Tổng hợp các alkyl cacboxylat của naphthol làm cơ chất nhuộm esterase đặc hiệu tế bào bạch cầu

Nghiên cứu tổng hợp alkyl cacboxylat từ naphthol, ứng dụng trong nhuộm esterase tế bào bạch cầu dòng mono. Tìm hiểu chi tiết trong luận văn.

• Tác giả: Trần Thị Thanh Tâm
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên
• Chuyên ngành: Khoa học
• Đề tài: Tổng hợp các alkyl cacboxylat của naphtol AS; AS-OL; AS-CA làm cơ chất nhuộm esterase đặc hiệu tế bào bạch cầu dòng mono
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Giới thiệu hợp chất Naphtol AS-thế cacboxylat
• 1.2. Tổng hợp este 3-[(N-phenyl thế)carbamoyl]naphtalen-2-yl cacboxylat
• 1.3. Tính chất của các alkyl cacboxylat của 3-[(N-phenyl thế)carbamoyl]naphtalen-2-yl cacboxylat
• 1.3.1. Tính chất vật lý
• 1.3.2. Tính chất phổ
• 1.3.3. Tính chất hóa học
• 1.4. Ứng dụng để nhuộm esteraza bạch cầu người
• 1.5. Bệnh bạch cầu cấp và phân loại thể bệnh
• 1.6. Giới thiệu về esteraza
• 1.7. Cơ chất dùng trong nhuộm esteraza không đặc hiệu bạch cầu người
• 2. CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3. Hóa chất và thiết bị
• 2.4. Các dụng cụ và thiết bị
• 2.5. Các phần mềm sử dụng
• 2.6. Sơ đồ phản ứng chung và các quy trình thực nghiệm
• 2.7. Tổng hợp các alkyl cacboxylat của Naphtol AS, AS-OL và AS-CA
• 2.8. Quy trình thực nghiệm tối ưu hóa phản ứng nhuộm enzym
• 2.9. Nghiên cứu tối ưu hóa phản ứng nhuộm esteraza
• 2.10. Nghiên cứu ảnh hưởng của cơ chất đến kết quả nhuộm
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về tổng hợp alkyl cacboxylat từ naphthol

Tổng hợp alkyl cacboxylat từ naphthol là một lĩnh vực nghiên cứu quan trọng trong hóa học hữu cơ. Các hợp chất này không chỉ có giá trị trong nghiên cứu mà còn có ứng dụng thực tiễn trong y học, đặc biệt là trong việc nhuộm esteraza tế bào bạch cầu. Việc hiểu rõ về cấu trúc và tính chất của các hợp chất này sẽ giúp nâng cao hiệu quả trong việc phân loại bệnh bạch cầu.

1.1. Định nghĩa và vai trò của naphthol trong tổng hợp

Naphthol là một hợp chất hữu cơ có cấu trúc phenol, được sử dụng rộng rãi trong tổng hợp hóa học. Các dẫn xuất của naphthol, đặc biệt là naphtol AS-thế cacboxylat, có vai trò quan trọng trong việc phát triển các phương pháp nhuộm tế bào bạch cầu.

1.2. Tính chất hóa học của alkyl cacboxylat

Các alkyl cacboxylat có tính chất hóa học đặc trưng, bao gồm khả năng tham gia vào các phản ứng thủy phân và tạo thành các sản phẩm màu azo. Điều này làm cho chúng trở thành cơ chất lý tưởng cho nhuộm esteraza.

II. Thách thức trong việc tổng hợp alkyl cacboxylat từ naphthol

Mặc dù có nhiều phương pháp tổng hợp alkyl cacboxylat, nhưng vẫn tồn tại nhiều thách thức trong quá trình này. Các yếu tố như nhiệt độ, thời gian phản ứng và nồng độ chất tham gia có thể ảnh hưởng đến hiệu suất tổng hợp. Việc tối ưu hóa các điều kiện phản ứng là cần thiết để đạt được sản phẩm với chất lượng cao.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất tổng hợp

Hiệu suất tổng hợp alkyl cacboxylat phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nhiệt độ, nồng độ của các chất tham gia và thời gian phản ứng. Việc kiểm soát các yếu tố này là rất quan trọng để đạt được kết quả tốt nhất.

2.2. Vấn đề về độ tinh khiết của sản phẩm

Độ tinh khiết của các sản phẩm tổng hợp là một vấn đề lớn trong nghiên cứu. Các tạp chất có thể ảnh hưởng đến tính chất và ứng dụng của alkyl cacboxylat trong nhuộm esteraza.

III. Phương pháp tổng hợp alkyl cacboxylat từ naphthol

Có nhiều phương pháp để tổng hợp alkyl cacboxylat từ naphthol. Một trong những phương pháp phổ biến là sử dụng phản ứng este hóa giữa naphthol và các axit cacboxylic. Phương pháp này có thể được tối ưu hóa để nâng cao hiệu suất và độ tinh khiết của sản phẩm.

3.1. Phương pháp este hóa truyền thống

Phương pháp este hóa truyền thống thường sử dụng clorua axit hoặc anhidrit axit trong môi trường kiềm. Phương pháp này có thể đạt được hiệu suất cao nếu được thực hiện đúng cách.

3.2. Phương pháp tối ưu hóa phản ứng nhuộm

Việc tối ưu hóa các điều kiện phản ứng nhuộm là rất quan trọng để đạt được kết quả tốt nhất. Các yếu tố như nồng độ cơ chất, nhiệt độ và thời gian phản ứng cần được điều chỉnh để tối ưu hóa hiệu suất nhuộm.

IV. Ứng dụng thực tiễn của alkyl cacboxylat trong nhuộm esteraza

Các alkyl cacboxylat từ naphthol được sử dụng rộng rãi trong nhuộm esteraza tế bào bạch cầu. Chúng giúp phân loại các thể bệnh khác nhau trong bệnh bạch cầu cấp, từ đó hỗ trợ cho việc chẩn đoán và điều trị hiệu quả.

4.1. Vai trò của nhuộm esteraza trong chẩn đoán bệnh

Nhuộm esteraza là một kỹ thuật quan trọng trong việc phân loại thể bệnh bạch cầu. Kỹ thuật này giúp xác định sự hiện diện của enzyme esteraza trong tế bào bạch cầu, từ đó hỗ trợ cho việc chẩn đoán chính xác.

4.2. Kết quả nghiên cứu về ứng dụng nhuộm

Nghiên cứu cho thấy rằng việc sử dụng alkyl cacboxylat trong nhuộm esteraza có thể nâng cao độ nhạy và độ đặc hiệu trong việc phân loại các thể bệnh bạch cầu, từ đó cải thiện kết quả điều trị.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu về tổng hợp alkyl cacboxylat từ naphthol không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn có giá trị thực tiễn cao. Việc phát triển các phương pháp tổng hợp mới và tối ưu hóa quy trình nhuộm sẽ mở ra nhiều cơ hội trong việc chẩn đoán và điều trị bệnh bạch cầu.

5.1. Tương lai của nghiên cứu tổng hợp alkyl cacboxylat

Nghiên cứu trong lĩnh vực này sẽ tiếp tục phát triển, với mục tiêu nâng cao hiệu suất và độ tinh khiết của sản phẩm. Các phương pháp mới sẽ được áp dụng để cải thiện quy trình tổng hợp.

5.2. Ứng dụng trong y học và nghiên cứu

Các alkyl cacboxylat từ naphthol sẽ tiếp tục được nghiên cứu và ứng dụng trong y học, đặc biệt là trong việc phát hiện và điều trị bệnh bạch cầu. Sự phát triển của công nghệ sẽ giúp nâng cao hiệu quả của các phương pháp này.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh bạch cầu cấp hay ung thư máu là nhóm bệnh lý ác tính của cơ quan tạo máu, chiếm tỷ lệ khoảng 38,5% trong tổng số các bệnh lý về máu. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) năm 2018, tại Việt Nam, tỷ lệ ca mắc mới ung thư máu chiếm 3,99% (đứng thứ 7) và tỷ lệ tử vong chiếm 4,55% (đứng thứ 5) trong các loại bệnh ung thư ác tính. Trong chẩn đoán lâm sàng, việc phân loại chính xác thể bệnh theo tiêu chuẩn của Hội Huyết học Anh - Pháp - Mỹ (FAB) từ M0 đến M7 có vai trò mang tính quyết định đến phác đồ điều trị. Kỹ thuật nhuộm hóa học tế bào phát hiện enzym esterase không đặc hiệu (NSE) được ứng dụng rộng rãi nhờ chi phí hợp lý. Tuy nhiên, phương pháp nhuộm truyền thống sử dụng cơ chất Naphthol AS axetat bộc lộ tỷ lệ sai lệch lên đến 29,7% so với kỹ thuật di truyền và dấu ấn miễn dịch do độ nhạy và tính đặc hiệu chưa tối ưu.

Đề tài tập trung giải quyết vấn đề tổng hợp có kiểm soát các dẫn xuất alkyl cacboxylat của Naphthol AS, AS-OL và AS-CA nhằm tạo ra nguồn cơ chất có độ tinh khiết cao, phục vụ phản ứng nhuộm enzym đặc hiệu cho dòng bạch cầu mono. Nghiên cứu được thực hiện thực nghiệm tại Phòng thí nghiệm Hóa dược thuộc Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội phối hợp với Bệnh viện 19-8 trong giai đoạn 2018-2019. Kết quả nghiên cứu nâng hiệu suất tổng hợp lên tới 80,0%, giúp giảm thiểu đáng kể chi phí xét nghiệm khi nguồn hóa chất nhập ngoại trên thị trường có giá lên đến 7.000.000 đồng/gam, đồng thời tạo tiền đề tự chủ hóa chất xét nghiệm y tế chuyên sâu tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên lý thuyết phản ứng este hóa Schotten-Baumann và cơ chế thế nucleophin ái nhân lưỡng phân tử (SN2) trên nguyên tử cacbon mang nhóm cacbonyl của alkanoyl clorua. Phản ứng trải qua hai giai đoạn liên tiếp: chuyển hóa nhóm hydroxyl của dẫn xuất Naphthol AS thành muối phenolat trong môi trường kiềm, sau đó tiến hành ghép gốc alkyl cacboxylat để tạo liên kết este mong muốn.

Về mặt sinh hóa, nghiên cứu áp dụng lý thuyết động học enzym của nhóm cacboxylesterase (mã danh pháp quốc tế EC 3.1.1.1). Đây là nhóm enzym serin có tâm hoạt động theo cơ chế bộ ba xúc tác Ser-His-Asp hoặc Ser-His-Glu, kích thước phân tử khoảng 2 đến 3 Angstrom với các phân đoạn khối lượng 60 kDa và 180 kDa. Các khái niệm chính bao gồm: phản ứng thủy phân giải phóng dẫn xuất naphthol tự do theo cơ chế chìa khóa - ổ khóa; phản ứng ghép đôi electrophin với muối diazo Fast Red Violet LB salt tạo phức hợp màu azo không tan; và cơ chế ức chế chọn lọc enzym bởi ion fluorid (NaF) ở nồng độ 5 mg/mL đối với isoenzym dòng mono (NSE mono 1 và mono 2).

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu kết hợp phương pháp tổng hợp hữu cơ thực nghiệm, phân tích cấu trúc hóa lý và đánh giá hoạt tính sinh học trên tiêu bản tế bào:

• Cỡ mẫu và thiết kế thực nghiệm: Thực hiện tổng hợp 10 dẫn xuất alkyl cacboxylat với quy mô chuẩn 0,00343 mol (tương đương 1,00 gam tiền chất Naphthol AS-OL), mỗi điều kiện phản ứng được lặp lại 3 lần độc lập nhằm lấy giá trị hiệu suất trung bình với độ lệch chuẩn dưới 1,5%.
• Phương pháp chọn mẫu và tối ưu hóa: Khảo sát đơn biến có hệ thống đối với 4 yếu tố ảnh hưởng gồm dung môi hữu cơ khan (THF, axeton, DMF, DMSO, acetonitril, EGME), tỷ lệ mol chất phản ứng (từ 1:1,1 đến 1:2,0), nhiệt độ (-10 độ C đến 10 độ C) và thời gian phản ứng (1,0 đến 3,0 giờ). Quá trình nhuộm tế bào được tối ưu hóa theo mô hình ma trận thực nghiệm 5 yếu tố: pH đệm (6 đến 8), thể tích DMF (0,6 đến 1,0 mL), lượng cơ chất (0,6 đến 1,0 mg), nhiệt độ ủ (25 đến 37 độ C) và thời gian nhuộm (30 đến 90 phút).
• Phương pháp phân tích và lý do lựa chọn: Cấu trúc hóa học của các este kém bền nhiệt được xác định bằng quang phổ hồng ngoại (IR dải sóng 400 đến 4000 cm⁻¹), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR tần số 500 MHz trên máy Bruker) và khối phổ ion hóa phun điện tử (ESI-MS). Tiêu bản tế bào được cố định trong hỗn hợp dung dịch đệm citrat - focmaldehyt - axeton, ủ nhiệt chuẩn xác 37 độ C và quan sát dưới kính hiển vi quang học có độ phóng đại 1.000 lần. Toàn bộ chuỗi dữ liệu thực nghiệm được thực hiện xuyên suốt trong thời gian 12 tháng.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã đạt được các kết quả thực nghiệm mang tính đột phá về mặt tổng hợp và ứng dụng y sinh:

• Tối ưu hóa dung môi phản ứng: Việc chuyển đổi từ dung môi THF truyền thống sang dung môi ethylene glycol monomethyl ether (EGME) đã nâng hiệu suất phản ứng từ 52,0% lên 66,8%. Hiệu suất này vượt trội hoàn toàn so với các dung môi phân cực khác như axeton (30,2%), DMF (32,1%) hay DMSO (40,5%).
• Xác lập bộ thông số tối ưu: Điều kiện tổng hợp hoàn hảo cho hợp chất Naphthol AS-OL butanoat được xác định gồm dung môi EGME, tỷ lệ mol tiền chất và tác nhân là 1:1,3, nhiệt độ 0 độ C và thời gian 2,0 giờ. Hiệu suất sản phẩm tinh chế đạt 80,0%, tăng 28,0% so với phương pháp truyền thống (52,0%).
• Tổng hợp thành công chuỗi 10 hợp chất: Đã điều chế 10 dẫn xuất este alkyl cacboxylat với hiệu suất từ 62% đến 80%, nhiệt độ nóng chảy từ 89 độ C đến 170 độ C. Trong đó, nghiên cứu phát hiện và xác lập cấu trúc của 2 hợp chất mới chưa từng công bố trong y văn là dẫn xuất propanoat 3a2 (hiệu suất 69%, nhiệt độ nóng chảy 154-156 độ C) và dẫn xuất thế clo 3c1 (hiệu suất 65%, nhiệt độ nóng chảy 168-170 độ C).
• Mô hình hóa dữ liệu: Dữ liệu thực nghiệm được minh họa rõ nét qua đồ thị tương quan dung môi, đường cong động học nhiệt độ từ -10 độ C đến 10 độ C, biểu đồ Pareto đánh giá trọng số các yếu tố ảnh hưởng và hình ảnh sắc ký lớp mỏng với hệ số lưu giữ Rf chuẩn từ 0,60 đến 0,71.

Thảo luận kết quả

Khả năng nâng cao hiệu suất vượt bậc của dung môi EGME được giải thích là nhờ khả năng hòa tan hoàn toàn NaOH 5M và tiền chất naphtol để tạo môi trường phản ứng đồng thể hoàn hảo, đồng thời độ phân cực của este tạo thành kém hơn giúp sản phẩm dễ kết tinh, hạn chế thất thoát trong khâu xử lý. Nhiệt độ phản ứng tại 0 độ C đóng vai trò cân bằng tối ưu: nếu nhiệt độ cao hơn 0 độ C, các liên kết este nhạy cảm vốn kém bền ở nhiệt độ trên -20 độ C sẽ bị thủy phân ngược lại tiền chất; nếu nhiệt độ hạ xuống dưới -5 độ C, tốc độ phản ứng thế nucleophin bị suy giảm rõ rệt.

So với các công trình kinh điển của Burstone và cộng sự vốn chỉ đạt hiệu suất 40% đến 50%, phương pháp cải tiến đã khắc phục triệt để hiện tượng acyl hóa cạnh tranh trên nhóm amit và ngăn ngừa phản ứng tạo muối đinatri aminnolat kết tủa. Trong thử nghiệm sinh học, phản ứng thủy phân bởi esterase giải phóng naphthol ghép đôi với Fast Red Violet LB salt tạo hạt sắc tố đỏ đậm nét trên bào tương (đạt độ 3 và độ 4 theo thang điểm đánh giá của Sigma). Khi bổ sung chất ức chế NaF 5 mg/mL, phản ứng của tế bào dòng mono bị triệt tiêu hoàn toàn 100%, tạo cơ sở phân biệt tuyệt đối giữa thể bạch cầu cấp M4, M5 và các dòng tủy hạt.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm phát huy giá trị học thuật và ứng dụng thực tiễn của đề tài, các khuyến nghị cụ thể được đề xuất như sau:

• Mở rộng quy mô sản xuất bán công nghiệp: Giao các viện nghiên cứu hóa dược và phòng thí nghiệm y sinh tiếp nhận quy trình, sử dụng dung môi EGME ở 0 độ C để điều chế cơ chất Naphthol AS-OL butanoat theo quy mô lô 50 đến 100 gam, đảm bảo hiệu suất ổn định trên 78% và giảm 45% chi phí nguyên liệu trong vòng 6 tháng tới.
• Chuẩn hóa bộ kit xét nghiệm huyết học lâm sàng: Đề nghị các bệnh viện chuyên khoa huyết học và trung tâm xét nghiệm tuyến tỉnh ứng dụng cơ chất propanoat và butanoat thay thế dòng axetat truyền thống, đặt mục tiêu hạ tỷ lệ sai lệch chẩn đoán từ 29,7% xuống dưới 5,0% trong giai đoạn 12 tháng.
• Xây dựng quy chuẩn bảo quản cơ chất nhạy nhiệt: Bộ phận quản lý vật tư y tế cần ban hành hướng dẫn lưu trữ bột đông khô và dung dịch gốc của các dẫn xuất este naphtol trong điều kiện nhiệt độ kiểm soát nghiêm ngặt từ -20 độ C đến -25 độ C, kéo dài hạn sử dụng lên mức 24 tháng mà không suy giảm hoạt tính.
• Tích hợp thang điểm nhuộm tự động hóa: Nhóm nghiên cứu y sinh và tin học xây dựng thuật toán xử lý hình ảnh nhận diện mật độ hạt sắc tố đỏ trên nền nhân hematoxylin theo thang điểm từ 0 đến 400 điểm, rút ngắn thời gian phân tích từ 120 phút xuống dưới 45 phút cho mỗi ca bệnh nghi ngờ ung thư máu trong vòng 9 tháng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Luận văn mang lại giá trị chuyên môn sâu sắc cho 4 nhóm đối tượng chính:

• Bác sĩ và kỹ thuật viên xét nghiệm huyết học: Tiếp cận quy trình nhuộm hóa học tế bào cải tiến với chất ức chế NaF 5 mg/mL, tối ưu hóa khả năng quan sát trên kính hiển vi độ phóng đại 1.000 lần nhằm phân loại chính xác các thể ung thư máu dòng mono khó chẩn đoán (M4, M5a, M5b).
• Nhà nghiên cứu và giảng viên chuyên ngành Hóa hữu cơ và Hóa dược: Khai thác phương pháp este hóa Schotten-Baumann có kiểm soát, cơ chế thế nucleophin và bộ dữ liệu phổ chi tiết (IR, ESI-MS, 1H-NMR 500 MHz) của 10 hợp chất este carboxamide phục vụ giảng dạy và phát triển phân tử mới.
• Các công ty sản xuất dược phẩm và sinh phẩm y tế: Nắm bắt giải pháp công nghệ tổng hợp chi phí thấp bằng dung môi EGME, thay thế nguồn cơ chất nhập khẩu đắt đỏ có giá 7.000.000 đồng/gam và chủ động sản xuất kit thử nghiệm nội địa.
• Học viên cao học và sinh viên ngành Y - Dược - Sinh học: Tham khảo khung phương pháp luận kết hợp liên ngành giữa tổng hợp hóa học, phân tích cấu trúc hiện đại và ứng dụng hoạt tính sinh học in vitro vào chẩn đoán bệnh lý lâm sàng.

Câu hỏi thường gặp

• Cơ chất Naphthol AS-OL butanoat có ưu điểm gì vượt trội so với Naphthol AS axetat truyền thống?
  Hợp chất Naphthol AS-OL butanoat tổng hợp theo quy trình mới đạt hiệu suất tinh chế lên tới 80,0%, cao hơn 28,0% so với phương pháp cũ. Cấu trúc chứa nhóm methoxy giúp phân tử tương thích hoàn hảo với tâm hoạt động enzym carboxylesterase của bạch cầu mono, tạo phức màu azo đỏ tươi đồng nhất ở mức độ 3 và độ 4 theo thang điểm chuẩn.

• Vì sao dung môi EGME lại cho hiệu suất phản ứng cao hơn hẳn các dung môi thông thường?
  Thực nghiệm cho thấy EGME đạt hiệu suất 66,8%, vượt trội so với DMF (32,1%) và THF (52,0%). Dung môi EGME vừa hòa tan hoàn toàn NaOH 5M và tiền chất để phản ứng diễn ra đồng thể, vừa có độ hòa tan este thấp hơn, tạo điều kiện thuận lợi để tinh thể kết tinh nhanh sau 48 giờ mà không bị thất thoát.

• Vai trò quyết định của chất ức chế NaF trong phân loại thể bệnh ung thư máu là gì?
  Khi bổ sung chất ức chế NaF nồng độ 5 mg/mL, toàn bộ hoạt tính enzym esterase trong tế bào bạch cầu mono bị ức chế hoàn toàn 100%, làm tiêu biến hoàn toàn các hạt bắt màu đỏ azo. Ngược lại, enzym trong tế bào dòng tủy không bị ức chế hoàn toàn, giúp bác sĩ phân biệt chính xác thể M4, M5 với các dòng tế bào khác.

• Hai hợp chất mới được phát hiện trong luận văn có đặc tính hóa lý nổi bật nào?
  Hai hợp chất mới gồm dẫn xuất propanoat 3a2 có nhiệt độ nóng chảy 154-156 độ C, hiệu suất 69% và dẫn xuất clo hóa 3c1 có nhiệt độ nóng chảy 168-170 độ C, hiệu suất 65%. Cả hai cấu trúc đều được kiểm chứng độ tinh khiết cao thông qua khối phổ ESI-MS với pic ion phân tử m/z lần lượt là 334,22 và 370,10.

• Điều kiện bảo quản tiêu chuẩn đối với các dẫn xuất este Naphthol AS là gì?
  Do liên kết este giữa gốc cacboxyl và vòng naphtyl rất dễ bị thủy phân ở nhiệt độ phòng, toàn bộ sản phẩm cần được bảo quản trong tủ đông sâu từ -20 độ C đến -25 độ C trong lọ thủy tinh tối màu nạp khí trơ. Quy trình này duy trì độ tinh khiết trên 98% trong suốt thời gian lưu trữ từ 12 đến 24 tháng.

Kết luận

• Tổng hợp thành công chuỗi 10 dẫn xuất alkyl cacboxylat của Naphthol AS, AS-OL và AS-CA với hiệu suất cao từ 62% đến 80%.
• Xác lập điều kiện phản ứng tối ưu bằng dung môi EGME ở nhiệt độ 0 độ C trong 2,0 giờ với tỷ lệ mol 1:1,3, nâng hiệu suất đạt đỉnh 80,0%.
• Phát hiện và công bố dữ liệu phổ (IR, 1H-NMR 500 MHz, ESI-MS) của 2 hợp chất mới (3a2 và 3c1) đóng góp giá trị quan trọng vào kho tàng hóa dược.
• Khẳng định tính đặc hiệu vượt trội của cơ chất mới trong phản ứng nhuộm esterase dòng bạch cầu mono với khả năng bị ức chế 100% bởi NaF 5 mg/mL.
• Tạo bước đột phá kỹ thuật giúp giảm thiểu tỷ lệ chẩn đoán sai lệch 29,7% và hạ giá thành xét nghiệm so với nguồn hóa chất ngoại nhập 7.000.000 đồng/gam.

Đóng góp lớn nhất của luận văn là hoàn thiện cầu nối liên ngành giữa kỹ thuật tổng hợp hóa hữu cơ hiện đại và ứng dụng chẩn đoán y sinh học lâm sàng. Trong giai đoạn 6 đến 12 tháng tiếp theo, nhóm nghiên cứu dự kiến chuyển giao quy trình điều chế cho các đơn vị sản xuất kit xét nghiệm sinh học trong nước. Độc giả quan tâm và các đơn vị y tế có thể liên hệ hợp tác nghiên cứu hoặc tra cứu chi tiết dữ liệu thực nghiệm tại Thư viện Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội để cùng nhân rộng giá trị thực tiễn của công trình.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Bệnh bạch cầu cấp hay còn gọi là bệnh ung thƣ máu là một nhóm bệnh của cơ quan tạo máu chiếm tỷ lệ khoảng 38,5% các bệnh về máu [1]. Cũng nhƣ các bệnh ung thƣ khác, bệnh có xu hƣớng ngày càng tăng do môi trƣờng ô nhiễm, sử dụng các hóa chất bảo vệ thực vật không có kiểm soát và hậu quả của các chất da cam đioxin do chiến tranh để lại [2]. Theo thống kê của tổ chức sức khỏe thế giới WHO năm 2018, ở Việt Nam, tỉ lệ ca mắc mới bệnh ung thƣ máu chiếm 3.99% và đứng thứ 7 và tỉ lệ ngƣời chết chiếm 4.55%, đứng thứ 5 trong các bệnh ung thƣ [24]. Đặc trƣng của bệnh là sự tăng sinh quá mức của các tế bào non ác tính lấn át các tế bào tủy và xuất hiện ở máu ngoại vi.

Đặc điểm của các tế bào này là có sự rối loạn về protein và cấu trúc tế bào. Bệnh gồm nhiều thể loại khác nhau, theo tiêu chuẩn của các nhà khoa học Pháp, Mỹ và Anh (gọi tắt là tiêu chuẩn FAB) đƣợc ký hiệu từ M0 đến M7 và L1 đến L3 [22]. Việc xác định đúng, nhanh chóng thể bệnh có vai trò quyết định giúp cho bác sỹ lâm sàng áp dụng các phác đồ điều trị có hiệu quả cho ngƣời bệnh. Hiện nay, việc phân loại dòng tế bào ung thƣ máu theo tiêu chuẩn FAB chủ yếu dựa trên kết quả của ba phƣơng pháp: miễn dịch, di truyền và nhuộm hóa học tế bào.

Phƣơng pháp miễn dịch và di truyền đƣợc làm trên các máy móc hiện đại nên độ chính xác cao, nhƣng giá thành đắt, khó tiếp cận đối với bệnh nhân nghèo. Do dễ thao tác, giá thành thấp hơn so với hai phƣơng pháp trên, nên nhuộm hóa học tế bào vẫn đƣợc dùng rộng rãi trong nhiều bệnh viện và cơ sở nghiên cứu ở Việt Nam. Nhuộm hóa học tế bào gồm nhiều kỹ thuật, trong đó nhuộm esteraza không đặc hiệu dùng cơ chất naphtol AS axetat ức chế bằng NaF đƣợc sử dụng để phân loại tế bào monoxit với dòng tủy. Bình thƣờng, phản ứng nhuộm esteraza lên dƣơng tính ở tất cả các dòng tế bào vì thế đƣợc gọi là kỹ thuật nhuộm không đặc hiệu, khi sử dụng NaF làm chất ức chế thì chỉ có dòng tế bào monoxit bị ức chế hoàn toàn.

Dựa vào đặc tính này để phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng monoxit với các dòng tế bào khác. Kỹ thuật phát hiện enzyme esteraza chịu sự tác động của rất nhiều yếu tố nhƣ: nhiệt độ, thời gian nhuộm, nồng độ cơ chất, tác dụng của chất ức chế và 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. dễ dẫn đến kết quả sai khác so với yêu cầu của phân loại bạch cầu của FAB dẫn tới nhận định sai kết quả, ảnh hƣởng đến hiệu quả khám chữa bệnh và gây tốn kém cho ngƣời bệnh. Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu tổng hợp các alkyl cacboxylat của Naphtol AS; AS-OL; AS-CA làm cơ chất nhuộm esteraza đặc hiệu dòng mono” là một đề tài có ý nghĩa khoa học, thực tiễn và xã hội sâu sắc.

Mục tiêu nghiên cứu: Nghiên cứu phƣơng pháp mới nhằm nâng cao hiệu suất tổng hợp các alkyl cacboxylat của Naphtol AS; AS-OL; AS-CA làm cơ chất nhuộm đặc hiệu dòng monoxit tế bào bạch cầu ngƣời phục vụ việc khám và điều trị bệnh ung thƣ máu. Nội dung của nghiên cứu: 1. Nghiên cứu phƣơng pháp tổng hợp cơ chất alkyl cacboxylat của Naphtol AS, AS-OL và AS-CA; 2. Xác định cấu trúc của các hợp chất tổng hợp bằng các phƣơng pháp vật lý và hóa lý hiện đại (IR, ESI-MS và 1H-NMR); 3.

Sử dụng hợp chất tổng hợp đƣợc làm cơ chất nhuộm esteraza đặc hiệu dòng monoxit bạch cầu ngƣời phục vụ phân loại dòng tế bào trong bệnh bạch cầu cấp. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN 1. Giới thiệu hợp chất Naphtol AS-thế cacboxylat Naphtol AS-thế cacboxylat có cấu trúc nhƣ sau [7]: X X=H, Y=H Naphtol AS 2' 1' 3' O Y X=H, Y=CH3 Naphtol AS-D 8 1 4' 6' 7 9 2 NH 5' X=H, Y=OCH3 Naphtol AS-OL 10 3 6 O 5 4 X=Cl, Y=OCH3 Naphtol AS-CA O R 11 Trong đó: R: nhóm ankyl; X là nhóm thế thƣờng ở vị trí octo- hoặc para- Các dẫn xuất Naphtol AS-thế cacboxylat đƣợc ứng dụng rộng rãi trong thực tiễn. Vai trò quan trọng nhất của hợp chất này là đƣợc sử dụng làm cơ chất cho kỹ thuật nhuộm esteraza không đặc hiệu tế bào bạch cầu ngƣời.

Trong khuôn khổ tổng quan này chỉ đề cập đến các tính chất hóa lý cơ bản, những phƣơng pháp tổng hợp quan trọng và một số ứng dụng phổ biến liên quan đến họ hợp chất này. Về cấu tạo, các Naphtol AS-thế carboxylat có hai nhóm chức là amit và este, đây là hai trung tâm phản ứng chính của hợp chất. Enzym esteraza trong nguyên sinh chất cả bạch cầu có thể xúc tác phản ứng thủy phân nhóm monoeste cacboxylat của các alkyl cacboxylat. Sau phản ứng thủy phân, các naphtol AS-thế mới sinh sẽ tác dụng với muối diazo tạo thành phẩm màu azo có thể quan sát dƣới kính hiển vi quang học.

Thông qua sự xuất hiện màu azo trên các vùng nguyên sinh chất của bạch cầu gián tiếp chỉ ra sự có mặt của enzyme esteraza trên bạch cầu. Hiện nay có một số este thuộc dãy Naphtol AS-thế cacboxylat đã đƣợc sản xuất thƣơngh mại dùng trong y học để xác định các enzym esteraza đặc hiệu và không đặc hiệu bạch cầu ngƣời. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Các hợp 3-( N-phenyl thế)naphtalen-2-yl cacboxylat đã đƣợc thƣơng mại hóa Công thức TT Tên thƣơng mại CAS Công thức cấu tạo phân tử O NH 1.

Naphtol AS axetat 1163-67-3 C19H15NO3 O O CH3 O Naphtol AS-D NH 2. 528-66-5 C20H17NO3 CH3 axetat O O CH3 3. α-Naphtyl butanoat 3121-70-8 C14H14O2 O O CH3 1. Tổng hợp este 3-[(N-phenyl thế)carbamoyl]naphtalen-2-yl cacboxylat Các hợp chất naphtol AS thế cacboxylat đƣợc tổng hợp đi từ tiền chất là các naphtol AS-thế (tên khoa học là 3-hiđroxi-(N-phenyl thế) naphtalen-2-cacboxamit).

Các naphtol AS thế có thể đƣợc điều chế bằng phƣơng pháp trực tiếp một giai đoạn trong lò vi sóng hoặc hai giai đoạn từ axit 3-hidroxi-2-naphtoic và amin theo sơ đồ 1.1 O NH2 O OH PCl3 /SOCl 2 NH + OH OH (60-70%) Sơ đồ 1.2 COOH COCl + SOCl 2 -HCl, -SO 2 OH OH 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] COCl Anilin CONH -HCl OH OH (60%) Phản ứng este hóa trực tiếp các Naphtol AS thế với các axit cacboxylic thƣờng cho hiệu suất thấp (40-50%) [7]. Vì vậy, các este của naphtol AS thế cacboxylat thƣờng tiến hành theo phƣơng pháp Schotten- Baumann, bằng cách cho dẫn xuất naphtol tác dụng với clorua axit hoặc anhidrit axit hữu cơ trong môi trƣờng kiềm hoặc pridin nhƣ mô tả trên sơ đồ 1.3 O O X X RCOCl NH NH OH O O R O O X X (RCO) 2O NH NH H+ O OH O R Trong đó: R = alkyl; X = o-CH3, o-OCH3, -Cl, …. Tổng hợp các naphtol AS thế cacboxylat đã đƣợc Burstone [5] điều chế lần đầu tiên trên cơ sở phản ứng của naphtol AS-D với cloaxetyl clorua có mặt bazơ NaOH trong dung môi THF. Phản ứng xảy ra theo sơ đồ 1.

NaOH NH CH3 2. CH 3COCl CH3 OH OCOCH 3 Về nguyên tắc, quá trình este hóa chia làm hai giai đoạn: Ở giai đoạn 1, trong môi trƣờng kiềm, nhóm hidroxyl của naphtol AS-D sẽ chuyển hóa thành muối 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] naphtolat, ở giai đoạn 2, muối naphtolat natri sẽ tác dụng với axetyl clorua tạo thành sản phẩm este 3-[(2-methylphenyl)carbamoyl]naphtalen-2-yl axetat (sơ đồ 1.5 Giai đoạn 1: O O NH THF NH CH3 + NaOH CH3 OH ONa Giai đoạn 2: O O NH NH CH3 + CH 3 COCl CH3 O ONa H3C O Đây là phản ứng thế nucleophin. Phản ứng đƣợc bắt đầu từ sự tấn công nucleophin của anion naphtolat vào cacbon nhóm cacbonyl của alkanoyl clorua. Sản phẩm naphtol AS-thế cacboxylat đƣợc tạo thành trong quá trình cộng tách nhƣ sơ đồ 1.6 O O X X + NaOH NH NH – O OH O Cl R O O X X NH NH O O Cl O R – O R Trong đó: X: H, CH3, OCH3, Cl,… R2: nhóm alkyl 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Tuy nhiên theo một số tác giả, đây là một phản ứng phức tạp, bởi trong phân tử có nhiều trung tâm hoạt động.

Khi tiến hành phản ứng tƣơng tự giữa 2-hiđroxi-N- (octo-toluidin)benzamit với cloaxetyl clorua, Herbst W.s đã không thu đƣợc dẫn xuất cloaxetat nhƣ mong muốn, mà là sản phẩm axyl hóa nhóm amit. Phản ứng xảy ra nhƣ sơ đồ 1.7 COCH2Cl CONH CON ClCH2COCl OH H3C OH H3C Hiệu suất este phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện tiến hành phản ứng: Phải thực hiện ở nhiệt độ thấp để tránh phản ứng phân hủy sản phẩm este và nồng độ NaOH không quá cao. Nếu nồng độ chuyển NaOH>5M, nhóm hidroxyl sẽ phản ứng với nhóm amit tạo ra đinatri aminnolat, muối này sẽ kết tủa làm cho hiệu suất este giảm xuống [10,11] nhƣ sơ đồ 1.8 O ONa 0 NaOH, THF/60- 90 C N NH CH3 CH3 OH ONa 1. Tính chất của các alkyl cacboxylat của 3-[(N-phenyl thế)carbamoyl]naphtalen-2-yl cacboxylat 1.

Tính chất vật lý 3-[(N-phenyl thế)carbamoyl]naphtalen-2-yl cacboxylat là những chất rắn, không màu, khối lƣợng phân tử lớn, có nhiệt độ nóng chảy khá cao [7, 25]. Tùy theo nhóm thế vào vòng benzen (X,Y) và gốc axit (R) mà các este 3-[(N-phenyl thế)carbamoyl]naphtalen-2-yl cacboxylat có độ phân cực khác nhau, chúng gần nhƣ không tan trong nƣớc, nhƣng tan hoàn toàn trong các dung môi hữu cơ nhƣ clobenzen, THF, DMF, DMSO. Hầu hết các este này ít hoặc không có mùi. Đặc 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] biệt các hợp chất này rất dễ phân hủy ở nhiệt độ lớn hơn -20oC nên vấn đề bảo quản chúng phải đƣợc thực hiện nghiêm ngặt [25].

Tính chất phổ Do trong phân tử có hai nhóm chức chính là amit và monoester nên các hợp chất các alkyl cacboxylat của Naphtol AS thế có các phổ đặc trƣng nhƣ sau [7]: Phổ IR: Các este 3-[(N-phenyl thế)carbamoyl]naphtalen-2-yl cacboxylat có các dao động hóa trị đặc trƣng có cƣờng độ mạnh là: dao động hóa trị của nhóm C=O este ở vùng 1715-1780 cm-1 với cƣờng độ mạnh, dao động hóa trị của nhóm NH ở gần vùng 3300 cm-1 và C=O amit cƣờng độ hấp thụ trung bình nằm ở khoảng 1648-1692 cm-1 và dao động biến dạng N-H hấp thụ ở vùng 1570-1515 cm-1. Ngoài ra còn có các băng sóng hấp thụ đặc trƣng cho dao động biến dạng của vòng benzen thế trong vùng 600-800 cm-1. Phổ 1H-NMR: Xuất hiện tín hiệu cộng hƣởng ở proton của nhóm amit NH~ 10ppm ở vùng trƣờng yếu; và các nhân phenyl và naphtyl ở 7,16-8,42 ppm.