Đặt vấn đề Bệnh đái tháo đường là bệnh rối loạn chuyển hóa cacbohydrat (đường) do hormon insulin của tuyến tụy tiết ra bị thiếu, hoặc do giảm/mất tác động hiệu quả lên mô đích (kháng insulin). Cơ thể phân hủy hầu hét thức ăn thành đường (glucose) và thải vào máu. Hậu quả đưa đến tình trạng glucose trong máu cao, vượt ngưỡng đường của thận, nước tiểu có đường, trong thời gian dài gây biến chứng mạch máu trầm trọng ở tất cả các cơ quan trong cơ thể. Các triệu chứng của bệnh tiểu đường loại 1 bao gồm nhu cầu đi tiểu thường xuyên, khát nước, đói liên tục, giảm cân, thay đổi thị lực và mệt mỏi.
Các triệu chứng này có thể xảy ra đột ngột. Các triệu chứng của bệnh tiểu đường loại 2 nhìn chung tương tự như các triệu chứng của bệnh tiểu đường loại 1, nhưng thường ít rõ ràng hơn. Do đó, bệnh có thể được chẩn đoán vài năm sau khi khởi phát, sau khi đã phát sinh các biến chứng. Vì lý do này, điều quan trọng là phải nhận thức được các yếu tố nguy cơ.
Biến chứng muộn gồm bệnh mạch máu, bệnh thần kinh ngoại vi, bệnh thận và dễ nhiễm khuẩn. Bệnh được chẩn đoán bằng phương pháp định lượng glucose huyết tương. Biến chứng có thể trì hoãn hoặc phòng tránh với kiểm soát đường máu đạt mục tiêu. Nguyên nhân gây bệnh rất đa dạng, tùy thuộc vào từng loại tiểu đường cụ thể.
Tuy nhiên, dù mắc loại tiểu đường nào thì bệnh vẫn dẫn đến lượng đường trong máu cao, từ đó gây nên hàng loạt vấn đề sức khỏe nghiêm trọng và bệnh lý tim mạch là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong ở bệnh nhân đái tháo đường.[l] Insulin, một loại hormone peptide được sản xuất bởi các tế bào beta của tuyến tụy để thúc đẩy quá trình chuyển hóa glucose. Insulin được tiết ra sau bữa ăn để thúc đẩy sự hấp thu glucose từ máu vào các cơ quan nội tạng và mô như gan, mỡ và cơ xương. Insulin được khoảng 2/3 số tế bào của cơ thể sử dụng để hấp thụ glucose từ máu để làm nhiên liệu, chuyển đổi thành các phân tử cần thiết khác hoặc để lưu trữ. Mức glucose thấp hơn dẫn đến giảm giải phóng insulin từ các tế bào beta và phân hủy 1 glycogen thành glucose.
[2] Neu lượng insulin có sẵn không đủ, hoặc tế bào phản ứng kém vói tác dụng của insulin (kháng insulin), thì glucose sẽ không được các tế bào của cơ thể hấp thụ đúng cách, và không được lưu trữ trong gan và cơ. Hậu quả là lượng đường trong máu tăng liên tục, các tế bào xảy ra tình trạng “đói” (thiếu đường) dẫn đến việc phân hủy protein, lipid và gây ra các rối loạn chuyển hóa khác, chẳng hạn như nhiễm toan chuyển hóa trong trường hợp thiếu insulin hoàn toàn. [3] Insulin Glargine, một analog của insulin, là một dạng insulin tác dụng kéo dài được sử dụng để điều trị tăng đường huyết do bệnh tiểu đường loại 1 và loại 2 gây ra. Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, đặc biệt là công nghệ protein tái tổ hợp, ngày nay quy trình sản xuất và một số sản phẩm về Insulin Glargine cũng đã được nghiên cứu tại một số nước trên thế giới.
Tuy nhiên, tại Việt Nam, những nghiên cứu về protein này vẫn còn nhiều hạn chế. Với mục đích sản xuất protein Insulin Glargine phục vụ nhu cầu nghiên cứu và điều trị bệnh, tiến hành chọn đề tài: “Nghiên cứu tạo dòng tế bào Escherichia Coli biểu hiện protein Insulin Glargine”. 2 Mục tiêu nghiên cứu Tạo dòng, biểu hiện và tinh sạch protein Insulin Glargine Tiến tới phát triển và sản xuất Insulin Glargine ở quy mô công nghiệp 3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: • Gen Insulin Glargine • Chủng E. COỈỈBL21 (DE3) • Chuột nhắt trắng dòng Swiss, Mus muscuỉus var.
Albino, 8-12 tuần tuổi, cân nặng 18-22g. Phạm vi nghiên cứu: Quy mô phòng thí nghiệm tại Công Ty CNSH - Dược Nanogen 2 4 Cách tiếp cận và phương pháp nghiên cứu • Cách tiếp cận: Trước khi tìm ra insulin, bệnh nhân mắc bệnh ĐTĐ không có cơ hội có một cuộc sống khoẻ mạnh, đặc biệt là bệnh nhân ĐTĐ loại I. Từ những thập niên 1920 cho đến những năm đầu của thập niên 1980, insulin được tạo ra bằng cách tách chiết từ tuyến tụy của động vật như heo và bò. Tuy nhiên, insulin người có sự khác biệt trong thành phần acid amin so với insulin bò và insulin heo.
Do đó gây ra những tác dụng không mong muốn (dị ứng) khi sử dụng insulin dạng này. Ngoài ra, quá trình sản xuất và tinh sạch insulin từ động vật còn gặp nhiều khó khăn. Sau đó, các phương pháp bán tổng hợp insulin người từ insulin heo và bò đã được phát triển bằng cách sử dụng phản ứng chuyển peptide (transpeptidation). Insulin người được sản xuất bằng kỹ thuật di truyền đầu tiên tại Công ty Genntech (Mỹ) và sản phẩm này được đưa ra thị trường vào năm 1982.
Ngày nay, số người sử dụng insulin sản xuất bằng kỹ thuật di truyền ngày một tăng. Các nước phát triển đã dùng insulin tái tổ hợp thay cho insulin có nguồn gốc động vật. Nhu cầu về insulin của thế giới vượt qua con số vài tấn/năm và vì thế nguồn cung cap insulin cho điều trị bệnh đái tháo đường đang thiếu hụt. • Phương pháp nghiên cứu: Nội dung 1: Tạo dòng vector tái tổ hợp pET-Insulin Glargine Nội dung 2: Tạo dòng chủng biểu hiện E.
coỉi BL21(DE3)ỉọEN&riQgsr\AG Nội dung 3: Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy, lên men và biểu hiện chủng E. coli BL21(DE3)í])EN&r\&gsrL-\G sinh tổng hợp protein IG ở quy mô phòng thí nghiệm Nội dung 4: Kiểm tra, đánh giá sơ bộ chất lượng protein IG sau tinh sạch 5 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài -Đối với lĩnh vực KH&CN có liên quan: 3 • Góp phần hoàn thiện quy trình sản xuất sp Insulin Glargine từ công nghệ protein tái tổ hợp để từ đó chủ động sản xuất thuốc đặc trị bệnh ĐTĐ đáp ứng nhu cầu trong nước với giá thành rẻ. • Nâng cao tiềm lực nội sinh về nghiên cứu, phát triển và ứng dụng các công nghệ nền của công nghệ sinh học như công nghệ gen, công nghệ lên men, công nghệ protein-enzyme, phát triển sản phẩm công nghệ sinh học có giá trị cao, có nhu cầu thị trường lớn và góp phần phát triển nền công nghiệp sinh học nước nhà, tiếp cận trình độ khu vực và thế giói. -Đối với kinh tế xã hội và môi trường: • Chủ động sản xuất giúp giảm giá thành nhờ đó thuốc sẽ phổ biến rộng rãi hon cho các đối tượng nhất là những người có thu nhập thấp dều có thể tiếp cận.
Từ đó, giảm gánh nặng xã hội vì các biến chứng của bệnh ĐTĐ • Góp phần giảm chi phí điều trị cho bệnh nhân vì sản phẩm sản xuất có giá thành thấp hon so với thuốc ngoại nhập. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về bệnh đái tháo đường 1.1 Tình hình bệnh đái tháo đường trên thế giới và Việt Nam Bệnh tiểu đường là căn bệnh mãn tính, ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp đến quá trình chuyển hóa và được xác định bởi mức đường trong máu tăng cao. Theo thời gian, bệnh này gây hại nghiêm trọng cho tim, mạch máu, mắt, thận và dây thần kinh. Bệnh tiểu đường loại 2 là nhóm bệnh phổ biến nhất, thường xuất hiện ở người ở độ tuổi trung niên.
Bệnh này xảy ra khi co thể chống lại insulin hoặc có thể sản xuất không đủ insulin. Trong suốt ba thập kỷ qua, tỷ lệ mắc bệnh tiểu đường loại 2 gia tăng một cách đáng kể ở các quốc gia có mức thu nhập không đồng đều. Bệnh tiểu đường loại 1, trước kia được gọi là bệnh tiểu đường vị thành niên hoặc đái tháo đường phụ thuộc vào insulin, là tình trạng mãn tính trong đó tuyến tụy không sản xuất hoặc chỉ sản xuất ít insulin. Đối với những trường hợp bệnh nhân phải sống chung với căn bệnh này, việc có sự tiếp cận với phương pháp điều trị giá cả phải chăng, cùng với sản phẩm thuốc từ insulin, có vai trò quan trọng trong việc duy trì sự sống của họ [4].
Trong giai đoạn ban đầu, bệnh thường gây ra tình trạng tiểu tiện nhiều và dần trở nên mất kiểm soát, đặc biệt là ban đêm và do đó dễ gây khát nước. Bệnh ĐTĐ được coi là một trong những nguyên nhân chủ yếu gây ra nhiều bệnh nguy hiểm, ví dụ những căn bệnh về tim, tai biến mạch máu não, mất thị lực, suy thận, rối loạn cương dương và hỏng hóc hệ tiêu hóa. Các biến chứng từ căn bệnh ĐTĐ rất phổ biến và nghiêm trọng: 50% số bệnh nhân gặp các biến chứng khác, 4.6% bị suy tim cấp tính, 2.4% xảy ra tình trạng tai biến mạch máu não cấp tính, 1.1% phải cắt cụt hay gián đoạn các chi như tay hay chân, 1.2% phải thực hiện lọc máu hoặc ghép thận và 0.8% mắc chứng mù mắt [1]. Theo thống kê, mức độ phủ sóng của bệnh tiểu đường trên toàn cầu đã đạt khoảng 422 triệu người vào năm 2018.
Đáng chú ý, phần lớn số người mắc bệnh này là những người sinh sống tại các quốc gia thuộc nhóm thu nhập thấp và trung bình. Mỗi năm, 1 con số tử vong do bệnh tiểu đường trực tiếp lên tới 1,5 triệu ca. Thêm vào đó, cả số ca mắc bệnh và tỷ lệ mắc bệnh tiểu đường đã không ngừng gia tăng trong suốt vài thập kỷ qua ở những quốc gia này nói riêng và cả thế giới nói chung [5]. Năm 2014, số bệnh nhân thuộc nhóm từ 18 tuổi trở lên mắc bệnh tiểu đường chiếm 8.
Năm 2019, bệnh tiểu đường là nguyên nhân trực tiếp dẫn đến 1,5 triệu ca tử vong và 48% tổng số ca tử vong do căn bệnh này xảy ra sớm hơn 70 tuổi. Từ năm 2000 đến năm 2016, tỷ lệ bệnh nhân tử vong sớm (nhỏ hơn 70 tuổi) do đái tháo đường đã tăng 5%. Ở các nước có mức thu nhập cao, số người tử vong sớm do đái tháo đường giảm từ năm 2000 đến năm 2010 nhưng sau đó lại tăng lên trong các năm 2010-2016. Ở các nước có thu nhập trung bình thấp, tỷ lệ tử vong sớm do bệnh tiểu đường tăng lên trong cả hai giai đoạn [5].
Bệnh ĐTĐ được chia thành các nhóm: ĐTĐ phụ thuộc vào insulin (loại 1): có 5-10% người bệnh thuộc nhóm ĐTĐ loại 1, phần lớn bệnh nhân nhóm bệnh này là trẻ em và người trẻ dưới 20 tuổi. Được đặc trưng bởi sự phá hủy tự miễn dịch của các tế bào beta sản xuất insulin trong các “đảo” nhỏ của tuyến tụy. Ket quả là bị thiếu insulin tuyệt đối.