MỞ ĐẦU Từ lâu các nhà khoa học rất quan tâm tới việc chiết tách các sắc tố từ lá xanh của thực vật bậc cao. Cách đây hơn 100 năm các nhà hóa học đã tách được chất màu xanh từ lá và gọi chúng là Chlorophyll. Vào năm 1913, Richard Willstatter, nhà hóa học người Đức đã chỉ ra rằng tất cả các năng lượng sống đều nhờ mặt trời và cây xanh có một cách nào đó để hấp thụ năng lượng này. Tới năm 1919, ông đã giải thích được chức năng của hợp chất hấp thụ năng lượng mặt trời chính là Chlorophyll.
Thực vật bậc cao có lá xanh đã tự mình hấp thụ năng lượng bức xạ và chuyển hóa thành năng lượng dự trữ trong cơ thể. Chlorophyll giữ vai trò vô cùng quan trọng trong quá trình quang hợp, là chất hấp thụ năng lượng ánh sáng trong hệ quang hợp. Chlorophyll chuyển năng lượng ánh sáng thành năng lượng hóa học trong phân tử ATP, trong quá trình này xảy ra các phản ứng chuyển dịch electron (phản ứng oxy hóa khử). Chlorophyll và các dẫn xuất của chúng là một đối tượng nghiên cứu hấp dẫn và trở thành một lĩnh vực phát triển rộng lớn và được các nhà khoa học quan tâm bao gồm các nghiên cứu về hệ thơm, khả năng hấp thụ ánh sáng, chuyển dời điện tích, tính chất phổ, sinh tổng hợp và các nghiên cứu y dược.
Chlorophyll và các dẫn xuất của chúng có nhiều ứng dụng khác nhau trong y học và công nghiệp. Trong y học, chlorophyll được dùng như một thành phần cơ bản trong khẩu phần ăn kiêng và thuốc chữa bệnh. Chẳng hạn, Cu-chlorophyllin phòng chống ung thư từ thức ăn bị thiu mốc chứa hydrocacbon mạch vòng, aflatoxin. Chlorophyll và các dẫn xuất còn được sử dụng như là chất nhạy sáng để tiêu diệt các tế bào ung thư và chống virus, chất chữa vết thương và khử mùi hôi.
Chlorophyll ức chế phát triển của vi khuẩn, kích thích việc phục hồi các mô đã bị hư hại và ngăn cản tác hại của các chất gây ung thư. Chlorophyll còn có lợi cho hệ tiêu hóa và có tác dụng dưỡng da. Một số dẫn xuất chlorophyll có hoạt tính sinh học quí giá như tiêu diệt tế bào ung thư tủy, virus leukemia, u ác tính (malignant melanoma) theo cơ chế quang trị 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Chlorophyll còn có tác dụng giảm viêm khớp (arthritis), chữa trị u xơ, giảm mùi hôi, giảm đường máu của người bệnh cao tuổi.
Chlorophyll là một nhóm các hợp chất đa dạng bao gồm chlorophyll (a, b, c, d,…), trong đó chlorophyll a phổ biến nhất trong tự nhiên, đó là chlorophyll trong hệ quang hợp của thực vật bậc cao, tảo biển và vi khuẩn quang hợp. Trong thực vật bậc cao hệ thống quang hợp có cấu tạo rất phức tạp và chứa nhiều loại chlorophyll khác nhau. Quá trình tách các chlorophyll ra khỏi nhau rất khó khăn và phức tạp. Trong các loại vi khuẩn quang hợp thì vi khuẩn lam có cấu tạo hệ quang hợp đơn giản nên việc phân lập dễ dàng hơn.
Vì vậy tôi đã lựa chọn “ Tách chiết và chuyển hoá chlorophyll a từ vi khuẩn cyano bacteria” làm đề tài cho luận văn cao học của mình. Mục tiêu của luận văn là tìm ra qui trình tách chiết chlorophyll a một cách hiệu quả ở qui mô phòng thí nghiệm và chuyển hóa chúng để thu được các hợp chất làm trung gian cho quá trình tổng hợp các hoạt chất chữa trị ung thư bằng liệu pháp quang, các chất màu thực phẩm, tổng hợp các hợp chất hấp thụ ánh sáng sử dụng cho pin mặt trời và các sensor. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN 1.1 Cấu tạo và tính chất của hệ quang hợp 1.1 Cấu tạo và tính chất của hệ quang hợp ở thực vật và vi khuẩn Quang hợp là cơ sở năng lượng của sự sống trên trái đất. Chlorophyll hấp thụ năng ánh sáng mặt trời và chuyển quang năng thành hóa năng bởi trung tâm phản ứng trong hệ quang hợp của vi khuẩn và thực vật dưới dạng NADPH và ATP được sử dụng để tổng hợp cacbohydrat (hình 1.1: Năng lượng bức xạ trong tổng hợp của các phân tử hữu cơ Các chlorophyll hấp thụ và biến quang năng thành hoá năng với hiệu suất cao.
Các hệ thống quang hợp (PS) (hình 1.2) được phân loại theo cấu trúc của trung tâm phản ứng chia thành PSI của vi khuẩn lam, PSII của thực vật bậc cao và PS của vi khuẩn tía đều bao gồm bốn thành phần chính là ăng-ten thu sáng, trung tâm phản ứng, trung tâm chuyển điện tử và bộ máy cố định cacbon. [3,5] 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.2: Các hệ thống quang hợp.[28] Trung tâm phản ứng của vi khuẩn tía gồm các tiểu đơn vị protein L và M liên kết với các sắc tố hoạt động và có đối xứng bậc hai. Trung tâm phản ứng được bao quanh bởi hệ thống ăng ten thu sáng (LH1). Các electron được chuyển vào trung tâm phản ứng của một heme-binding cytochrome (cyt).
Trong PSII gồm protein D1 và D2 có cấu trúc và chức năng tương đồng với các tiểu đơn vị L và M của trung tâm phản ứng ở vi khuẩn. Năng lượng ánh sáng được hấp thụ bởi LHCII và chuyển vào trung tâm phản ứng bởi protein-chlorophyll CP43 và CP47. Quá trình chuyển dời điện tích thực hiện bởi phức hợp của mangan để ôxi hóa nước và giải phóng oxi vào khí quyển. Trong PS I, các protein PsaA và PsaB tạo thành một heterodimer giống PSII.
Mỗi PsaA và PsaB bao gồm một trung tâm phản ứng tương đương với D1 hoặc D2 và một ăng ten tương đương với CP43 hoặc CP47. Điện tử được lấy từ plastocyanin (PC) ở bên trên lumen và chuyển đến sắt sunfua (FeS) ở phía trên stroma để khử NADP+ thành NADPH [28]. 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Hệ thống ăng ten (hình 1.4) được tổ chức để thu nhận năng lượng bằng chuyển electron từ trạng thái cơ bản sang trạng thái kích thích và chuyển tới trung tâm phản ứng là nơi phản ứng quang hoá diễn ra. Cấu tạo của ăng ten LH1 bao gồm một heterodimer của chuỗi peptit và hai phân tử chlorophyll a hoặc b.
LH2 bao gồm một heterodimer của chuỗi peptit và ba phân tử chlorophyll a hoặc b. Các sắc tố khác như caroten (hình 1.5) không hoạt động hoá học nhưng có chức năng như một ăng ten.3 : Hệ thống ăng ten của các vi khuẩn tía.[29] Hệ thống ăng ten tăng hiệu quả hấp thụ photon bằng cách tăng số lượng sắc tố để hấp thụ trong dải sóng từ 400nm-800nm. Nếu cường độ của ánh sáng mặt trời thấp, mỗi phân tử chlorophyll chỉ hấp thụ một vài photon trong một giây. Bằng cách kết hợp nhiều chất màu để hấp thụ ánh sáng hiệu suất quang có giá trị cao nhất.[1,4,7,12,15,26,27,29] 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.
4: Hấp thụ ánh sáng của hệ thống ăng ten trong thực vật [15] ß-Carotene OH Zeaxanthin HO OH O O Violaxanthin HO OH Lutein HO Hình 1.5: Caroten trong hệ quang hợp. Trung tâm phản ứng của hệ quang hợp bao gồm hàng trăm chlorophyll và một cặp chlorophyll có tổ chức đặc biệt, nhờ cấu tạo này mà sự chuyển dời điện tích xảy ra để thực hiện phản ứng khử NAD+ thành NADPH. Phản ứng ở trung tâm phản ứng loại I không có sự tạo thành oxy trong khi ở trung tâm phản ứng loại II oxy được tạo thành. Trung tâm phản ứng của vi khuẩn Rhodopseudomonas virdis bao gồm bốn tiểu đơn vị protein (hình 1.6) và các nhóm hoạt động bao gồm chlorophyll dime có tổ chức đặc biệt, hai phân tử pheophytin, phân tử quinon QA, phân tử quinon QB và 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com một ion sắt (Fe).
Chuỗi chuyển dời điện tích bắt đầu từ Chlorophyll monome phía bên trái qua chlorophyll dime sang pheophytin đến Chlorophyll monome phía bên phải rồi qua pheophytin phía bên phải tới Quinon A sang Fe và chuyển về pheophytin phía bên trái và trở về Chlorophyll monome ban đầu. Năng lượng kích thích của electron đã được sử dụng để tổng hợp ATP cao năng từ ADP. Đó chính là cơ sở và bản chất của quá trình quang hợp.6: Cấu trúc trung tâm phản ứng trong hệ quang hợp của vi khuẩn Rhodopseudomonas virdis .[6] 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chuỗi vận chuyển điện tử là những hệ thống của các protein và enzyme thông qua đó các electron di chuyển từ mức năng lượng cao hơn về một mức độ năng lượng thấp một cách điều hòa để nâng cao hiệu quả sử dụng năng lượng (hình 1. Trong chuỗi vận chuyển điện tử của màng thylakoid bao gồm các enzym khử sắt, plastoquinon oxidoreductase và enzym ATP syntase.
Dòng electron tách ra từ phân tử nước tới NADP dưới tác dụng của PS. Chuỗi vận chuyển proton thực hiện qua màng thylakoid và được sử dụng để tổng hợp ATP. Khi các electron di chuyển vào chuỗi vận chuyển, các protein luân phiên bị oxi hoá và giải phóng ra proton đi vào trong màng thylakoid. Nếu không có chuỗi vận chuyển điện tử từ trạng thái năng lượng cao đến trạng thái năng lượng thấp thì sự mất mát năng lượng xảy ra quá nhanh dẫn đến các tế bào sử dụng năng lượng ánh sáng với hiệu suất quá thấp.7: Chuỗi eletron vận chuyển của màng thylakoid Cacbohydrat được tổng hợp từ khí cacbonic và nước trong pha tối của bộ máy cố định cacbon bằng cách sử dụng xúc tác enzyme và năng lượng từ ATP hoặc NADPH theo chu trình Calvin-Benson C6 (hình 1.8) hoặc chu trình C4 (hình 1.
8 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.8: Cố định Cacbon C6 theo chu trình Calvin-Benson Cố định Cacbon dioxit theo chu trình Calvin-Benson C6 xảy ra trong stroma của lục lạp gồm 3 chuỗi phản ứng khác nhau. Pha đầu là phản ứng của dẫn xuất đường 5 ribulose-1,5-bisphotphat với CO2 và phân cắt dẫn xuất đường 6 thành hai phân tử 3-photphoglyxerat. Pha hai là quá trình tái tạo cơ chất ribulose-5-photphat còn pha ba là phản ứng của ribulose-5-photphat với ATP tạo thành ribulose-1,5- bisphotphat. Quá trình cố định CO2 xúc tác bởi enzym ribulose-1,5-bisphosphat cacboxylase oxygenase (RuBisCO), phản ứng của RuBisCO với O2 hoặc CO2 phụ thuộc vào nồng độ tương đối của chúng.
Trong tất cả các sinh vật, CO2 là chất nền ưu tiên, nếu nồng độ CO2 trở nên thấp hơn nhiều so với nồng độ oxy thì sự hô hấp xảy ra ở mức độ đáng kể. 9 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.9: Cố định cacbon theo chu trình C4 Ở một số loại thực vật, cơ chất cho quá trình cố định CO2 là phosphoenolpyruvate (PEP) theo chu trình C4. Tỷ lệ sử dụng ATP cho cố định CO2 trong thực vật theo chu trình C4 cao hơn so với chu trình C6.1 Cấu tạo và tính chất của chlorophyll 1.