo quản lâu dài.
  • Dendrimer: Thường có độc tính nội tại cao và quy trình giải phóng thuốc/axit nucleic gặp nhiều khó khăn.

Hệ vật liệu nanogel (mạng lưới hydrogel liên kết chéo kích thước nano) nổi lên như một giải pháp dung hòa nhờ khả năng trương nở linh hoạt, kiểm soát tốc độ giải phóng dược chất và khả năng mang đồng thời nhiều hoạt chất có tính chất kỵ nước hoặc ưa nước khác nhau. Gelatin là một polymer tự nhiên, tương thích sinh học cao, có khả năng tích điện lưỡng tính và mang các peptide kích thích bám dính tế bào, trong khi các pluronic (PEO-PPO-PEO) là các chất hoạt động bề mặt polymer có khả năng tự lắp ráp tạo lõi kỵ nước. Việc kết hợp ghép cấu trúc gelatin với pluronic nhằm tận dụng ưu điểm của cả hai loại polymer, kết hợp thêm phối tử hướng đích axit folic (FA) để tạo hệ nanogel mang đồng thời hoạt chất tự nhiên quercetin (QU) và thuốc hóa trị paclitaxel (PTX), là hướng đi cấp thiết giải quyết bài toán nâng cao hiệu quả trị liệu và giảm độc tính trong điều trị ung thư.

Mục tiêu nghiên cứu

Luận án xác định mục tiêu tổng quát là nghiên cứu tổng hợp hệ vật liệu nanogel dẫn truyền thuốc trên cơ sở copolymer gelatin ghép với các loại pluronic khác nhau; gắn phối tử hướng đích axit folic (FA); khảo sát khả năng nang hóa, động học nhả chậm quercetin và paclitaxel; đánh giá hoạt tính tiêu diệt tế bào ung thư trên mô hình in vitro và hiệu quả ức chế khối u trên mô hình động vật in vivo.

Để hiện thực hóa mục tiêu trên, luận án triển khai 6 nội dung nghiên cứu cụ thể:

  1. Nội dung 1: Tổng hợp các copolymer trên cơ sở gelatin ghép với các Pluronic P123, F127, F87 và F68 với các tỷ lệ ghép khác nhau, tìm tỷ lệ ghép tối ưu, sau đó tiến hành gắn tác nhân hướng đích axit folic.
  2. Nội dung 2: Đánh giá cấu trúc hóa học, kích thước hạt, nồng độ tạo micelle tới hạn (CMC/CGC), điện tích bề mặt (thế Zeta) và hiệu suất tổng hợp copolymer.
  3. Nội dung 3: Khảo sát khả năng nang hóa quercetin (QU) và paclitaxel (PTX) của các hệ nanogel, lựa chọn hệ vật liệu tối ưu cho các thử nghiệm tiếp theo.
  4. Nội dung 4: Đánh giá khả năng và động học giải phóng thuốc của các hệ nanogel tổng hợp được trong dung dịch đệm PBS ở các điều kiện môi trường mô phỏng sinh lý (pH = 7,4 và pH = 5,5 ở nhiệt độ 37 °C).
  5. Nội dung 5: Đánh giá in vitro tính tương thích sinh học và hiệu quả ức chế/tiêu diệt tế bào ung thư của hệ nanogel mang thuốc.
  6. Nội dung 6: Đánh giá in vivo hiệu quả tiêu diệt khối u ung thư của hệ nanogel mang thuốc trên mô hình chuột suy giảm miễn dịch mang khối u dị loài.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu:
    • Vật liệu polymer nền: Gelatin và các pluronic (F127, P123, F87, F68).
    • Tác nhân chức năng hóa và hướng đích: Axit folic (FA), p-nitrophenyl chloroformate (NPC), EDC, NHS, 3-amino-1-propanol.
    • Hoạt chất mang: Quercetin (QU) và Paclitaxel (PTX).
    • Dòng tế bào khảo sát: Dòng tế bào ung thư vú người MCF-7, dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa và dòng tế bào thường.
    • Động vật thí nghiệm: Chuột suy giảm miễn dịch mang khối u ghép dị loài MCF-7.
  • Phạm vi không gian và thời gian: Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng Hóa dược – Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam tại TP. Hồ Chí Minh, hoàn thành và bảo vệ năm 2022.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu tiền đề

Luận án đã hệ thống hóa các nghiên cứu trong nước và quốc tế liên quan đến kỹ thuật tạo hạt nano gelatin, biến tính polymer và hệ dẫn truyền thuốc:

  • Phương pháp tạo hạt nano gelatin: Coester và cộng sự phát triển phương pháp desolvat hai bước giúp kiểm soát khối lượng phân tử gelatin; Ofokansi và cộng sự cải tiến phương pháp desolvat một bước ở pH 7,0 và 37 °C; phương pháp tạo nhũ bốc hơi dung môi (W/O) sử dụng chất tạo liên kết ngang GA hoặc genipin; phương pháp tạo nhũ pha đảo sử dụng chất hoạt động bề mặt AOT trong n-hexan được khảo sát bởi Gupta và cộng sự; phương pháp kết tủa nano sử dụng poloxamer làm chất ổn định.
  • Biến tính gelatin tự lắp ráp: Kim và Byun nghiên cứu hạt nano dạng nanosphere bằng phản ứng ghép deoxycholic acid (DOCA) và MPEG lên nhóm amin của gelatin qua tác nhân DCC; Tanigo và cộng sự sử dụng micelle gelatin ghép L-lactic acid oligomer để mang simvastatin; Bajpai và Choubey khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất tạo liên kết ngang GA đến tốc độ nhả cytarabine; Leo và cộng sự khảo sát giải phóng DOX từ hạt nano gelatin dưới tác động của enzyme trypsin.
  • Các yếu tố ảnh hưởng tính chất hạt nano: Nahar và cộng sự phân tích ảnh hưởng của nồng độ GA, nhiệt độ và pH đến kích thước hạt mang amphotericin B; Azarmi và cộng sự so sánh tác nhân desolvat aceton và ethanol; Zillies và cộng sự ứng dụng trehalose làm chất bảo vệ đông khô cho hạt nano gelatin mang oligonucleotide.
  • Hệ hydrogel gelatin nhả chậm: Chung-Kai Sun và cộng sự điều chế hydrogel gelatin-alginate liên kết ngang bằng transglutaminase (TGase) mang Gentamicin và Vancomycin; Carolina Hermida-Merino và cộng sự tổng hợp hydrogel từ gelatin da cá ngừ mang Crocin và DOX.
  • Nghiên cứu về Pluronic: Abhishiek Sahu và cộng sự sử dụng Pluronic F127 và F68 để nang hóa curcumin; Hoffman (1997) đề xuất giải pháp ghép pluronic với các polymer có tính kết dính sinh học để cải thiện độ bền cơ học.
  • Nghiên cứu về Quercetin và Paclitaxel: Nutsarun Wangsawangrung và cộng sự nang hóa quercetin bằng hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HP-β-CD); Hoon Hyun và cộng sự phát triển hydrogel methacrylated glycol chitosan gắn β-cyclodextrin và axit folic mang paclitaxel; Line Aanerud Omtvedt và cộng sự phát triển hệ mang PTX dựa trên alginate gắn β-cyclodextrin.
  • Nghiên cứu về phối tử Folic Acid (FA): Eugen Barbu và cộng sự phát triển hệ ToCNF-FA/DOX trên tế bào MCF-7; Fatma Nur Parın và cộng sự nghiên cứu hệ mang kiểm soát giải phóng FA; Sang Hoon Lee và cộng sự phát triển hệ hạt FA-aminoclay (FA-AC) mang kháng thể infliximab.

Vị trí và khoảng trống nghiên cứu của luận án

Mặc dù gelatin và pluronic đã được nghiên cứu riêng lẻ hoặc trong một số dạng phối hợp, các hạn chế về độ bền cấu trúc, sự kiểm soát tỷ lệ ghép tối ưu giữa chuỗi peptide của gelatin với từng loại pluronic có tỷ lệ khối ưa/kỵ nước khác nhau (P123, F127, F87, F68) vẫn chưa được làm sáng tỏ toàn diện. Đặc biệt, việc kết hợp đồng thời tác nhân hướng đích folate (FA) lên khung copolymer gelatin-pluronic để tạo thành hạt nanogel lưỡng chức năng, có khả năng đồng mang một hoạt chất polyphenol tự nhiên (Quercetin) và một thuốc hóa trị kỵ nước mạnh (Paclitaxel) nhằm tạo hiệu ứng hiệp đồng và đánh giá chi tiết từ cấu trúc phân tử đến thử nghiệm in vivo trên khối u dị loài, chính là khoảng trống khoa học mà luận án đã giải quyết.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết

  1. Polymer Gelatin: Là chuỗi polypeptide có nguồn gốc từ thủy phân collagen, chứa các gốc axit amin có nhóm chức phân cực (-COOH, -$NH_2$), có tính chất lưỡng tính (ion Zwitter: $^+NH_3-CH_2-COO^-$) với điểm đẳng điện pI phụ thuộc vào phương pháp xử lý (Loại A: pI = 7,5–9,0 từ da heo; Loại B: pI = 4,8–5,2 từ xương/da bò). Gelatin chứa trình tự peptide Arg-Gly-Asp (RGD) thúc đẩy bám dính tế bào và có khả năng phân hủy sinh học dưới tác động của enzyme protease.
  2. Copolymer khối Pluronic (Poloxamer): Cấu trúc đối xứng bậc ba $PEO_x-PPO_y-PEO_x$, gồm các khối poly(ethylene oxide) ưa nước và poly(propylene oxide) kỵ nước. Đặc trưng nhiệt động học của Pluronic là khả năng tự tập hợp tạo micelle trong môi trường nước khi vượt qua nồng độ tạo micelle tới hạn (CMC) và nhiệt độ tạo micelle tới hạn (CMT).
Pluronic Trạng thái Tổng số nhóm PEO ($2x$) Tổng số nhóm PPO ($y$) Giá trị HLB Khối lượng phân tử (Da) Nồng độ CMC (M)
L121 Lỏng 10,00 68,28 1 4400 $1,0 \times 10^{-6}$
L61 Lỏng 4,55 31,03 3 1950 $1,1 \times 10^{-4}$
P123 Hồ keo 39,20 69,40 8 5750 $4,4 \times 10^{-6}$
P105 Hồ keo 73,86 56,03 15 6500 $6,2 \times 10^{-6}$
F127 Rắn 200,45 65,17 22 12600 $2,8 \times 10^{-6}$
F87 Rắn 122,50 39,83 24 7700 $9,1 \times 10^{-5}$
F68 Rắn 152,73 28,97 29 8400 $4,8 \times 10^{-4}$
  1. Cơ chế tác dụng của Quercetin và Paclitaxel:
    • Quercetin (QU): 3,3',4',5,7-pentahydroxyflavone, có khả năng chống oxy hóa, can thiệp vào chu kỳ tế bào và kích hoạt con đường tự chết apoptosis qua ty thể thông qua việc phá vỡ điện thế màng ty thể (MMP), giải phóng cytochrome C và hoạt hóa caspase-3, caspase-7.
    • Paclitaxel (PTX): Hoạt chất gắn đặc hiệu vào tiểu đơn vị $\beta$-tubulin của vi ống, ngăn cản quá trình tháo gỡ vi ống, làm tê liệt thoi phân bào tại kỳ giữa (metaphase), kích hoạt điểm kiểm soát phân bào dẫn đến dừng chu kỳ tế bào và kích hoạt apoptosis.
  2. Cơ chế hướng đích Folate Receptor: Thụ thể folate biểu hiện vượt trội trên bề mặt các tế bào ung thư (đặc biệt ung thư buồng trứng, ung thư vú), cho phép các hạt nano gắn axit folic (FA) xâm nhập tế bào theo cơ chế nhập bào qua thụ thể (receptor-mediated endocytosis).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

[Pluronic (F127, P123, F87, F68)]
[NPC-Pluronic-NPC]
[NPC-Pluronic-OH]
[Gelatin-Pluronic (GP)]
[FA-GP Copolymer Nanogel]
[FA-GP/PTX+QU Drug-loaded Nanogel System]
  • Quy trình tổng hợp hóa học:
    • Hoạt hóa hai đầu hydroxyl của Pluronic bằng $p$-nitrophenyl chloroformate (NPC) tạo chất trung gian $NPC-Pluronic-NPC$.
    • Khóa chọn lọc một đầu NPC bằng 3-amino-1-propanol để tạo $NPC-Pluronic-OH$.
    • Phản ứng ghép $NPC-Pluronic-OH$ vào khung gelatin thông qua nhóm amin tự do của lysine tạo copolymer Gelatin-Pluronic (GP).
    • Phản ứng gắn Folic Acid (FA) vào nhóm amin còn lại của gelatin bằng phản ứng ghép đôi carboxyl/amine sử dụng tác nhân ghép EDC và NHS.
  • Phương pháp phân tích hóa lý:
    • Cộng hưởng từ hạt nhân ($^1H-NMR$): Xác định tín hiệu proton đặc trưng của khung gelatin, mạch PEO/PPO của pluronic và vòng thơm của FA.
    • Quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR): Xác định các liên kết urethane, amide, carboxyl và hydroxyl.
    • Phân tích nhiệt trọng lượng (TGA): Xác định độ mất khối lượng theo nhiệt độ, tính toán tỷ lệ phần trăm pluronic và FA ghép vào gelatin.
    • Đo độ phân tán ánh sáng động học (DLS) và Thế Zeta: Xác định đường kính thủy động học, chỉ số phân tán đa dạng (PDI) và điện tích bề mặt hạt nanogel.
    • Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM): Quan sát hình thái hình học và kích thước thực tế của hạt nanogel.
    • Đo nồng độ tạo micelle tới hạn (CMC) và nồng độ tạo gel tới hạn (CGC).
    • Khảo sát khả năng nhả thuốc: Phương pháp màng thẩm tách (MWCO) trong môi trường đệm PBS (pH 7,4 và pH 5,5) ở nhiệt độ 37 °C; định lượng nồng độ QU và PTX giải phóng theo thời gian bằng quang phổ UV-Vis; khớp dữ liệu thực nghiệm vào các mô hình động học giải phóng.
  • Phương pháp đánh giá sinh học:
    • In vitro: Thử nghiệm Sulforhodamine B (SRB) đánh giá độc tính tế bào, độ tương thích sinh học và khả năng ức chế sinh trưởng tế bào ung thư MCF-7, HeLa và tế bào thường.
    • In vivo: Thiết lập mô hình chuột suy giảm miễn dịch mang khối u dị loài MCF-7; tiêm tĩnh mạch đuôi các công thức đối chứng và công thức thuốc nanogel; theo dõi thể tích khối u, khối lượng chuột, các biểu hiện viêm tại vị trí tiêm; phân tích giải phẫu bệnh khối u qua phương pháp nhuộm Hematoxylin - Eosin (H&E) và nhuộm hóa mô miễn dịch với kháng thể SOD2.

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Tác giả trình bày tổng quan về các thách thức trong công nghệ bào chế thuốc ung thư kỵ nước, cơ sở lựa chọn nanogel trên nền gelatin liên hợp pluronic, nêu rõ tính cấp thiết, mục tiêu nghiên cứu, 6 nội dung triển khai và ý nghĩa khoa học - thực tiễn của luận án.

Chương 1: Tổng quan

Chương này tổng kết có hệ thống cơ sở lý thuyết và y văn chuyên ngành bao gồm:

  • Khái niệm, phân loại, cấu trúc và các phương pháp tổng hợp nanogel (desolvat, keo tụ phân đoạn, nhũ tương hóa bốc hơi dung môi, nhũ pha đảo, kết tủa nano, tự lắp ráp biến tính hóa học).
  • Đặc tính sinh học, cấu tạo acid amin, tính chất keo, điểm đẳng điện và ứng dụng dẫn truyền thuốc của gelatin loại A và B.
  • Cấu trúc $PEO-PPO-PEO$, tính nhạy nhiệt, đặc tính tạo micelle, thông số HLB, CMC của các pluronic (L121, L61, P123, P105, F127, F87, F68).
  • Tổng quan dịch tễ học ung thư (số liệu WHO 2018), cơ chế phân tử và chu kỳ tế bào; dược lý học phân tử của Quercetin (chống oxy hóa, tác động MMP, kích hoạt caspase) và Paclitaxel (gắn $\beta$-tubulin, ức chế tháo xoắn vi ống).
  • Đặc điểm thụ thể folate (FR) và nguyên lý hướng đích khối u của phối tử Axit Folic.
  • Tổng kết các công trình nghiên cứu tiền đề trong và ngoài nước.

Chương 2: Thực nghiệm

Trình bày chi tiết danh mục hóa chất tinh khiết, thiết bị đo đạc phân tích và các quy trình tổng hợp:

  • Quy trình tổng hợp sản phẩm trung gian $NPC-Pluronic-NPC$ và $NPC-Pluronic-OH$ cho các loại pluronic (F127, P123, F87, F68).
  • Quy trình tổng hợp các hệ copolymer $GP-F127$, $GP-P123$, $GP-F87$, $GP-F68$ ở các tỷ lệ mol xác định.
  • Quy trình gắn phối tử hướng đích axit folic tạo copolymer $FA-GP-P123$ thông qua phản ứng hoạt hóa bởi EDC/NHS.
  • Phương pháp nang hóa Quercetin và Paclitaxel vào nhân kỵ nước của hệ nanogel.
  • Quy trình đo đạc hóa lý: $^1H-NMR$, FT-IR, TGA, DLS, thế Zeta, TEM, xác định CMC/CGC.
  • Phương pháp thẩm tách khảo sát động học nhả thuốc ở pH 7,4 và pH 5,5 tại 37 °C.
  • Quy trình thử nghiệm độc tính tế bào in vitro (phương pháp nhuộm protein tế bào SRB) trên các dòng tế bào MCF-7, HeLa.
  • Quy trình gây suy giảm miễn dịch trên chuột, cấy chuyển dị loài tế bào MCF-7 tạo khối u thực nghiệm, kỹ thuật tiêm tĩnh mạch đuôi, đo thể tích khối u ($V = \frac{1}{2} \times \text{dài} \times \text{rộng}^2$), nhuộm mô học H&E và nhuộm hóa mô miễn dịch với kháng thể SOD2.

Chương 3: Kết quả và bàn luận

1. Tổng hợp và khảo sát hệ nanogel GP-F127

  • Tổng hợp thành công $NPC-F127-NPC$ và $NPC-F127-OH$, xác nhận qua phổ FT-IR (xuất hiện mũi hấp thụ đặc trưng của nhóm carbonyl cacbonat tại $\sim 1764\text{ cm}^{-1}$ và nhân thơm nitro) và phổ $^1H-NMR$ (tín hiệu proton nhân thơm của nhóm NPC tại $\delta \approx 7,4\text{ ppm}$ và $8,3\text{ ppm}$, tín hiệu PEO tại $\delta \approx 3,65\text{ ppm}$ và PPO tại $\delta \approx 1,13\text{ ppm}$).
  • Phản ứng ghép gelatin với $NPC-F127-OH$ tạo $GP-F127$ ở các tỷ lệ khảo sát (1:5, 1:10, 1:15, 1:18) được chứng minh qua phổ FT-IR với sự dịch chuyển dải hấp thụ Amide I và Amide II, cùng sự xuất hiện liên kết urethane. Phổ $^1H-NMR$ thể hiện đồng thời pic của gelatin và F127.
  • Kết quả phân tích nhiệt TGA cho thấy độ bền nhiệt của copolymer GP-F127 nằm trung gian giữa gelatin và pluronic nguyên bản, khẳng định sự liên kết hóa học.
  • Kỹ thuật DLS và TEM cho thấy hạt nanogel $GP-F127$ hình cầu đều, kích thước hạt thay đổi phụ thuộc vào tỷ lệ ghép và nhiệt độ đo.

2. So sánh các hệ nanogel GP-P123, GP-F87, GP-F68 với GP-F127

  • Tổng hợp thành công các dẫn xuất $GP-P123$, $GP-F87$, $GP-F68$.
  • Khảo sát giá trị CMC/CGC cho thấy hệ $GP-P123$ có khả năng tự lắp ráp tạo hạt micelle/nanogel ở nồng độ thấp nhất nhờ tỷ lệ khối kỵ nước PPO cao trong cấu trúc Pluronic P123 ($y = 69,40$, HLB = 8).
  • Đánh giá khả năng mang Quercetin: $GP-P123$ cho hiệu suất nang hóa và dung lượng tải QU vượt trội so với các hệ còn lại ($GP-F127$, $GP-F87$, $GP-F68$).
  • Khảo sát động học giải phóng: Các hệ nanogel GP đều thể hiện khả năng nhả chậm QU so với dạng tự do. Thử nghiệm ức chế tế bào ung thư ban đầu xác nhận $GP-P123$ mang QU có hoạt tính gây độc tế bào ung thư tốt hơn hệ trên nền F127.

3. Khảo sát nanogel GP-P123 ở các tỷ lệ ghép khác nhau

  • Khảo sát dãy tỷ lệ khối lượng gelatin : P123 nhằm tìm cấu trúc tối ưu.
  • Kết quả đo DLS, TEM và thế Zeta xác định tỷ lệ gelatin : P123 = 1:4 là tỷ lệ tối ưu nhất, tạo ra hạt nanogel phân tán đồng đều, kích thước trung bình đạt 32,37 nm, thế Zeta mang giá trị âm giúp hệ keo bền vững trong dung dịch.
  • Tải thành công Quercetin đạt hiệu quả mang gần 8,0% khối lượng (%wt) và Paclitaxel đạt từ 0,5% đến 2,0% khối lượng (%wt).

4. Tổng hợp và đánh giá đặc tính hệ nanogel hướng đích FA-GP-P123

  • Ghép thành công phối tử Folic Acid lên $GP-P123$ tạo copolymer $FA-GP-P123$. Phổ FT-IR và $^1H-NMR$ ghi nhận các tín hiệu đặc trưng của khung pteridine và vòng thơm của FA bên cạnh các pic của gelatin và P123.
  • Kết quả TGA và CMC tái xác nhận sự có mặt của FA không làm phá vỡ khả năng tự lắp ráp của nanogel mà còn cải thiện độ ổn định.

5. Đánh giá in vitro hệ nanogel FA-GP-P123 mang đồng thời PTX và QU

  • Đánh giá độ tương thích sinh học: Nanogel trắng $GP-P123$ không mang thuốc thể hiện tính an toàn cao, không gây độc đối với tế bào thường ở nồng độ thử nghiệm.
  • Khảo sát khả năng nhả chậm: Hệ $FA-GP-P123$ nhả chậm QU khoảng 70% sau 120 giờ (trong khi QU tự do giải phóng hoàn toàn 100% chỉ sau 24 giờ); nhả chậm PTX đạt hơn 90% sau 72 giờ (so với PTX tự do giải phóng hết trong vòng chưa đầy 12 giờ). Quá trình giải phóng thuốc diễn ra nhanh hơn ở pH 5,5 (môi trường vi mô khối u) so với pH 7,4 (môi trường sinh lý).
  • Hoạt tính độc tế bào in vitro: Công thức nanogel $FA-GP-P123$ mang QU và PTX làm tăng đáng kể tỷ lệ ức chế sinh trưởng tế bào ung thư vú MCF-7 và tế bào ung thư cổ tử cung HeLa so với dạng thuốc tự do, nhờ sự hỗ trợ nhập bào qua trung gian thụ thể folate.

6. Đánh giá in vivo trên mô hình chuột mang khối u dị loài MCF-7

  • Thử nghiệm trên chuột suy giảm miễn dịch mang khối u ghép MCF-7 qua 14 ngày điều trị:
    • Công thức kết hợp hai thuốc dạng nano $FA-GP-P123/PTX+QU$ làm giảm kích thước thể tích khối u lên đến 94% sau 14 ngày (ở thời điểm N14), vượt trội rõ rệt so với mức giảm 83% khi sử dụng hỗn hợp thuốc tự do $PTX+QU$.
    • Ở nhóm chuột điều trị bằng $FA-GP-P123/PTX+QU$, một số cá thể ghi nhận sự biến mất hoàn toàn của khối u.
    • Về độ an toàn sinh học: Chuột ở nhóm sử dụng nanogel duy trì khối lượng cơ thể ổn định, không xuất hiện hiện tượng sưng viêm, hoại tử ở đuôi chuột (vị trí tiêm thuốc), trong khi nhóm dùng thuốc tự do ghi nhận hiện tượng viêm loét tại chỗ do độc tính của thuốc và dung môi hòa tan.
    • Hình ảnh mô bệnh học nhuộm H&E cho thấy vùng hoại tử tế bào u rộng lớn ở nhóm dùng nanogel hướng đích; kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch kháng thể SOD2 xác nhận sự suy giảm biểu hiện các dấu ấn sinh tồn của tế bào u.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học

  1. Thiết lập quy trình tổng hợp copolymer mới: Luận án đã xây dựng quy trình tổng hợp hóa học thành công các hệ copolymer trên cơ sở gelatin ghép với các pluronic khác nhau (F127, P123, F87, F68) thông qua phản ứng kích hoạt đơn đầu phân tử Pluronic bằng $p$-nitrophenyl chloroformate (NPC), hạn chế tối đa quá trình tạo liên kết chéo không mong muốn.
  2. Xác định hệ mang tối ưu: Đã chứng minh một cách hệ thống rằng Pluronic P123 với tỷ lệ gelatin : P123 = 1:4 ($GP-P123$) tạo ra cấu trúc nanogel có nồng độ tạo micelle thấp nhất, kích thước hạt ổn định nhất (32,37 nm) và khả năng mang các hoạt chất kỵ nước cao nhất so với các dẫn xuất của F127, F87 và F68.
  3. Cơ chế hướng đích và đồng phân phối: Gắn thành công phối tử Folic Acid lên khung nanogel $GP-P123$, tạo hệ phân phối đa chức năng $FA-GP-P123$ có khả năng đồng nang hóa Quercetin (chất ức chế chu kỳ tế bào, tăng nhạy cảm hóa trị) và Paclitaxel (thuốc độc tế bào vi ống), mở ra hướng tiếp cận mới trong việc phối hợp thuốc nguồn gốc tự nhiên với thuốc hóa trị tổng hợp.

Đóng góp mới về mặt thực tiễn

  1. Cải thiện độ hòa tan và kiểm soát giải phóng: Hệ nanogel giúp tăng độ phân tán trong nước của Quercetin và Paclitaxel, kéo dài thời gian giải phóng thuốc (QU đạt $\sim 70%$ sau 120 giờ; PTX đạt $>90%$ sau 72 giờ), duy trì nồng độ trị liệu ổn định và nhạy cảm với pH axit của khối u.
  2. Nâng cao hiệu quả ức chế khối u in vivo: Công thức $FA-GP-P123/PTX+QU$ đạt hiệu quả giảm thể tích khối u đến 94% sau 14 ngày trên mô hình chuột mang khối u dị loài MCF-7 (so với 83% của dạng tự do), có trường hợp khối u bị tiêu biến hoàn toàn.
  3. Giảm thiểu độc tính toàn thân: Hệ nanogel khắc phục triệu chứng viêm loét đuôi chuột và sụt cân thường gặp khi dùng thuốc tự do, chứng minh tiềm năng ứng dụng an toàn trong công nghệ dược phẩm.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế được ghi nhận

  • Do thành phần chứa gelatin có nguồn gốc sinh học tự nhiên, độ bền và tính ổn định của hệ nanogel có thể bị ảnh hưởng nếu điều kiện bảo quản (nhiệt độ, độ ẩm) không được kiểm soát nghiêm ngặt.
  • Quá trình tổng hợp và tinh sạch copolymer qua nhiều bước phản ứng hữu cơ (hoạt hóa NPC, khóa đầu mạch, ghép polymer, gắn FA, thẩm tách) phụ thuộc chặt chẽ vào các thông số thực nghiệm (tốc độ khuấy, tỷ lệ dung môi, nhiệt độ phản ứng).
  • Khả năng mang thuốc của hệ phụ thuộc chủ yếu vào tỷ lệ và bản chất của gốc pluronic được ghép vào khung gelatin.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

  • Mở rộng nghiên cứu độ ổn định dài hạn của hệ nanogel dạng đông khô trong các điều kiện bảo quản khác nhau.
  • Tiến hành các thử nghiệm tiền lâm sàng mở rộng trên nhiều mô hình động vật khác nhau và hướng tới các thử nghiệm lâm sàng sâu hơn để đánh giá toàn diện dược động học, phân bố sinh học và tính an toàn của hệ $FA-GP-P123/PTX+QU$.

Giá trị tham khảo

  • Đối với nghiên cứu sinh và học viên cao học ngành Hóa Hữu cơ, Hóa Dược và Vật liệu Y sinh: Luận án cung cấp quy trình thực nghiệm chi tiết về kỹ thuật chức năng hóa Pluronic bằng NPC, kỹ thuật ghép polymer sinh học gelatin, các phương pháp phân tích cấu trúc hạt nano ($^1H-NMR$, FT-IR, TGA, DLS, TEM, CMC) và các mô hình toán học giải phóng thuốc.
  • Đối với các nhà nghiên cứu dược lý và công nghệ bào chế: Tài liệu là dẫn chứng thực nghiệm chuẩn xác về hiệu quả của liệu pháp phối hợp (kết hợp Quercetin và Paclitaxel) nhằm tăng độ nhạy trị liệu ung thư, kỹ thuật đánh giá độc tính tế bào bằng phương pháp nhuộm SRB và kỹ thuật xây dựng mô hình khối u dị loài MCF-7 trên chuột suy giảm miễn dịch.
  • Đối với các cơ sở nghiên cứu và sản xuất dược phẩm: Cung cấp cơ sở khoa học để phát triển các dạng thuốc nano hướng đích nhắm giảm tác dụng phụ của các hóa chất chống ung thư khó tan.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao Pluronic P123 lại cho kết quả tối ưu hơn các Pluronic F127, F87 và F68 trong hệ nanogel gelatin-pluronic?

Trong cấu trúc của Pluronic P123, tỷ lệ khối kỵ nước PPO chiếm tỷ trọng cao ($y = 69,40$ so với $28,97$ của F68 và $39,83$ của F87) cùng giá trị cân bằng ưa nước - ưa béo HLB thấp (HLB = 8, thấp nhất trong 4 loại khảo sát). Do đó, copolymer $GP-P123$ có nồng độ tạo micelle tới hạn (CMC) thấp nhất, tạo ra lõi kỵ nước mạnh mẽ và bền vững hơn, giúp tăng cường dung lượng và hiệu quả nang hóa các phân tử kỵ nước như Quercetin và Paclitaxel.

2. Tỷ lệ ghép tối ưu giữa gelatin và Pluronic P123 là bao nhiêu và kích thước hạt nano thu được là bao nhiêu?

Tỷ lệ ghép tối ưu giữa gelatin và Pluronic P123 được xác định trong luận án là 1:4 (khối lượng). Ở tỷ lệ này, hệ nanogel $GP-P123$ hình thành các hạt nano hình cầu đồng đều với kích thước trung bình đo được bằng DLS là 32,37 nm, điện tích bề mặt (thế Zeta) âm ổn định, ngăn ngừa hiện tượng tự kết tụ.

3. Tác dụng của việc gắn phối tử Axit Folic (FA) lên hệ vật liệu nanogel là gì?

Axit folic đóng vai trò là phối tử hướng đích khối u. Thụ thể folate (Folate Receptor) thường biểu hiện quá mức trên bề mặt các tế bào ung thư (như dòng tế bào MCF-7, HeLa) so với tế bào bình thường. Việc gắn FA giúp hệ nanogel $FA-GP-P123$ nhận diện và thâm nhập chọn lọc vào tế bào ung thư thông qua cơ chế nhập bào qua thụ thể, giúp tăng tích lũy thuốc tại khối u và giảm tổn thương tế bào lành.

4. Hiệu quả ức chế khối u in vivo của công thức nanogel FA-GP-P123 mang đồng thời PTX và QU trên chuột đạt mức nào so với thuốc tự do?

Sau 14 ngày thử nghiệm trên mô hình chuột suy giảm miễn dịch mang khối u ghép MCF-7, công thức nanogel $FA-GP-P123/PTX+QU$ làm giảm thể tích khối u lên đến 94%, cao hơn đáng kể so với mức giảm 83% khi dùng hỗn hợp thuốc tự do $PTX+QU$. Đặc biệt, công thức nanogel không gây phản ứng sưng viêm hoại tử ở đuôi chuột và có trường hợp ghi nhận khối u tiêu biến hoàn toàn.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Đinh Văn Thoại đã tổng hợp và đặc trưng thành công hệ vật liệu nanogel hướng đích $FA-GP-P123$ trên cơ sở copolymer gelatin ghép Pluronic P123 có gắn phối tử axit folic. Hệ vật liệu sở hữu kích thước hạt nano tối ưu (32,37 nm), khả năng nang hóa hiệu quả và giải phóng kéo dài đồng thời Quercetin cùng Paclitaxel. Các kết quả thử nghiệm in vitro và in vivo trên mô hình chuột mang khối u MCF-7 đã chứng minh hiệu quả ức chế khối u vượt trội (giảm 94% thể tích khối u) cùng tính an toàn sinh học cao, đóng góp một giải pháp khoa học và thực tiễn có giá trị cho lĩnh vực công nghệ dẫn truyền thuốc điều trị ung thư.