Luận văn thạc sĩ thú y tối ưu phản ứng khuếch đại đẳng nhiệt rpa recombinase polymerase amplification và tích hợp trên thiết bị vi lưu kỹ thuật số dmf digital microfluidics dùng để chẩn đoán vi rút dịch tả heo châu phi

Luận văn thạc sĩ: Tối ưu phản ứng RPA-DMF chẩn đoán nhanh virus dịch tả lợn châu Phi. Nghiên cứu mới, kỹ thuật hiện đại, ứng dụng trong thú y.

• Tác giả: Trịnh Thị Minh
• Người hướng dẫn: Pgs. Huỳnh Chấn Khôn
• Trường học: Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Thú Y
• Đề tài: Tối ưu phản ứng khuếch đại đẳng nhiệt (RPA- Recombinase polymerase amplification) và tích hợp trên thiết bị vi lưu kỹ thuật số (DMF-Digital microfluidics) dùng để chẩn đoán vi-rút dịch tả heo châu Phi
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Tp. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• TÓM TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. African Swine Fever (ASF)
• 1.2. Lịch sử
• 2. CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Thời gian và địa điểm
• 2.2. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Tối ưu phản ứng khuếch đại dạng nhiệt RPA
• 2.3.2. Tối ưu nhiệt độ phản ứng
• 2.3.3. Tối ưu thể tích phản ứng
• 2.3.4. Giới hạn phát hiện (LOD)
• 2.3.5. Phản ứng thay đổi màu với SYBR Green I
• 2.3.6. Tích hợp phản ứng RPA lên thiết bị vi lưu kỹ thuật số
• 2.3.6.1. Thiết kế bảng điện cực
• 2.3.6.2. Tối ưu nồng độ Tween-20
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Tối ưu phản ứng khuếch đại dạng nhiệt RPA
• 3.2. Tối ưu nhiệt độ phản ứng
• 3.3. Giới hạn phát hiện (LOD)
• 3.4. Phản ứng thay đổi màu với SYBR Green I
• 3.5. Tích hợp phản ứng RPA lên thiết bị vi lưu kỹ thuật số
• 3.5.1. Thiết kế đường di chuyển của chất lỏng trên bảng điện cực
• 3.5.2. Ảnh hưởng của nồng độ Tween-20 đến khả năng di chuyển của giọt
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
• DANH SÁCH CÁC BẢNG
• DANH SÁCH CÁC HÌNH

Tóm tắt

I. Tổng Quan Dịch Tả Lợn Châu Phi Nguy Cơ Thách Thức 55

Bệnh Dịch tả lợn châu Phi (ASFV) là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, gây chết gần 100% ở lợn nhà và lợn rừng. Mặc dù không lây sang người, ASFV gây thiệt hại kinh tế - xã hội to lớn, khiến Tổ chức Thú y Thế giới (WOAH) phải đưa ra cảnh báo toàn cầu. Kiểm soát dịch bệnh chủ yếu dựa vào các biện pháp an toàn sinh học nghiêm ngặt do thiếu vắc-xin hoặc phương pháp điều trị. ASFV lần đầu được ghi nhận năm 1921 tại Kenya. Đến nay, dịch bệnh đã lan rộng khắp Châu Phi, Châu Âu, Châu Á, và Châu Mỹ, tàn phá ngành chăn nuôi lợn. Việt Nam cũng chịu ảnh hưởng nặng nề từ năm 2019. "ASF được mô tả là bệnh cấp tính, đặc trưng bởi tỷ lệ chết cao và xuất huyết đa nội tạng, hiện chưa có vắc-xin phòng bệnh hiệu quả nên bệnh càng diễn ra hết sức phúc tạp" (Cục Thú y, 2020).

1.1. Lịch Sử Phát Triển và Đường Lây Lan của Dịch Tả Lợn

Năm 1921, Montgomery mô tả bệnh gây xuất huyết cấp tính với tỷ lệ chết cao ở Kenya. Sau đó, bệnh lan ra hầu hết các nước châu Phi. Năm 1957, ASFV xuất hiện ở Bồ Đào Nha, rồi lan khắp châu Âu. Năm 2018, Trung Quốc bùng dịch, sau đó lan sang nhiều nước châu Á. Tại Việt Nam, dịch bệnh được ghi nhận từ 19/2/2019, sau đó lan ra tất cả 63 tỉnh thành. Hơn 50 quốc gia đã công bố xuất hiện ASFV. Châu Á hiện là nơi chịu ảnh hưởng nặng nề nhất. Các biện pháp kiểm soát dịch bệnh bao gồm: kiểm dịch, tiêu hủy lợn bệnh, vệ sinh chuồng trại, và an toàn sinh học.

1.2. Đặc Điểm Cấu Trúc và Cơ Chế Gây Bệnh của Virus ASFV

ASFV là một virus DNA lớn, phức tạp, thuộc họ Asfarviridae. Nó có cấu trúc nhiều lớp, bao gồm lõi DNA, capsid, và lớp vỏ ngoài. Virus có khả năng nhân lên trong tế bào chất của tế bào lympho và đại thực bào. ASFV gây bệnh bằng cách phá hủy hệ miễn dịch của lợn, gây xuất huyết nội tạng và suy đa tạng. Cơ chế gây bệnh của Dịch tả lợn châu Phi vô cùng phức tạp, đòi hỏi các nghiên cứu chuyên sâu để có thể kiểm soát dịch bệnh một cách hiệu quả.

II. Vấn Đề Giải Pháp Phát Hiện ASFV Hiện Tại Hạn Chế 58

Các phương pháp phát hiện ASFV hiện tại bao gồm xét nghiệm kháng nguyên (phân lập virus, PCR), và xét nghiệm kháng thể (ELISA). Phân lập virus được xem là "tiêu chuẩn vàng", nhưng tốn thời gian và công sức. PCR nhanh và nhạy hơn, nhưng đòi hỏi thiết bị đắt tiền và kỹ thuật viên lành nghề. Các xét nghiệm kháng thể hữu ích cho việc giám sát dịch bệnh, nhưng không thể phát hiện sớm ASFV. "Theo khuyến cáo tổ chức thú y thế giới (WOAH), các kỹ thuật chan đoán ASFV trong phòng thí nghiệm được phân loại thành xét nghiệm kháng nguyên bao gồm phân lập kết hợp HAD, phát hiện hệ gen vi-rút như PCR hay Real — time PCR" (Gallardo và cs, 2015; Malmquist & Hay, 1960). Do đó, cần có các phương pháp phát hiện ASFV nhanh chóng, chính xác, và dễ thực hiện.

2.1. Các Phương Pháp Xét Nghiệm ASFV Truyền Thống và Ưu Nhược Điểm

Các phương pháp xét nghiệm ASFV truyền thống bao gồm: phân lập virus (HAD), PCR, ELISA, và IFA. Phân lập virus là "tiêu chuẩn vàng", nhưng tốn thời gian (7-10 ngày). PCR có độ nhạy và đặc hiệu cao, nhưng đòi hỏi thiết bị đắt tiền. ELISA và IFA nhanh chóng và dễ thực hiện, nhưng độ nhạy thấp hơn. Do đó, cần có phương pháp xét nghiệm nhanh, nhạy, và chi phí hợp lý.

2.2. Nhu Cầu Cấp Thiết về Công Nghệ Phát Hiện ASFV Nhanh Chóng

Việc phát hiện sớm ASFV là rất quan trọng để ngăn chặn sự lây lan của dịch bệnh. Các phương pháp xét nghiệm hiện tại thường tốn thời gian hoặc đòi hỏi thiết bị phức tạp. Vì vậy, cần có công nghệ phát hiện virus nhanh chóng, chính xác, và dễ sử dụng tại trang trại. Công nghệ phát hiện nhanh sẽ giúp giảm thiểu thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi và ngăn chặn sự lây lan của dịch bệnh.

III. Giải Pháp RPA DMF Tối Ưu Phát Hiện ASFV Nhanh Chóng 57

Vi lưu kỹ thuật số (DMF) là một giải pháp đầy hứa hẹn cho việc phát hiện ASFV. Khi kết hợp DMF với phản ứng khuếch đại đẳng nhiệt (RPA), có thể thực hiện xét nghiệm chính xác, độ nhạy cao, đơn giản, nhanh chóng, và phù hợp với chẩn đoán phân tử tại trang trại. "Gan đây, vi lưu kỹ thuật số (DMF) đã được công nhận là một giải pháp đầy hứa hen và là ứng viên cho thé hệ tiếp theo của thiết bị chân đoán". Phương pháp RPA-DMF có thể phát hiện virus trong vòng vài phút, giảm thiểu thời gian chờ đợi kết quả so với các phương pháp truyền thống. Đồng thời giảm nguy cơ lây lan Dịch tả lợn châu Phi.

3.1. RPA Recombinase Polymerase Amplification Nguyên Lý và Ưu Điểm

RPA là một kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt, có thể khuếch đại DNA mục tiêu ở nhiệt độ không đổi (37-42°C). RPA nhanh hơn, đơn giản hơn, và ít tốn kém hơn so với PCR. RPA không đòi hỏi thiết bị phức tạp, có thể thực hiện tại hiện trường. RPA có thể được sử dụng để phát hiện nhiều loại virus, bao gồm cả ASFV.

3.2. DMF Digital Microfluidics Ứng Dụng trong Chẩn Đoán Nhanh ASFV

DMF là một công nghệ vi lỏng, cho phép điều khiển các giọt chất lỏng nhỏ trên một chip. DMF có thể được sử dụng để thực hiện các phản ứng hóa học và sinh học, bao gồm cả RPA. DMF có thể tự động hóa quy trình xét nghiệm, giảm thiểu sai sót và tăng độ chính xác. DMF có thể tích hợp nhiều xét nghiệm trên một chip, giúp tiết kiệm thời gian và chi phí. Sự kết hợp RPA và DMF giúp cho việc chẩn đoán nhanh ASFV trở nên hiệu quả hơn.

IV. Tối Ưu Quy Trình RPA DMF Phát Hiện Virus Dịch Tả Lợn 58

Nghiên cứu đã tối ưu hóa quy trình RPA-DMF để phát hiện virus Dịch tả lợn châu Phi. Thời gian ủ tối ưu là 15 phút ở 39°C, có thể phát hiện 10 bản sao/µl. SYBR Green I được dùng để phát hiện sự thay đổi màu. Việc tích hợp RPA lên thiết bị DMF cho phép thực hiện nhiều phản ứng cùng lúc, bao gồm cả chứng âm để kiểm soát nhiễm chéo. "Nghiên cứu cho thay đã tối ưu được phương pháp chan đoán vi-rút ASF thông qua RPA kết hợp với thiết bị DME. Thời gian ủ tối ưu của phương pháp là 15 phút với 39°C và phát hiện được 10 bản sao/ul." 0.1% Tween-20 được chọn để hỗ trợ phản ứng RPA, giúp tăng cường chuyển động của giọt mà vẫn giữ tỷ lệ các thành phần RPA MasterMix.

4.1. Thiết Kế Mồi Đặc Hiệu và Tối Ưu Hóa Phản Ứng RPA

Cặp mồi được thiết kế để khuếch đại đoạn gen p30 của virus Dịch tả lợn châu Phi. Các thành phần hóa chất trong phản ứng khuếch đại đẳng nhiệt được tối ưu hóa để đạt độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhất. Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp được đánh giá bằng cách sử dụng các mẫu kiểm chứng. Tối ưu hóa phản ứng RPA là một bước quan trọng để đạt được kết quả xét nghiệm chính xác.

4.2. Tích Hợp RPA Lên Thiết Bị Vi Lưu Kỹ Thuật Số DMF

Đường di chuyển của các thành phần trong phản ứng được thiết kế và tích hợp lên thiết bị DMF. Thiết bị DMF cho phép thực hiện các phản ứng một cách tự động và chính xác. Việc tích hợp RPA lên thiết bị DMF giúp giảm thiểu sai sót và tăng độ chính xác của xét nghiệm. Thiết bị DMF giúp tự động hóa quy trình xét nghiệm, giảm thời gian thực hiện và công sức của kỹ thuật viên.

4.3. Đánh Giá Độ Nhạy và Độ Đặc Hiệu của Phương Pháp RPA DMF

Phương pháp RPA-DMF có độ nhạy và độ đặc hiệu cao trong việc phát hiện virus Dịch tả lợn châu Phi. Phương pháp này có thể phát hiện virus ở nồng độ thấp, giúp phát hiện sớm dịch bệnh. Độ đặc hiệu của phương pháp đảm bảo rằng phương pháp không cho kết quả dương tính giả với các virus khác. Độ nhạy và độ đặc hiệu là những yếu tố quan trọng để đánh giá chất lượng của phương pháp xét nghiệm.

V. Kết Quả Nghiên Cứu Ứng Dụng Thực Tiễn Tiềm Năng 55

Nghiên cứu đã chứng minh tính khả thi và hiệu quả của phương pháp RPA-DMF trong việc phát hiện virus Dịch tả lợn châu Phi. Phương pháp này có thể được ứng dụng tại các trang trại chăn nuôi, phòng thí nghiệm thú y, và các cơ quan kiểm dịch. Ứng dụng RPA-DMF giúp phát hiện sớm dịch bệnh, từ đó có thể áp dụng các biện pháp phòng chống kịp thời, giảm thiểu thiệt hại kinh tế. Đồng thời, giải pháp RPA-DMF góp phần vào việc kiểm soát và ngăn chặn sự lây lan của Dịch tả lợn châu Phi.

5.1. Triển Vọng Ứng Dụng RPA DMF Tại Trang Trại và Phòng Thí Nghiệm

Phương pháp RPA-DMF có thể được sử dụng để sàng lọc ASFV tại các trang trại chăn nuôi, giúp phát hiện sớm các trường hợp nhiễm bệnh. Tại các phòng thí nghiệm thú y, RPA-DMF có thể được sử dụng để chẩn đoán ASFV một cách nhanh chóng và chính xác. Ứng dụng RPA-DMF tại các trang trại và phòng thí nghiệm giúp kiểm soát dịch bệnh một cách hiệu quả.

5.2. Tiềm Năng Phát Triển và Thương Mại Hóa Giải Pháp RPA DMF

Phương pháp RPA-DMF có tiềm năng phát triển thành một bộ kit xét nghiệm thương mại, dễ dàng sử dụng và có giá thành hợp lý. Bộ kit xét nghiệm này có thể được sử dụng bởi người chăn nuôi, kỹ thuật viên thú y, và các cơ quan kiểm dịch. Thương mại hóa giải pháp RPA-DMF sẽ giúp phổ biến công nghệ này và góp phần vào việc kiểm soát Dịch tả lợn châu Phi.

VI. Kết Luận Tối Ưu RPA DMF Cho Tương Lai Chăn Nuôi 56

Nghiên cứu đã thành công trong việc tối ưu hóa quy trình RPA-DMF để phát hiện virus Dịch tả lợn châu Phi. Phương pháp này có nhiều ưu điểm so với các phương pháp xét nghiệm truyền thống, như nhanh chóng, chính xác, dễ sử dụng, và có chi phí hợp lý. Tối ưu RPA-DMF mang lại tiềm năng lớn trong việc kiểm soát và ngăn chặn sự lây lan của Dịch tả lợn châu Phi, góp phần vào sự phát triển bền vững của ngành chăn nuôi lợn. Cần có thêm các nghiên cứu để hoàn thiện và thương mại hóa giải pháp này.

6.1. Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo và Đề Xuất Phát Triển

Các hướng nghiên cứu tiếp theo bao gồm: Tối ưu hóa quy trình RPA-DMF để phát hiện các biến chủng mới của virus Dịch tả lợn châu Phi. Phát triển các bộ kit xét nghiệm RPA-DMF dễ sử dụng và có giá thành hợp lý. Nghiên cứu ứng dụng RPA-DMF trong việc giám sát dịch bệnh và đánh giá hiệu quả của các biện pháp phòng chống. Nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc hoàn thiện và thương mại hóa giải pháp RPA-DMF.

6.2. Khuyến Nghị Cho Ngành Chăn Nuôi và Chính Sách Phòng Chống Dịch

Ngành chăn nuôi cần tăng cường áp dụng các biện pháp an toàn sinh học để ngăn chặn sự lây lan của Dịch tả lợn châu Phi. Chính phủ cần hỗ trợ nghiên cứu và phát triển các công nghệ phát hiện virus nhanh chóng và hiệu quả. Cần có chính sách khuyến khích người chăn nuôi sử dụng các phương pháp xét nghiệm tiên tiến để phát hiện sớm dịch bệnh. Phòng chống dịch bệnh là trách nhiệm của toàn xã hội.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh Dịch tả heo Châu Phi (ASF) là một bệnh truyền nhiễm nghiêm trọng, gây tỷ lệ chết lên đến 100% ở heo nhà và heo rừng, ảnh hưởng nặng nề đến ngành chăn nuôi heo toàn cầu. Theo báo cáo của Tổ chức Thú y Thế giới (WOAH), từ năm 2017 đến đầu năm 2019, hơn 20 quốc gia đã ghi nhận dịch bệnh, với hơn 1,09 triệu con heo bị tiêu hủy. Tại Việt Nam, từ tháng 2/2019 đến tháng 3/2020, dịch đã lan rộng ra 63 tỉnh, thành phố, buộc tiêu hủy gần 6 triệu con heo, tương đương 9,67% tổng trọng lượng heo cả nước, gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng. Việc phát hiện sớm vi-rút ASF tại trang trại là yếu tố then chốt để ngăn chặn sự lây lan và giảm thiểu thiệt hại.

Mục tiêu nghiên cứu là tối ưu hóa phương pháp chẩn đoán vi-rút ASF với độ nhạy và độ đặc hiệu cao thông qua kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt Recombinase Polymerase Amplification (RPA) kết hợp với thiết bị vi lưu kỹ thuật số Digital Microfluidics (DMF). Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 12/2022 đến tháng 9/2023 tại Phòng thí nghiệm Lab on a chip và Cảm biến Sinh học, Trường Đại học Quốc tế - Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh, và Phòng thí nghiệm Bệnh viện Thú y, Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Kết quả nghiên cứu góp phần nâng cao hiệu quả chẩn đoán ASF, hỗ trợ kiểm soát dịch bệnh kịp thời, giảm thiểu tổn thất kinh tế trong ngành chăn nuôi.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên hai lý thuyết và mô hình chính:

1. Phản ứng khuếch đại đẳng nhiệt Recombinase Polymerase Amplification (RPA): Đây là kỹ thuật khuếch đại axit nucleic ở nhiệt độ thấp (37-42°C) trong thời gian ngắn (5-20 phút), sử dụng enzyme recombinase, protein SSB và DNA polymerase để khuếch đại đoạn gen mục tiêu. RPA có ưu điểm là nhanh, nhạy, đặc hiệu và phù hợp với chẩn đoán tại hiện trường.

2. Thiết bị vi lưu kỹ thuật số Digital Microfluidics (DMF): Công nghệ điều khiển giọt chất lỏng trên bề mặt điện cực bằng hiệu ứng điện từ, cho phép thao tác phân phối, trộn, tách giọt chính xác và tự động hóa quy trình xét nghiệm. DMF giúp giảm thiểu sai sót do thao tác thủ công và giảm lượng thuốc thử sử dụng.

Các khái niệm chính bao gồm:

• Gen CP204L (p30): Mã hóa protein p30, một protein cấu trúc quan trọng của vi-rút ASF, được tạo ra sớm trong quá trình nhiễm và là mục tiêu lý tưởng cho xét nghiệm chẩn đoán sớm.
• Giới hạn phát hiện (LOD): Nồng độ thấp nhất của DNA vi-rút có thể được phát hiện chính xác.
• SYBR Green I: Thuốc nhuộm dùng để phát hiện sự thay đổi màu sắc của sản phẩm khuếch đại, hỗ trợ quan sát kết quả bằng mắt thường hoặc dưới ánh sáng cực tím.
• Tween-20: Chất hỗ trợ tăng cường chuyển động giọt trên thiết bị DMF, giữ nguyên tỷ lệ các thành phần trong hỗn hợp RPA.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Nghiên cứu sử dụng 5 mẫu huyết thanh heo dương tính với ASFV được xác định bằng kỹ thuật Real-time PCR, cùng các mẫu dương tính với các mầm bệnh khác như CSF, PCV2, PRRS để đánh giá độ đặc hiệu.
• Thiết kế cặp mồi: Cặp mồi được thiết kế nhắm vào đoạn gen CP204L mã hóa protein p30, với độ dài đoạn mồi từ 30-36 nucleotide, sản phẩm khuếch đại từ 100-200 bp, đảm bảo độ đặc hiệu và hiệu quả phản ứng.
• Tối ưu phản ứng RPA: Thực hiện khảo sát nhiệt độ ủ (37°C, 39°C, 41°C) và thời gian ủ (15, 20, 25, 30 phút) để xác định điều kiện tối ưu. Thể tích phản ứng được khảo sát ở 12,5 µL và 25 µL để phù hợp với thiết bị DMF.
• Xác định giới hạn phát hiện (LOD): Sử dụng chuỗi pha loãng 10 lần của plasmid chứa gen p30 để xây dựng đường chuẩn, xác định LOD là 10 bản sao/µL.
• Phản ứng thay đổi màu với SYBR Green I: Thử nghiệm các nồng độ SYBR Green I từ 50X đến 400X, xác định nồng độ 300X phù hợp để quan sát kết quả bằng mắt thường và dưới ánh sáng UV.
• Tích hợp phản ứng RPA trên thiết bị DMF: Thiết kế bảng điện cực gồm 64 điện cực, trong đó 8 giếng điện cực được sử dụng cho phản ứng RPA, bao gồm 4 giếng mẫu và 4 giếng cho các thành phần phản ứng. Nồng độ Tween-20 được tối ưu ở 0,1% để hỗ trợ chuyển động giọt.
• Phân tích dữ liệu: Sản phẩm khuếch đại được kiểm tra bằng điện di gel agarose 1,5%, kết quả được đánh giá về độ nhạy, độ đặc hiệu và khả năng phát hiện nhanh.

Thời gian nghiên cứu kéo dài từ tháng 12/2022 đến tháng 9/2023, đảm bảo đủ điều kiện thực hiện các bước tối ưu và đánh giá hiệu quả phương pháp.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Nhiệt độ và thời gian tối ưu cho phản ứng RPA: Nhiệt độ ủ 39°C và thời gian 15 phút được xác định là điều kiện tối ưu, cho kết quả khuếch đại rõ ràng trên gel điện di, phù hợp với yêu cầu nhanh chóng trong chẩn đoán thực địa.

2. Giới hạn phát hiện (LOD): Phương pháp RPA kết hợp DMF có thể phát hiện được nồng độ vi-rút thấp đến 10 bản sao/µL, tương đương hoặc vượt trội so với các kỹ thuật PCR truyền thống.

3. Nồng độ SYBR Green I: Nồng độ 300X được lựa chọn để phát hiện sự thay đổi màu sắc rõ ràng, giúp quan sát kết quả bằng mắt thường và dưới ánh sáng UV, thuận tiện cho việc chẩn đoán nhanh mà không cần thiết bị phức tạp.

4. Tích hợp trên thiết bị DMF: Thiết kế bảng điện cực cho phép thực hiện đồng thời 5 phản ứng, bao gồm phản ứng chứng âm để kiểm soát nhiễm chéo. Nồng độ Tween-20 0,1% giúp tăng cường chuyển động giọt mà không ảnh hưởng đến tỷ lệ các thành phần trong hỗn hợp RPA.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy sự kết hợp giữa kỹ thuật RPA và thiết bị DMF mang lại phương pháp chẩn đoán vi-rút ASF nhanh, nhạy và đặc hiệu. Nhiệt độ 39°C và thời gian 15 phút giúp rút ngắn thời gian xét nghiệm so với PCR truyền thống (1,5-2 giờ), phù hợp với yêu cầu chẩn đoán tại hiện trường. Giới hạn phát hiện 10 bản sao/µL đảm bảo phát hiện sớm vi-rút, góp phần kiểm soát dịch hiệu quả.

Việc sử dụng SYBR Green I ở nồng độ 300X giúp đơn giản hóa quá trình đọc kết quả, giảm thiểu nhu cầu thiết bị phức tạp, phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm cơ sở hoặc trang trại. Tích hợp phản ứng RPA trên thiết bị DMF với thiết kế bảng điện cực tối ưu cho phép thực hiện nhiều phản ứng đồng thời, tăng hiệu suất và giảm nguy cơ nhiễm chéo.

So sánh với các nghiên cứu trước đây, phương pháp này có độ nhạy và đặc hiệu tương đương hoặc cao hơn, đồng thời giảm thời gian và chi phí xét nghiệm. Việc ứng dụng DMF còn giúp tự động hóa quy trình, giảm sai sót do thao tác thủ công và giảm lượng thuốc thử sử dụng, góp phần bảo vệ môi trường.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ so sánh thời gian và giới hạn phát hiện giữa RPA-DMF và PCR truyền thống, bảng thể hiện kết quả tối ưu nhiệt độ, thời gian và nồng độ SYBR Green I, cũng như hình ảnh gel điện di minh họa sản phẩm khuếch đại.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Triển khai phương pháp RPA-DMF tại các phòng xét nghiệm cơ sở và trang trại: Đào tạo kỹ thuật viên sử dụng thiết bị DMF và thực hiện phản ứng RPA để phát hiện sớm vi-rút ASF, giảm thời gian chẩn đoán xuống còn 15 phút, nâng cao hiệu quả kiểm soát dịch.

2. Phát triển bộ kit xét nghiệm RPA-DMF thương mại: Tối ưu hóa quy trình đóng gói thuốc thử và thiết bị, đảm bảo tính ổn định và dễ sử dụng, phục vụ nhu cầu chẩn đoán nhanh trên diện rộng trong vòng 1-2 năm tới.

3. Tăng cường nghiên cứu ứng dụng công nghệ vi lưu kỹ thuật số cho các bệnh truyền nhiễm khác: Mở rộng phạm vi ứng dụng DMF kết hợp RPA cho các mầm bệnh khác trong ngành chăn nuôi, góp phần đa dạng hóa công cụ chẩn đoán nhanh.

4. Xây dựng hệ thống giám sát dịch bệnh tích hợp công nghệ RPA-DMF: Kết nối dữ liệu chẩn đoán từ các điểm xét nghiệm để theo dõi, cảnh báo sớm dịch ASF trên toàn quốc, nâng cao khả năng phản ứng nhanh trong vòng 6-12 tháng.

5. Khuyến khích hợp tác giữa các viện nghiên cứu, trường đại học và doanh nghiệp: Đẩy mạnh chuyển giao công nghệ, hỗ trợ kinh phí và đào tạo nhân lực để ứng dụng rộng rãi phương pháp mới, góp phần phát triển ngành chăn nuôi bền vững.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Các nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Thú y, Kỹ thuật Y sinh: Nghiên cứu về kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt và vi lưu kỹ thuật số, ứng dụng trong chẩn đoán bệnh truyền nhiễm, phát triển công nghệ xét nghiệm nhanh.

2. Phòng xét nghiệm chẩn đoán bệnh động vật: Áp dụng phương pháp RPA-DMF để nâng cao hiệu quả, độ chính xác và tốc độ xét nghiệm vi-rút ASF, giảm thiểu sai sót và chi phí vận hành.

3. Cơ quan quản lý và kiểm soát dịch bệnh: Sử dụng kết quả nghiên cứu để xây dựng chiến lược giám sát, phòng chống dịch ASF hiệu quả, đặc biệt trong bối cảnh dịch bệnh diễn biến phức tạp.

4. Doanh nghiệp sản xuất thiết bị y sinh và thuốc thử: Tham khảo để phát triển bộ kit xét nghiệm RPA-DMF thương mại, mở rộng thị trường và nâng cao chất lượng sản phẩm.

Câu hỏi thường gặp

1. Phản ứng RPA khác gì so với PCR truyền thống?
   RPA thực hiện ở nhiệt độ thấp (37-42°C) trong thời gian ngắn (15 phút), không cần máy biến nhiệt phức tạp, phù hợp với chẩn đoán nhanh tại hiện trường. PCR cần nhiệt độ cao và thời gian lâu hơn (1,5-2 giờ).

2. Giới hạn phát hiện của phương pháp RPA-DMF là bao nhiêu?
   Phương pháp có thể phát hiện vi-rút ASF với nồng độ thấp đến 10 bản sao/µL, đảm bảo phát hiện sớm và chính xác.

3. Thiết bị DMF có ưu điểm gì trong xét nghiệm?
   DMF cho phép thao tác giọt chất lỏng tự động, chính xác, giảm sai sót do thao tác thủ công, tiết kiệm thuốc thử và giảm rác thải nhựa, phù hợp với xét nghiệm phân tử tại hiện trường.

4. SYBR Green I được sử dụng như thế nào trong phương pháp này?
   SYBR Green I ở nồng độ 300X được thêm vào sau phản ứng RPA để tạo màu sắc dễ quan sát bằng mắt thường hoặc dưới ánh sáng UV, giúp đọc kết quả nhanh chóng và đơn giản.

5. Phương pháp này có thể áp dụng cho các bệnh khác không?
   Có, kỹ thuật RPA kết hợp DMF có thể được điều chỉnh để phát hiện nhiều loại mầm bệnh khác nhau trong chăn nuôi và y tế, mở rộng ứng dụng trong chẩn đoán nhanh.

Kết luận

• Đã tối ưu thành công phản ứng khuếch đại đẳng nhiệt RPA ở 39°C trong 15 phút, phát hiện vi-rút ASF với giới hạn 10 bản sao/µL.
• SYBR Green I ở nồng độ 300X giúp quan sát kết quả dễ dàng bằng mắt thường và dưới ánh sáng UV.
• Thiết bị vi lưu kỹ thuật số DMF được thiết kế tích hợp phản ứng RPA, cho phép thực hiện đồng thời 5 phản ứng với kiểm soát nhiễm chéo hiệu quả.
• Nồng độ Tween-20 0,1% hỗ trợ chuyển động giọt trên thiết bị DMF mà không ảnh hưởng đến phản ứng.
• Phương pháp RPA-DMF mang lại giải pháp chẩn đoán nhanh, nhạy, đặc hiệu, phù hợp với yêu cầu phát hiện sớm và kiểm soát dịch ASF tại trang trại.

Next steps: Triển khai ứng dụng thực tế tại các phòng xét nghiệm cơ sở, phát triển bộ kit thương mại và mở rộng nghiên cứu ứng dụng cho các bệnh truyền nhiễm khác.

Các đơn vị nghiên cứu, phòng xét nghiệm và doanh nghiệp trong lĩnh vực chăn nuôi và y sinh được khuyến khích hợp tác để phát triển và ứng dụng công nghệ RPA-DMF, góp phần nâng cao hiệu quả kiểm soát dịch bệnh và phát triển ngành chăn nuôi bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TỎNG QUAN 1. African Swine Fever (ASE) Bệnh dịch tả heo Châu Phi (ASF) là một bệnh do vi-rút gây ra với khả năng gây chết 100% ở heo nhà và heo rừng. Mặc dù phạm vi ký chủ hạn chế và không có khả năng truyền lây từ động vật sang người, nhưng tác động của dịch bệnh đến kinh tế xã hội rất lớn. Cũng chính vì lý do này, Dịch tả heo Châu Phi đã được T6 chức Thú Y Thế giới (WOAH) cảnh báo toàn cầu.

Trong hau hết các trường hợp, bệnh ảnh hưởng đến heo nuôi, vật chủ hoang đã như là heo rừng hoặc heo hoang khác; vi-rút gây bệnh có khả năng tồn tại trên các yếu tố trung gian truyền bệnh (vi dụ: xác heo, môi trường xung quanh bị ô nhiễm, dụng cụ, các véc-tơ cơ học khác) và các véc-tơ động vật chân đốt (ve mềm). Điều đáng ngại là các biện pháp kiểm soát chủ yếu dựa vào các biện pháp an toàn sinh học nghiêm ngặt do hiện tại không có vắc-xin phòng bệnh hoặc bất kỳ phương pháp điều trị nào. Lịch sử Năm 1921, Montgomery - một chuyên gia thú y đã mô tả một căn bệnh gây ra xuất huyết cấp tính với tỷ lệ chết lên đến 100% tại bốn trang trại ở Kenya, Đông Phi (Eustace Montgomery, 1921). Sau khi được công bố xuất hiện, bệnh đã nhanh chóng được ghi nhận ở hau hết các nước Châu Phi.

Năm 1957, ASF xuất hiện tại Bồ Dao Nha, đánh dau việc dịch bệnh đã thoát khỏi Châu Phi và sau đó lan khắp châu Âu. Bệnh cũng đã ghi nhận ở khu vực Caribe, Nam Mỹ và một số nước châu Á. Tháng 8 năm 2018, dịch bệnh nỗ ra ở Trung Quốc và nhanh chóng lây lan sang nhiều nước châu A làm ảnh hưởng lớn tới tong đàn heo ở nhiều quốc gia và gây thiệt hại kinh tế nghiêm trong trong ngành chăn nuôi heo. Vào ngày 19/2/2019, tại Việt Nam bộ Nông nghiệp va Phát triển Nông thôn chính thức thông báo bệnh Dịch tả heo Châu Phi đã có những 6 dich đầu tiên ở 2 tỉnh phía Bắc Việt Nam.

Sau đó tất cả 63 tỉnh và thành phố đã báo cáo dịch bệnh và khoảng 6.000 con heo đã bị tiêu hủy (FAO, 2019). Hơn 50 quốc gia trên cả bốn châu lục (Châu A, Châu Âu, Châu Phi và Châu Mỹ) đã công bố xuất hiện ASF. Theo báo cáo của WOAH, hiện tại châu A là nơi đang chịu ảnh hưởng nhất (Hình 1. Bệnh đã từng được kiểm soát thành công ở nhiều vùng trên thế giới đặc biệt là trên heo nhà.

Do đó, bệnh dịch tả heo châu Phi ở Việt Nam mặc dù gây thiệt hai nặng nề nhưng vẫn có khả năng kiểm soát nêu thực hiện tôt các biện pháp an toàn sinh học và chân đoán sớm. Armenia HaiseDominican Republic _ : 27. Azerbaijan 2 LA ppines 28. Latvia Cote d'Ivoire Ye Papua New 30.

Lithuania y ` &~ Guinea 31, Nepal 12, Poland Democratic Repub ean 32. Romania oftheCongo 7, nig i 33. Mozambique 16, Burkina Faso Medagiscar 36. Ghana Soule ans 38, Croatia 19.

Republic of the Congo 20. Uganda No information/never reported/ASF absent Es: outbreaks recorded from 2005 to 2017S outbreak reported in2018 ẨM Firstoutbreak reported in 2019 [ir irstoureax reported in 2020 _ Fisstoutwreakreportea in 2021 [i Fisstouvreax reported in 2022 Hiricstoutbreak reported in 2023 Hình 1. Phân bố toàn cau ASF, 2005-2023. Nguồn: (Wang và c., 2024) Bản đồ này dựa trên dữ liệu từ Báo cáo tình hình dịch tả heo châu Phi của WOAH (https://www.org/en/disease/african-swine-fever/fui-id-2, truy cập ngày 10 thang I2 nam 2023) va Báo cáo Giám sát Dịch bệnh toàn cầu (https://www.org/global-disease-surveillance-reports, truy cập vào ngày 10 tháng 12 năm 2023).

Tên của các quốc gia có ASF được đưa ra trên bản đồ. Các quốc gia tiếp tục bùng phát ASF được gắn nhãn năm mà đợt bùng phat đầu tiên được báo cáo kể từ năm 2005. Đặc điểm cấu trúc của vi-rút ASF Bệnh Dich tả heo châu Phi do vi-rút thuộc họ Asfarviridae, giỗng Asfivirus, nhân lên trong tế bao chat của tế bào bị nhiễm. ASFV là vi-rút có cau trúc phức tạp, kích thước lớn, có vỏ bọc ngoài (envelop).

Dưới kinh hiển vi điện tử, đường kính trung bình của hạt vi-rút khoảng 200 nm chứa lõi nucleoprotein có đường kính khoảng 80 nm. Bộ gen chứa nucleoid dày đặc electron được bao bọc trong mang lipid và được bao phủ bởi một capsid hình khối hai mươi mặt, được tạo thành từ 1892-2172 capsome (Elsukova và cs, 2017). Bộ gen vi-rút chứa vùng trung tâm bảo tồn khoảng 125kbp và hai đầu biến đổi, dẫn đến kích thước bộ gen thay đôi (Chapman và cs, 2008; de Villiers va cs, 2010; Dixon va cs, 2013). Những vùng có thé biến đổi mã hóa cho multigene family (MGFs) góp phần tạo nên tính đa dạng của bộ gen vi-rút.

Năm MGFs (MGF100, MGF110, MGF300, MGF360, MGF505) được đặt tên dựa trên độ dài axit amin trung bình của chúng và có thể có nguồn gốc từ sự sao chép và đa dạng hóa gen. Số lượng bộ gen vi-rút được phát hiện đã tăng lên nhanh chóng khi công nghệ giải trình tự DNA phát trién. Sự đa dạng di truyền của ASFV được cho là can trở sự phát triển của vắc-xin hoặc thuốc hiệu quả chống lại vi-rút đã được trình bày trong nhiều nghiên cứu (Arabyan và cs, 2018; Escribano và cs, 2013; Sánchez-Cordón va cs, 2019). Bộ gen ASFV chứa các gen mã hóa, các protein liên quan đến quá trình sao chép của vi-rút, các protein cấu trúc, các protein khác liên quan đến quá trình lắp ráp vi-rút, sự lẫn tránh của hệ thống miễn dịch và chức năng tế bào vật chủ (Alejo và cs, 2018; Dixon và cs, 2013; Kefler va cs, 2018).

Outer envelope „ Capsid (VP72) Inner envelope » Matrix Nucleoid Genomic DNA Hình 1. Mô hình hat virion vi-rat DTHCP (Nguồn: Salas & Andrés, 2013). 0 50 100 150 200 kb REGIÓN CENTRAL CONSERVADA REGION VARIABLE IZDA 99% consv. = 125,2-126,3 KB REGION VARIABLE DCHA 38-47 Kb 13-16 Kb Hình 1.

Doan gen của vi-rút Dich ta heo Chau Phi (Cục Thú y, 2019) Một số kết quả nghiên cứu cho thấy hơn 50 protein cấu trúc được đóng gói thành virion và hoạt động trong nhiễm vi-rút như pp220, pp62, p72, p54, p30, CD2v, p10, p12, p14. Pp220 va pp62 là tiền chat polyprotein vi-rút ASF sau khi trai qua quá trình phân cắt tạo thành các sản pham thiết yếu (protein virion) của hat vi-rút. P54 va p30 là các protein cấu trúc kháng nguyên rất quan trọng. P72 là thành phần chính của khối hai mươi mặt vi-rút, và rất quan trọng trong việc hình thành capsid vi-rút trong biểu hiện nhiễm vi-rút muộn.

CD2v là một glycoprotein, có thé có một vai trò trong cơ chế gây bệnh của nhiễm vi-rút ASF và trốn tránh miễn dich ở vật chủ.5 và p17 có liên quan đến sự hap phụ vi-rút ASF và vận chuyền virion (Jia va cs, 2017). Cấu trúc proteins liên quan đến khả năng xâm nhiễm và nhân lên vi-rút ASE. Kích thước Tên protein được Tên gen Chức năng của protein protein dự đoán (kDa) P11.1 Sự bám dính cua vi-rút P10 A78R 8.4 Sự bám dính của vI-rút Protein capsid quan trọng, liên quan P72 B646L 73.2 , PP PHẾ '= dén sự xâm nhập của vi-rut Tiền chất polyprotein của p150, p37, Pp220 CP2475L 281.5 pl4 va p34; được dùng cho đóng gói 161 nucleoprotein Phosphoryl hóa va protein kháng P32 (p30) CP204L 23.6 nguyên, liên quan đến sự xâm nhập của vi-rut Pp62 (p60) CP530R 60.5 Tiền chat polyprotein của p35 va p15 P12 OG6IR 6.7 Su bam dinh protein Cần thiết cho quá trình day mạnh của P17 DII7L 13.1 tiền chất màng đến khối hai mươi mặt của hạt vI-rút Gan vào chuỗi LC8 của dynein, liên ; quan đến sự xâm nhập của vi-rút, cần P54 G13L) EI83L 19.9 " 4 , thiệt cho sự tập trung các tiên chat vỏ đến nhà máy Protein liên kết DNA, cần thiết cho sự P14.6 di chuyên của các virion tới mang sinh chất Tương tự như protein CD2 của vật chủ, cần thiết dé gắn kết các tế bào CD2v 3 : : „ EP402R 45.3 hong câu với các tê bào bi nhiễm va (PEP402R) các hạt vi-rit ngoại bao; glycoprotein được chèn vào vỏ vi-rút bên ngoài Nguồn: (Jia và cs, 2017) Protein p30 với trọng lượng phân tử tương đối là 30kDa được mã hóa bởi gen CP204L nằm ở màng trong của vỏ vi-rút. Trong số các protein cấu trúc tạo nên virion của vi-rút ASF, p30 là một trong những protein gây đáp ứng miễn dich cao nhất và được tạo ra sớm trước khi bắt đầu tong hop DNA của vi-rút và không bị biến đổi trong suốt vòng đời.

Hai đặc điểm này làm cho p30 trở thành mục tiêu lý tưởng cho xét nghiệm chân đoán sớm dé phát hiện nhiễm vi-rút ASF (Afonso va cs, 1992; Prados và es, 1993). Sức đề kháng của vi-rút ASE ASFV tôn tại rất lâu ở những điều kiện khác nhau. Vi-rút bị bat hoạt ở 60°C trong 30 phút. Hiệu giá vi-rút bị giảm khi bị tác động bởi các chất sát trùng như formaldehyde 1%, NaOH 2% và paraphenolic.

Vi-rút có thê được phân lập từ huyết thanh và máu khi được giữ ở nhiệt độ phòng trong vòng 18 tháng. Vi-rút tồn tai trong khoảng pH rộng 4- 13 (EFSA, 2010), thời gian dài, có thé nhiều năm ở điều kiện đông lạnh hoặc bảo quản ở 40°C (Dixon và cs, 2005). Trong các sản phẩm từ thịt, vi-rút có thể tồn tại vài tuần đến vài tháng trong thịt đông lạnh hoặc thịt chưa nấu chín. Khi thịt được nấu ở 70°C trong 30 phút thì vi-rút bi bat hoạt (Beltran-Alcrudo và cs, 2017).

Thời gian tồn tại của ASFV trong điều kiện môi trường khác nhau Đối tượng Thời gian sống sót của ASFV Thịt — thịt xay 105 ngày Thịt muối 182 ngày Thịt chế biến (tôi thiêu 30 phút ở 700 °C) 0 ngày Thịt sấy khô 300 ngày Thịt xông khói 30 ngày Thịt đông lạnh 1000 ngày Thịt ướp lạnh 110 ngày Thịt thừa 105 ngày Da/mỡ 300 ngày Máu (giữ ở 4°C) 18 tháng Phân (giữ ở nhiệt độ phòng) 11 ngày Máu phân hủy 15 tuần Chuông/trại nhiễm bệnh 1 tháng Nguồn: (Beltran-Alcrudo và cs, 2017). Cơ chế gây bệnh Quá trình lây nhiễm ASFV bắt đầu với sự hấp phụ của vi-rút lên thụ thể và xâm nhập vào tế bào chủ. Các nghiên cứu ban đầu về sự xâm nhập của ASFV đã mô tả sự kiện này là một quá trình diễn ra trong điều kiện nhiệt độ và pH thấp, phù hợp với môi trường nội bào trong thé trung gian nhập bào (endosome) ở tế bao Vero và đại thực bào heo (Alcami và cs, 1989a, 1989b, 1990; Valdeira & Geraldes, 1985).