Thiết kế vector và biểu hiện gen xylan-beta-xylanase trong E. coli sử dụng pET 32a

Nghiên cứu thiết kế vector biểu hiện gen xylanase beta trong E. coli sử dụng vector pET-32a, mở ra hướng đi mới trong sinh học phân tử.

• Trường học: Trường Đại Học
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Thiết Kế Vector Biểu Hiện Và Biểu Hiện Gen Xylan Beta Xylanase Trong E Coli Sử Dụng Vectorpet 32a
• Loại tài liệu: Đồ Án Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan biểu hiện gen xylan beta xylanase trong E

Xylanase là một nhóm enzyme thủy phân có vai trò quan trọng trong nhiều ngành công nghiệp, từ sản xuất giấy, thực phẩm, đến thức ăn chăn nuôi. Khả năng phân giải xylan – thành phần chính của hemicellulose trong thành tế bào thực vật – giúp enzyme này trở thành một công cụ sinh học giá trị. Để đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng, việc sản xuất xylanase trên quy mô lớn là vô cùng cần thiết. Công nghệ DNA tái tổ hợp mở ra một hướng đi hiệu quả, cho phép sản xuất protein tái tổ hợp với số lượng lớn, độ tinh sạch cao và chi phí hợp lý. Trong đó, hệ thống biểu hiện E. coli là một trong những lựa chọn phổ biến nhất nhờ những ưu điểm vượt trội. Hệ thống này cho phép thao tác di truyền dễ dàng, tốc độ tăng trưởng nhanh, môi trường nuôi cấy đơn giản và khả năng biểu hiện protein ngoại lai ở mức độ cao. Nghiên cứu về thiết kế vector biểu hiện và biểu hiện gen xylan beta xylanase trong E. coli sử dụng vector pET 32a nhằm mục tiêu tạo ra enzyme xylanase tái tổ hợp có hoạt tính tốt, phục vụ cho các ứng dụng thực tiễn. Việc lựa chọn vector pET system, cụ thể là pET-32a(+), và chủng chủ E. coli BL21(DE3) được xem là nền tảng để đạt được hiệu suất biểu hiện cao, tạo tiền đề cho các bước tinh sạch và khảo sát đặc tính enzyme sau này.

1.1. Vai trò của enzyme xylanase trong công nghiệp hiện đại

Enzyme xylanase có khả năng thủy phân liên kết β-1,4-glycoside trong mạch chính của xylan, một polysaccharide phổ biến trong sinh khối thực vật. Nhờ đặc tính này, xylanase được ứng dụng rộng rãi. Trong công nghiệp giấy và bột giấy, enzyme giúp loại bỏ lignin một cách sinh học, giảm thiểu việc sử dụng hóa chất tẩy trắng độc hại. Trong ngành thực phẩm, xylanase cải thiện cấu trúc và độ mềm của bánh mì. Đối với ngành thức ăn chăn nuôi, việc bổ sung xylanase vào khẩu phần ăn giúp vật nuôi tiêu hóa tốt hơn các loại ngũ cốc chứa nhiều chất xơ, từ đó tăng hiệu quả hấp thụ dinh dưỡng. Nhu cầu về một nguồn cung cấp enzyme ổn định, hoạt tính cao đã thúc đẩy các nghiên cứu sản xuất enzyme bằng công nghệ sinh học.

1.2. Lợi ích của hệ thống biểu hiện E. coli trong sản xuất protein

Hệ thống biểu hiện E. coli là công cụ đắc lực trong sản xuất protein tái tổ hợp. Ưu điểm chính của hệ thống này bao gồm tốc độ sinh trưởng nhanh của vi khuẩn, cho phép thu sinh khối lớn trong thời gian ngắn. Môi trường nuôi cấy E. coli tương đối đơn giản và chi phí thấp so với các hệ thống biểu hiện ở tế bào eukaryote. Hơn nữa, bộ gen của E. coli đã được giải mã hoàn toàn và có nhiều công cụ di truyền (như các loại plasmid biểu hiện, chủng đột biến) được phát triển, giúp việc tạo dòng gen và tối ưu hóa biểu hiện protein trở nên thuận lợi. Các promoter mạnh như T7 promoter trong vector pET system cho phép biểu hiện gen ngoại lai ở mức rất cao, chiếm tới 50% tổng protein của tế bào.

II. Thách thức thường gặp khi biểu hiện gen xylanase dị hợp

Mặc dù hệ thống biểu hiện E. coli có nhiều ưu điểm, quá trình biểu hiện protein dị hợp vẫn đối mặt với không ít thách thức. Một trong những vấn đề phổ biến nhất là sự hình thành các thể vùi (inclusion bodies) không tan, nơi các chuỗi polypeptide được tổng hợp quá nhanh và không kịp cuộn gập thành cấu trúc không gian ba chiều đúng. Điều này làm cho protein mất hoạt tính sinh học và đòi hỏi các quy trình tái cuộn gập phức tạp, tốn kém. Một thách thức khác là sự phân hủy protein tái tổ hợp bởi hệ thống protease nội bào của E. coli. Các protein ngoại lai, đặc biệt là những protein có kích thước nhỏ hoặc cấu trúc bất thường, có thể bị nhận diện và phân giải, làm giảm đáng kể hiệu suất thu nhận sản phẩm cuối cùng. Để khắc phục những vấn đề này, các nhà khoa học thường áp dụng các chiến lược như sử dụng thẻ dung hợp, tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, nồng độ chất cảm ứng) và lựa chọn các chủng chủ E. coli được biến đổi di truyền để giảm hoạt tính protease. Việc lựa chọn vector và chủng chủ phù hợp, như vector pET 32a với thẻ dung hợp thioredoxin (Trx-Tag) và chủng E. coli BL21(DE3), là một bước đi chiến lược để giải quyết các thách thức này.

2.1. Vấn đề hình thành thể vùi inclusion bodies khi biểu hiện

Khi một gen ngoại lai được biểu hiện ở mức độ rất cao dưới sự điều khiển của một promoter mạnh, hệ thống máy móc dịch mã của tế bào chủ có thể bị quá tải. Các chuỗi polypeptide mới tổng hợp không có đủ thời gian hoặc các protein chaperone hỗ trợ để cuộn gập đúng cách. Thay vào đó, chúng tương tác với nhau thông qua các vùng kỵ nước và kết tụ lại thành các tiểu thể protein không tan, gọi là thể vùi. Mặc dù thể vùi giúp bảo vệ protein khỏi sự phân giải của protease, việc thu nhận lại protein có hoạt tính từ đây là một quá trình khó khăn, đòi hỏi các bước biến tính bằng hóa chất mạnh (như urea, guanidine-HCl) và sau đó là tái cuộn gập, thường cho hiệu suất thấp.

2.2. Sự phân hủy protein ngoại lai bởi protease của tế bào chủ

Tế bào E. coli sở hữu nhiều loại protease nội bào có chức năng loại bỏ các protein bị sai hỏng hoặc không cần thiết. Các protein ngoại lai, do có cấu trúc và trình tự axit amin lạ, đôi khi bị hệ thống kiểm soát chất lượng protein này nhận diện là mục tiêu cần phân giải. Chủng E. coli BL21(DE3) được ưa chuộng một phần vì nó thiếu hụt hai loại protease chính là Lon và OmpT, giúp làm tăng độ ổn định của nhiều protein tái tổ hợp. Ngoài ra, việc gắn protein mục tiêu với một protein dung hợp lớn và ổn định, như thẻ dung hợp thioredoxin (Trx-Tag), cũng là một cách hiệu quả để che chắn, bảo vệ protein khỏi sự tấn công của protease, đồng thời hỗ trợ quá trình cuộn gập đúng.

III. Hướng dẫn thiết kế vector biểu hiện gen xylanase pET32a

Quá trình thiết kế vector biểu hiện là bước nền tảng quyết định sự thành công của việc sản xuất protein tái tổ hợp. Trong nghiên cứu này, mục tiêu là tạo ra plasmid pET32-xbx bằng cách chèn gen xyl (cụ thể là gen xbx mã hóa cho xylan beta xylanase) vào plasmid biểu hiện pET-32a(+). Quy trình bắt đầu bằng việc khuếch đại gen xbx mục tiêu từ một plasmid nguồn (pBlue-xbx) bằng kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase (PCR). Cặp mồi được thiết kế đặc hiệu để tạo ra sản phẩm PCR có chứa vị trí nhận biết của enzyme cắt giới hạn NcoI và XhoI ở hai đầu. Sau đó, cả sản phẩm PCR và vector pET-32a(+) đều được xử lý bằng cặp enzyme này để tạo ra các đầu dính tương thích. Phản ứng nối (ligation) được thực hiện nhờ enzyme T4 DNA ligase, giúp gắn gen xbx vào khung đọc của vector. Cuối cùng, plasmid tái tổ hợp pET32-xbx được biến nạp vào tế bào E. coli để nhân dòng và kiểm tra lại bằng enzyme cắt giới hạn nhằm xác nhận cấu trúc chính xác trước khi chuyển sang giai đoạn biểu hiện.

3.1. Quy trình khuếch đại gen xbx bằng kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR được sử dụng để nhân đoạn gen xyl (xbx) có chiều dài lý thuyết khoảng 1410 bp. Phản ứng được tối ưu hóa về nhiệt độ gắn mồi và chu kỳ nhiệt để đảm bảo tính đặc hiệu và hiệu suất cao. Enzyme Taq polymerase chịu nhiệt được sử dụng để tổng hợp chuỗi DNA mới. Kết quả của phản ứng PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose. Theo tài liệu gốc, một vạch sáng, sắc nét duy nhất có kích thước khoảng 1.4 kb đã được quan sát, tương ứng với kích thước dự kiến của gen xbx. Điều này khẳng định quá trình khuếch đại đã thành công và sản phẩm PCR đủ chất lượng cho các bước tiếp theo trong quy trình tạo dòng gen.

3.2. Kỹ thuật tạo dòng gen vào plasmid biểu hiện pET 32a

Để chèn gen xbx vào vector, cả sản phẩm PCR và plasmid biểu hiện pET-32a(+) được cắt bằng hai enzyme giới hạn NcoI và XhoI. Việc sử dụng hai enzyme khác nhau đảm bảo gen được chèn vào vector theo đúng một chiều mong muốn. Sau khi cắt, các đoạn DNA được tinh sạch để loại bỏ enzyme và các thành phần khác của phản ứng. Phản ứng nối được xúc tác bởi T4 DNA ligase, hình thành liên kết phosphodiester bền vững giữa gen và vector, tạo ra plasmid tái tổ hợp pET32-xbx. Hỗn hợp sản phẩm sau đó được sử dụng để biến nạp vào tế bào E. coli chủ.

3.3. Kiểm tra vector tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn

Sau khi biến nạp và chọn lọc các dòng E. coli mang plasmid, bước kiểm tra là bắt buộc để xác nhận cấu trúc của plasmid tái tổ hợp. DNA plasmid được tách chiết từ các dòng vi khuẩn tiềm năng. Để kiểm tra, một cặp enzyme khác, XhoI và XbaI, được sử dụng. Theo bản đồ vector, việc cắt bằng cặp enzyme này sẽ tạo ra hai đoạn DNA có kích thước dự kiến là 5383 bp và 1927 bp. Kết quả điện di gel agarose cho thấy sự xuất hiện của hai băng DNA có kích thước đúng như tính toán lý thuyết, khẳng định rằng gen xyl đã được chèn thành công và chính xác vào vector pET-32a(+) để tạo ra pET32-xbx.

IV. Phương pháp biểu hiện gen xylan beta xylanase trong E

Sau khi xác nhận thành công cấu trúc của vector tái tổ hợp pET32-xbx, bước tiếp theo là biểu hiện protein dị hợp trong chủng chủ chuyên dụng. Plasmid pET32-xbx được biến nạp vào chủng E. coli BL21(DE3) bằng phương pháp sốc nhiệt. Chủng này được lựa chọn vì nó mang gen mã hóa cho T7 RNA polymerase trong bộ gen, dưới sự kiểm soát của promoter lac. Do đó, sự biểu hiện của gen mục tiêu (được đặt sau promoter T7 trên vector pET) có thể được kiểm soát chặt chẽ. Quá trình nuôi cấy được tiến hành trong môi trường LB cho đến khi tế bào đạt đến pha sinh trưởng logarit (OD600 khoảng 0.8-1.2). Tại thời điểm này, quá trình biểu hiện được kích hoạt bằng cách bổ sung chất cảm ứng IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside). IPTG sẽ làm bất hoạt chất ức chế LacI, cho phép T7 RNA polymerase được phiên mã, từ đó khởi động quá trình phiên mã mạnh mẽ gen xbx từ promoter T7 trên plasmid. Các điều kiện sau cảm ứng như nhiệt độ (30°C) và thời gian (5 giờ) được điều chỉnh để tối ưu hóa biểu hiện protein và tăng khả năng thu nhận protein ở dạng tan.

4.1. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào chủng chủ E. coli BL21 DE3

Plasmid pET32-xbx được đưa vào tế bào E. coli BL21(DE3) khả biến thông qua phương pháp sốc nhiệt. Tế bào được xử lý trước bằng dung dịch CaCl2 lạnh để làm tăng tính thấm của màng. Sau đó, plasmid được trộn với tế bào và ủ trên đá, tiếp theo là một cú sốc nhiệt ngắn ở 42°C. Quá trình này tạo ra các lỗ tạm thời trên màng tế bào, cho phép plasmid đi vào bên trong. Các tế bào sau biến nạp được nuôi trên môi trường thạch LB có chứa kháng sinh ampicillin. Chỉ những tế bào đã nhận thành công plasmid (mang gen kháng ampicillin) mới có thể phát triển, tạo thành các khuẩn lạc riêng lẻ.

4.2. Quá trình cảm ứng biểu hiện bằng IPTG để tổng hợp protein

Sự cảm ứng biểu hiện bằng IPTG là một cơ chế điều hòa kinh điển và hiệu quả trong vector pET system. IPTG là một phân tử tương tự allolactose, có khả năng liên kết và làm thay đổi cấu hình của chất ức chế LacI, khiến nó không thể bám vào operator lac trên bộ gen của E. coli. Điều này giải phóng sự ức chế, cho phép RNA polymerase của tế bào chủ phiên mã gen T7 RNA polymerase. Enzyme T7 RNA polymerase sau đó nhận diện promoter T7 trên plasmid pET32-xbx và tiến hành phiên mã gen xbx với tốc độ rất cao, dẫn đến sự tích lũy một lượng lớn protein tái tổ hợp trong tế bào. Nồng độ IPTG cuối cùng là 0.5 mM được sử dụng để đảm bảo quá trình cảm ứng diễn ra mạnh mẽ.

4.3. Vai trò của thẻ dung hợp thioredoxin Trx Tag trong vector

Thẻ dung hợp thioredoxin (Trx-Tag) được mã hóa bởi vector pET-32a(+) và nằm ở đầu N của protein mục tiêu. Thẻ này đóng nhiều vai trò quan trọng. Thioredoxin là một protein rất dễ tan, do đó việc dung hợp nó với protein xylanase giúp làm tăng đáng kể độ tan của protein tái tổ hợp, giảm nguy cơ hình thành thể vùi. Ngoài ra, thioredoxin hoạt động như một chaperone nội phân tử, hỗ trợ quá trình cuộn gập không gian ba chiều của protein xylanase diễn ra chính xác. Điều này rất quan trọng để thu được enzyme có hoạt tính sinh học. Hơn nữa, protein dung hợp còn chứa một đoạn His-tag (6xHis), tạo điều kiện thuận lợi cho bước tinh sạch sau này.

V. Phân tích kết quả biểu hiện protein xylanase tái tổ hợp

Để đánh giá hiệu quả của quá trình biểu hiện gen, việc phân tích sự hiện diện và đặc tính của protein tái tổ hợp là bước không thể thiếu. Sau khi nuôi cấy và cảm ứng bằng IPTG, tế bào E. coli được thu nhận bằng ly tâm. Tổng protein của tế bào được chiết xuất bằng cách phá vỡ tế bào. Phương pháp chính để phân tích là phân tích điện di SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis). Kỹ thuật này cho phép tách các protein dựa trên khối lượng phân tử của chúng. Theo tính toán, gen xbx mã hóa cho một protein có kích thước khoảng 48 kDa, và thẻ dung hợp thioredoxin (Trx-Tag) cùng các đoạn peptide khác từ vector pET-32a(+) có kích thước khoảng 20 kDa. Do đó, protein dung hợp Trx-xbx được kỳ vọng có khối lượng phân tử tổng cộng khoảng 68 kDa. Kết quả điện di cho thấy sự xuất hiện của một băng protein đậm nét ở vị trí tương ứng với 68 kDa ở các dòng mang plasmid pET32-xbx được cảm ứng, trong khi băng này không có ở dòng đối chứng âm. Điều này là bằng chứng rõ ràng cho sự biểu hiện thành công của protein xylanase dung hợp.

5.1. Xác nhận protein dung hợp bằng phân tích điện di SDS PAGE

Kết quả phân tích điện di SDS-PAGE trên gel polyacrylamide 14% đã so sánh protein tổng số từ các dòng E. coli mang pET32-xbx và dòng đối chứng mang vector pET-32a(+) rỗng. Ở dòng đối chứng, một băng đậm ở khoảng 20 kDa xuất hiện, tương ứng với protein Trx-Tag được biểu hiện riêng lẻ. Ngược lại, ở các dòng mang gen xbx, băng 20 kDa này mờ đi và thay vào đó là một băng protein mới, rất đậm ở vị trí khoảng 68 kDa. Sự chênh lệch khối lượng phân tử này hoàn toàn phù hợp với khối lượng của protein xylanase được gắn thêm vào. Dữ liệu này khẳng định rằng gen xbx đã được phiên mã và dịch mã thành công thành protein dung hợp như thiết kế.

5.2. Đánh giá sự biểu hiện protein tái tổ hợp ở pha tan

Một yếu tố quan trọng là xác định protein tái tổ hợp được biểu hiện ở dạng tan (có hoạt tính) hay không tan (thể vùi). Tế bào sau khi thu hoạch được phá vỡ bằng sóng siêu âm. Dịch ly giải tế bào sau đó được ly tâm ở tốc độ cao để tách phần dịch nổi chứa protein tan (pha tan) và phần cặn chứa protein không tan và mảnh vỡ tế bào (pha không tan). Các mẫu từ protein tổng số, pha tan và pha không tan được đem đi điện di. Kết quả cho thấy băng protein 68 kDa xuất hiện chủ yếu ở làn chạy của mẫu pha tan. Điều này chứng tỏ phần lớn protein dung hợp Trx-xbx đã cuộn gập đúng và tồn tại ở dạng hòa tan trong tế bào chất, một kết quả rất tích cực cho các bước tinh sạch và khảo sát hoạt tính tiếp theo.

5.3. Triển vọng tinh sạch protein His tag bằng sắc ký ái lực

Vector pET-32a(+) được thiết kế sẵn một đoạn mã hóa cho 6 axit amin histidine liên tiếp (His-tag). Đoạn His-tag này có ái lực mạnh với các ion kim loại hóa trị hai như Niken (Ni2+) hoặc Coban (Co2+). Dựa trên nguyên lý này, phương pháp sắc ký ái lực kim loại IMAC (Immobilized Metal Affinity Chromatography) có thể được sử dụng để tinh sạch protein dung hợp một cách hiệu quả. Dịch protein tan sẽ được cho đi qua một cột sắc ký chứa các hạt nhựa gắn sẵn ion Ni2+. Chỉ có protein mang His-tag mới bị giữ lại trên cột, trong khi các protein khác của tế bào chủ sẽ đi qua. Sau đó, protein mục tiêu có thể được rửa giải ra khỏi cột bằng một dung dịch có chứa imidazole ở nồng độ cao, thu được sản phẩm có độ tinh sạch cao.

VI. Tiềm năng ứng dụng từ biểu hiện gen xylanase thành công

Nghiên cứu đã đạt được những kết quả quan trọng, khẳng định việc thiết kế vector biểu hiện và biểu hiện gen xylan beta xylanase trong E. coli sử dụng vector pET 32a đã thành công. Cụ thể, vector tái tổ hợp pET32-xbx đã được tạo dòng chính xác và gen xbx đã được biểu hiện mạnh mẽ dưới dạng protein dung hợp với thẻ dung hợp thioredoxin (Trx-Tag). Một trong những thành công lớn nhất là protein tái tổ hợp được biểu hiện chủ yếu ở dạng hòa tan, tạo điều kiện thuận lợi cho các bước nghiên cứu tiếp theo. Từ nền tảng này, các bước tiếp theo sẽ tập trung vào việc tối ưu hóa biểu hiện protein ở quy mô lớn hơn, thực hiện quy trình tinh sạch protein His-tag bằng phương pháp sắc ký ái lực kim loại IMAC để thu nhận enzyme có độ tinh sạch cao. Sau khi tinh sạch, việc xác định các đặc tính sinh hóa và hoạt tính enzyme xylanase là cần thiết để đánh giá tiềm năng ứng dụng của nó. Enzyme xylanase tái tổ hợp này hứa hẹn sẽ là một sản phẩm sinh học giá trị, có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực công nghiệp, góp phần phát triển nền kinh tế sinh học bền vững.

6.1. Hướng tới tối ưu hóa biểu hiện protein quy mô lớn

Để đáp ứng nhu cầu công nghiệp, việc chuyển từ quy mô phòng thí nghiệm sang quy mô sản xuất lớn hơn (fermentation) là bước đi tất yếu. Quá trình này đòi hỏi việc tối ưu hóa biểu hiện protein một cách toàn diện. Các yếu tố cần được khảo sát bao gồm thành phần môi trường nuôi cấy, mật độ tế bào tại thời điểm cảm ứng, nồng độ chất cảm ứng IPTG, nhiệt độ và thời gian nuôi cấy sau cảm ứng. Mục tiêu là tìm ra điều kiện cho phép thu được lượng protein tan lớn nhất trên một đơn vị thể tích nuôi cấy, đồng thời giảm thiểu chi phí sản xuất.

6.2. Các bước tiếp theo tinh sạch và xác định hoạt tính enzyme

Sau khi tối ưu hóa quá trình biểu hiện, protein dung hợp Trx-xbx sẽ được tinh sạch với độ tinh khiết cao bằng sắc ký ái lực kim loại IMAC. Enzyme tinh sạch sau đó sẽ được sử dụng để khảo sát các đặc tính quan trọng. Hoạt tính enzyme xylanase sẽ được xác định bằng cách đo lượng đường khử giải phóng ra từ cơ chất xylan. Các thông số động học như nhiệt độ tối ưu, pH tối ưu, độ bền nhiệt và ảnh hưởng của các ion kim loại lên hoạt tính enzyme cũng sẽ được nghiên cứu chi tiết. Các dữ liệu này rất quan trọng để đánh giá xem enzyme có phù hợp với điều kiện của các quy trình công nghiệp cụ thể hay không.

6.3. Ứng dụng thực tiễn của enzyme xylanase tái tổ hợp

Với việc sản xuất thành công, enzyme xylanase tái tổ hợp có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. Trong công nghiệp giấy, nó có thể được sử dụng trong giai đoạn tiền xử lý bột giấy để tăng hiệu quả tẩy trắng. Trong ngành sản xuất bánh mì, nó giúp cải thiện chất lượng bột nhào và thể tích bánh. Trong ngành thức ăn chăn nuôi, enzyme này giúp phá vỡ các polysaccharide khó tiêu, tăng cường giá trị dinh dưỡng của thức ăn. Việc chủ động sản xuất được enzyme bằng công nghệ DNA tái tổ hợp không chỉ giúp giảm giá thành sản phẩm mà còn mở ra cơ hội phát triển các chế phẩm enzyme 'made-in-Vietnam' có chất lượng cao.

Trích đoạn nội dung tài liệu

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC _____ ***_____ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Thư viện Viện Đại học Mớ Hà Nội Đề tài;“ Thiết kế vecrtor biểu hiện và biểu hiện gen xylan-beta-xylanase trong E. coli sử dụng vectorpET 32a(+)” Giáo viên hướng dẫn:TS. Đỗ Thị Huyền Sinh viên thực hiện: Hoàng Thị Hưoìig Lóp: CNSH- 11-02 Hà Nội, 2015 Viện Đại học Mỏ' Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học LỜI CẢM ON Trước hết, tôi xin bày tó lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Đỗ Thị Huyền, Phòng Kĩ Thuật di truyền - Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã tận tình hướng dan, dìu dắt tôi trong suốt quá trình hoàn thiện luận văn này.

Tôi xin chân thành cám ơn các tháy cô giáo Khoa Công Nghệ Sinh Học - Trường Viện Đại học Mớ Hà Nội đã giáng dạy, giúp đỡ tôi trong suất quá trình học tập và thực hiện luận văn. Tôi xin gừi lời cám ơn tới toàn thê các anh, các chị làm việc và học tập tại Phòng Kỹ thuật di truyền - Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ chi bào tôi tận tình trong suốt thời gian thực hiện luận văn. Cuối cùng tôi xin gửi tới gia đình, bạn bè và đồng nghiệp lòng biết ơn sâu sắc vì sự quan tâm, động viên yồ SỵP\ý troi\g suọt qứá trình học. tập và hoàn thành luận ván.

Sinh viên thực hiện Hoàng Thị Hưong Hoàng Thị Hương Viện Đại học Mỏ' Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học MỤC LỤC MỤC LỤC NHỬNG TỪ VIẾT TÁT DANH MỤC HÌNH VÈ MỚ ĐÀU. TỎNG QUAN TÀI LIỆU. Đại cương về xylanase. Phân loại xy lanase.

Cấu (rúc của xylanase. 4 , ,_ Thu yien Yien Đại học Mớ Hà Nội 1. Cơ chê xúc tác của xylanase. Đặc tính của xylanase.

ứng dụng của xylanase. Biếu hiện gen. Hệ biểu hiện E. Chủng biểu hiện E.

Vector biểu hiện pET 32a(+).VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚU. 18 Hoàng Thị Hương Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học 2.1 Nguồn gen, chủngvisinhvậtvà plasmid.2 Hóa chất và enzyme. Máy móc và thiết bị.4 Các môi trường và dung dịch.2 Phươngphápnghiêncứu. Khuếch đại in vitro DNA bàng phán ứng trùng hợp polymerase (PCR).

Phàn ứng nổi gen ngoại lai vào plasmid. Phương pháp xừ lý DNA plasmid bằng enzyme cắt hạn chế. Phương pháp điện di trên gel agarose. Tinh chế DNA bằng QIAGEN được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuât.

TlYu"việnViện"Đạí"hực"M'ờ'Hầ"NỘỈ. Phương pháp biến nạp DNA plasmid vào tế bào E.coli bắng phương pháp sốc nhiệt. Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ tế bào E. Phương pháp điện di trên gel polyacrymide - SDS.

Cảm ứng, biểu hiện protein ngoại lai. KÉT QUẢ NGHIÊN cửu VÀ THAO LUẬN. Thiết ke vector bieu hiện pET32a(+) mang gen xbx.Khuếch đại gen xbx bằng kĩ thuật PCR. Cắt sán phẩm PCR gen xbxvằ pET32a(+)bằng Ncoỉ+Xhoỉ.

Nối ghép gen xbx vào vector biểu hiện pET 32a(+). 25 Hoàng Thị Hương Viện Đại học Mỏ' Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học 3. Cắt kiểm tra pET.rfer bàng Xhoĩ+Xbaỉ. Biếu hiện gcn xbx trong E.

28 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 37 Thư viện Viện Đại học Mớ Hà Nội Hoàng Thị Hưong Viện Đại học Mỏ' Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học NHỮNG từ viét tẳt Amp Ampicicillin Bp Base pair DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucleoside triphosphate E. coli Escherichia coll EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid EtBr Ethidium bromide IPTG Isopropyl P-D-1 -thiogalactopyranoside kb Kilo base kDa Thư KÌậrDlítbận Đại học Mớ Hà Nội LB Luria - Bertani medium M Mol/L PCR Polymerase chain reaction RNA Ribonucleic acid SDS Sodium dodecyl sulphate TAE Tris acetate EDTA Tyr Tyrosinase XBX Xylan-beta-xylanase Hoàng Thị Hương Viện Đại học Mỏ' Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học DANH MỤCHÌNH VẼ Hình 1. Cấu trúc hóa học của xylan.

Cấu trúc bậc 3 của xylanase GH10 từ s. Cấu trúc bậc 3 của xylanase GH11 từ s. Cơ chế phán ứng thủy phân của xylan bởi xylanasecủa Bacillus circulans. Các enzyme cần thiết phân cắt hoàn toàn xylan.

Bân đồ vector pET32a(+). Phân tích sàn phấm nhân gen xbx bang kĩ thuật PCR. Phân tích sàn phấm nhân gen xbx bàng kĩ thuật PCR trên gel agarose 0. Thự viên Viện Đại học Mợ Hà Noi, Hình 11.

Kêt quâ điện di tách chiêt các dòng màng vector pET32-xèx. Sơ đồ vị trí cắt của 2 enzyme giới hạn Xhoỉ và Xbaỉ. Ành điện di sản phẩm cắt pET32-xbx các dòng bang enzyme giới hạn Xhoỉ và Xbaỉ trên gel agarose 0,8%. Kết quà điện di kiếm tra protein tống số được biếu hiện ở các dòng tế bào mang pET32-xfec.

Điện di dịch tế bào sau khi siêu ầm đế kiếm tra sự biểu hiện ở pha tan cùa protein xbx trong các dòng tế bào DE3-pET32a-xftx khác nhau. 30 Hoàng Thị Hương Viện Đại học Mỏ' Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học MỎ DÀU Xylanase là enzyme được nhiều nhà khoa học quan tâm. Enzyme này có khả năng thúy phân hiệu quá các xylan - là thành phần chu yếu cùa hemicellulose trong thành tế bào thực vật. Trước đây, việc nghiên cứu xylanase chu yếu được tiến hành trên đối tượng nấm sợi.

Tuy nhiên, gần đây cùng với sự phát mẽ của khoa học công nghệ, ngày càng nhiều chúng vi sinh vật có khả năng sinh xylanase được phát hiện và nghiên cứu sâu. Đong thời, các lĩnh vực liên quan đến enzyme xylanase và ứng dụng của loại enzyme này ờ vi khuẩn được các nhà khoa học ngày càng quan tâm hơn. Do nhu cầu sứ dụng xylanase trong nhiều lĩnh vực ngày càng tăng, đặc biệt nhu cầu enzyme có hoạt tính mạnh, phân cát nhanh đẻ đưa vào ứng dụng trong công nghiệp vẫn đang thiếu. Với mục đích tìm ra những loại xylanase có đặc tính tốt hơn, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu biếu hiện và biếu hiện gen xbxs mã hóa viện?VienJpai hod.__ xylan-beta-xylanase trong E.

coll su dụng vector pE r-32a(+) nhăm thu được xylanase tái tố hợp có tính tốt đẻ có thế ứng dụng thực tiễn. Đe tài dược thực hiện tại Phòng Kĩ thuật di truyền. Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. MỤC TIÊU - Thiết kế thành công vector pET 32a(+) mang gen xbxs - Biểu hiện thành công xylanase trongE.

Hoàng Thị Hương Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học PHÀN I. TÒNG QUAN TÀI LIỆU 1. Đại cương về xylanase Xylanse có tên gọi khác là:p-xylanase; endo-l,4-p-xylanase; cndo-l,4-P-D- xylanase;P-D-xylanase;endo-p-1,4-xylan 4-xylanohydrolase; 1,4-P-xylan xylanohydrolase; P-l,4-xylan xylannohydrolase. Tên hệ thống: 4- p-D-xylan xylannohydrolase.

Xylanase là enzyme quan trọng nhất tham gia thũy phân xylan[8. Xylanase thúy phân xylan bằng cách cắt dứt các liên kết p-1,4-glycoside. Cấu trúc hóa học của xylan Xylan là thành phan chính cấu tạo nên hemicellulose cùa thành tế bào thực vật và là một trong số hợp chất polysaccharide quan trọng nhất trong tự nhiên [24, 31].Xylanchủ yếu tìm thấy trong cấu trúc thứ cấp của thành tế bào thực vật và tạo thành pha giữa lignin và các hợp chat polysaccharide khác[41].Xylan cũng là một trong những polysaccharide pho biến nhất trong các loài thực vật thông thường, chiếm 30% tổng trọng lượng khô trong sinh khối thực vật nhiệt đới. Với cây gồ mềm ở vùng ôn dới, xylan ít phổ biến hơn và chiếm khoáng 8% tống trọng lượng khôi 14], 2 Hoàng Thị Hương Viện Đại học Mỏ' Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học Sự phân hủy sinh học bộ khung cấu tạo nên xylan phụ thuộc chù yếu vào hai lớp enzyme: endo-l,4-P-xylanase(EC.

lớp enzyme này thủy phân liên kết 1,4-P-glucoside nối với xylose và p-xylosidase (1,4-p-D-xylan xylaohydrolase; EC 3.37), lớp enzyme này thủy phân xylobise và xylooligosaccharid ngắn nhờ hoạt động của enzyme endo-xylanasc. Các enzyme loại mạch nhánh chăng hạn như a- glucoronidase và a-L-arabinifuranosidase và các esterase chẳng hạn như acetylxylan esterase và ferulyl và p-coumaroyl esterase sẽ loại bó mạch nhánh acetyl và mạch nhánh phenol [14]. Ớ cây gỗ rắn xylan có công thức O-acetyl-4-O- methylglucuron-oxylan. Arabino-4-O-methylglucuroxylan tìm thấy trong cây gỗ mềm và arabinoxylan rat điển hình trong cây cỏ và thực vật bình thường khác [ 141.

Phân loại xylanase Sự đa dạng cùa xylan dần đến sự đa dạng cùa enzyme xylanase[20]. Dựa vào đặc điểm hóa lý, xylanase được phân thành 2 nhóm: một nhóm có phân tứ lượng thấp (<30kDa) và pl acid, nhóm thứ hai .cộ phân tứ lượng cao (>30 kDa) và pl .jnir Viện Viện Đại hỗcMợ riaTNoi , ; base.Mặc dù nhiêu xylanase phù hợp trong những nhóm này nhưng sô lượng các xylanase được mô tá trước đây đã gia tăng rất nhiều và hiện tại nhiều xylanase có những dặc tính trung gian được nhận biết không phù hựp với bất kỳ nhóm phân loại trên nào. Từ 30 họ được xác định vào năm 1991, sự phân loại đã được cập nhật thường xuyên với những enzyme mới phù hợp và hiện tạicó trôn 100 họ (GHI tới GH 106)113|. Hau hết các họ bao gồm những enzyme với những đặc tính cơ chất giống nhau.Tuy nhiên, nhiều họ lại có nhiều đặc điềm khác nhau, enzyme hoạt động trên các carbonhydrate khác nhau.

Việc tìm kiểm những cấu trúc liên quan trong các họ khác nhau dẫn đến kết quả trong việc giới thiệu mức độ thứ bậc của sự phân loại dược biết đến như là siêu họ hoặc quần hợp nhỏ. Dựa trên sự tương đồng về amino acid và cấu trúc không gian các xylanase thường được phân vào họ 10 (trước đây là F) và 11 (trước đây là G)| 12|. Hai họ này lần lượt bao gồm các xylanase cùa các nhóm phân tứ lượng cao, pl thấp và phân tứ lượng thấp, pl cao đã được đe cập trước đây; nhưng mồi họ bao gồm nhiều xylanase Hoàng Thị Hương Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học khác với những đặc điếm hóa lý khác biệt rộng rãi từ hai nhóm này[6.Xylanase thuộc hệ GH10 thuộc nhóm acid xylanase [42].Nhóm họ 10 bao gồm các enzyme thủy phân cellobiose (dần xuất của cellulose) (exocellulase) và endo-p-l,3-xylanase so với xylanase (endo-[3-l,4-xylanase) trong khi họ 11 là đơn tính chất, bao gồm các xylanasc duy nhất.Xylanase thuộc hệ GHI 1 thuộc nhóm alkaline xylanase [42]. Một số lượng nhỏ các xylanase gần đây đã được xác định đặc diem không xuất hiện sự tương tự phù hợp đối với họ 10 và II.

những xylanase này có những tương đồng dối với các enzyme thuộc họ cácenzyme thủy phân glycoside, họ 5, 7. nhóm các họ chứa các xylanase nên được mờ rộng để bao gồm những enzyme mới này [12]. Cấu trúc của xylanase Hình 2.Cấu trúc bậc 3 của xylanase GH10 từ s. Hvidans Cấu trúc bậc 3 của endo-xylanase chú yếu được sắp xếp từ các mãnh p.

Sự khác nhau trong hoạt động xúc tác của các endo-xylanase của họ 10 và 11 được cho là do sự khác nhau trong cấu trúc bậc ba cùa chúng, cấu trúc bậc ba của endo- xylanase họ 10 và 11 được xác định cho hàng loạt các enzym. từ că vi khuấn và nấm mốc. 4 Hoàng Thị Hương Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học Các thành viên họ xylanase 10 có cấu trúc a/p gấp cuộn tám lần và khối lượng phân từ xấp xi 48 kDa.