Đặt vấn đề Nền nông nghiệp Việt Nam đang có xu hƣớng phát triển theo canh tác hữu cơ để góp phần đảm bảo sức khỏe cho ngƣời tiêu dùng và đảm bảo phát triển nông nghiệp bền vững, đồng thời giảm sự tích tụ nitrate, tồn dƣ các chất hóa học và kim loại nặng ở một số vùng, gây ô nhiễm nguồn nƣớc, môi trƣờng đất và sức khỏe con ngƣời (Anitha và cs. Cùng với sự phát triển nhanh chóng của công nghệ sinh học và nhu cầu đảm bảo các điều kiện sinh thái của đời sống và công nghiệp, ngƣời ta ngày càng quan tâm hơn đến vi khuẩn sinh bào tử. Phân bón và chế phẩm vi sinh có chứa các nhóm vi sinh vật cố định đạm, phân giải chất hữu cơ, phân giải phosphate khó tan, kích thích sinh trƣởng thực vật, ngăn ngừa và phòng trừ bệnh hại tác động từ môi trƣờng hoặc các vi sinh vật gây bất lợi cho cây trồng là một thành phần quan trọng trong nền nông nghiệp bền vững này (Danielsson và cs. Nhiều nghiên cứu trƣớc đây đã xác định đƣợc các nhóm vi sinh vật nhƣ nấm Aspergillus, Penicillium, vi khuẩn Bacillus, Pseudomonas… có khả năng tiết các enzyme để phân giải lân và kali thành dạng dễ tan, hữu dụng cho cây trồng.
Một số vi khuẩn còn có khả năng sinh tổng hợp các chất kích thích sinh trƣởng giúp cây phát triển nhanh. Trong nông nghiệp, các vi khuẩn thuộc chi Bacillus tham gia vào quá trình hòa tan các chất từ khó tan sang dạng dễ tan (Gupta và cs., 2002), giúp cải tạo đất, tăng năng suất cây trồng hoặc đối kháng với một số nấm gây bệnh và vi khuẩn ở vùng rễ cây trồng (Fan và cs., 2012), làm phong phú thêm hệ vi sinh vật đất và trả lại độ phì nhiêu cho đất. Bacillus laterosporus, còn đƣợc biết đến dƣới tên Brevibacillus laterosporus, là nhóm vi khuẩn thuộc chi Bacillus đƣợc nghiên cứu và ứng dụng hết sức rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Bacillus laterosporus tiết một lƣợng lớn chitinase nên có khả năng ức chế mạnh mẽ các loại nấm bệnh và các vi khuẩn có hại nhƣ 1 Escherichia coli, Baculovirus.
Mặt khác, Bacillus laterosporus còn thúc đẩy sự phát triển của thực vật thông qua việc kích thích sự phát triển của bộ rễ, tăng cƣờng khả năng hấp thụ chất dinh dƣỡng và khả năng quang hợp (Song và cs. Chính nhờ đặc tính này mà vi khuẩn Bacillus laterosporus đã và đang đƣợc ứng dụng rộng rãi trong việc sản xuất phân bón và chế phẩm vi sinh. Các chế phẩm sinh học nhƣ Kaito Nano Hữu Cơ, Bio Sun, phân bón hữu cơ nấm đối kháng Trichoderma Bacillus HLC,. có chứa thành phần là Bacillus laterosporus.
Hiện nay, các tiêu chuẩn đã ban hành ở nƣớc ta không thể áp dụng để đánh giá định tính và định lƣợng vi khuẩn Bacillus laterosporus trong phân bón vi sinh và chế phẩm sinh học. Vì vậy, việc xây dựng tiêu chuẩn quốc gia cho các chỉ tiêu vi sinh vật hữu ích, trong đó có phân bón vi sinh có chứa vi khuẩn Bacillus laterosporus là cần thiết để phục vụ cho công tác kiểm tra, quản lý chất lƣợng sản phẩm phân bón vi sinh nhằm nâng cao hiệu quả sản xuất nông nghiệp và bảo vệ quyền lợi của ngƣời tiêu dùng. Việc nghiên cứu xây dựng phƣơng pháp định tính và định lƣợng vi khuẩn Bacillus laterosporus trong mẫu chế phẩm vi sinh ở điều kiện Việt Nam là cần thiết, có ý nghĩa khoa học và ứng dụng. Xuất phát từ thực tiễn đó, từ xu hƣớng nghiên cứu hiện nay trên thế giới và trong nƣớc, đề tài nghiên cứu nhằm phát triển phƣơng pháp xác định vi khuẩn Bacillus laterosporus trong chế phẩm sinh học.
Mục đích và yêu cầu 1. Mục đích Xây dựng phƣơng pháp xác định vi khuẩn Bacillus laterosporus trong chế phẩm sinh học. Yêu cầu - Xác định phƣơng pháp chuẩn bị mẫu thích hợp cho quá trình phân lập vi khuẩn Bacillus laterosporus trong chế phẩm sinh học. 2 - Đánh giá đƣợc các đặc điểm hình thái và sinh hoá của các mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus giả định trong chế phẩm sinh học.
- Định danh đƣợc vi khuẩn Bacillus laterosporus bằng phƣơng pháp giải trình tự 16S rRNA và phƣơng pháp PCR sử dụng mồi đặc hiệu. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Giới thiệu chung về vi khuẩn Bacillus laterosporus Bacillus laterosporus là một vi khuẩn Gram dƣơng, hình que, hình thành nội bào tử, thuộc họ Paenibacillaceae. Bacillus laterosporus là một loài phổ biến đã đƣợc phân lập từ nhiều loại vật liệu nhƣ đất, đá quý, dung nham, nƣớc ngọt, nƣớc biển, côn trùng, bề mặt lá, phân hữu cơ, sữa, pho mát, mật ong, thực phẩm giàu tinh bột, gelatin - nƣớc thải nhà máy, da thú và len, chim cút (Ruiu, 2013).
Bacillus laterosporus đã đƣợc báo cáo là có tiềm năng đƣợc sử dụng nhƣ một tác nhân kiểm soát sinh học với phổ hoạt động sinh học rất rộng - bao gồm ốc sên, tuyến trùng và côn trùng. Chúng có khả năng tạo ra một thể ký sinh phiến mỏng hình chiếc xuồng gắn chặt vào một bên của bào tử (Hong và cs. Ở ngƣời, Bacillus laterosporus tồn tại trong điều kiện axit dạ dày. Sau khi vào ruột, các bào tử bắt đầu nảy mầm và nhân lên sau mỗi 32 phút.
Tuy nhiên, đây là vi khuẩn sống trong đất và cũng giống nhƣ các vi khuẩn sống trong đất khác, chúng sẽ không phát triển thành các khuẩn lạc lớn, sống lâu dài trong ruột. Các khuẩn lạc chỉ tạm thời phát triển và sẽ bắt đầu chết trong vòng 3 ngày hoặc lâu hơn. Các nghiên cứu đã cho thấy rằng Bacillus laterosporus hoàn toàn an toàn với ngƣời (Nivetha và Halka, 2017). Ảnh nhuộm Gram của tế bào Bacillus laterosporus dƣới kính hiển vi (https://microbiology-micro.com/2011/07/brevibacillus-laterosporus.html) Tiềm năng kiểm soát sinh học đối với côn trùng gây bệnh của Bacillus laterosporus đã đƣợc báo cáo chống lại côn trùng theo các bộ khác nhau bao gồm Coleoptera, Lepidoptera, Diptera và chống lại tuyến trùng và động vật thân mềm (Ruiu, 2013).
Ngoài khả năng gây bệnh đối với động vật không xƣơng sống, các chủng Bacillus laterosporus khác nhau còn thể hiện hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng, đặc biệt là đối với vi khuẩn và nấm. Nhiều loại phân tử, bao gồm protein và kháng sinh, có liên quan đến khả năng gây bệnh và phƣơng thức hoạt động đã đƣợc nghiên cứu. Toàn bộ trình tự bộ gen gần đây của Bacillus laterosporus cho thấy tiềm năng sản xuất polyketide, nonribosomal peptide và độc tố của chủng vi khuẩn này (Djukic và cs., 2011; Sharma và cs. Bacillus laterosporus cũng đƣợc liệt kê trong số các chế phẩm sinh học cho động vật có vú và chim (Hong và cs., 2005; Porubcan, 2003), các loại kháng sinh cụ thể có nguồn gốc từ Bacillus laterosporus đã và đang đƣợc sử dụng trong y học (Umezawa và Takeuchi, 1987).
Hình thái khuẩn lạc Bacillus laterosporus (https://microbiology- micro.com/2011/07/brevibacillus-laterosporus. Lịch sử phát hiện Nghiên cứu về tầm quan trọng của mối quan hệ giữa Bacillus laterosporus với côn trùng đã đƣợc ghi nhận sau khi chủng vi khuẩn này đƣợc phân lập lần đầu tiên vào đầu thế kỷ 20 bởi White (1912). Khi đó, ông đang tiến hành nghiên cứu về vi khuẩn ở ong mật châu Âu. Trong số những vi khuẩn gây bệnh, ông đã phân lập đƣợc một loài mới mà ông đặt tên là Bacillus orpheus White (White, 1912).
Một mô tả chi tiết về vi khuẩn này đã đƣợc đƣa ra vào năm 1917 bởi McCray, ngƣời đã phân lập các vi khuẩn sinh bào tử khác nhau của một nhà nuôi ong. Tuy nhiên, một năm trƣớc đó, Bacillus laterosporus đã đƣợc đặt tên và mô tả bởi Laubach, ngƣời đã phân lập đƣợc một chủng khác từ nƣớc ngọt. Sau đó, do sự tƣơng đồng giữa hai chủng phân lập, tên thứ hai đƣợc ƣu tiên hơn và đƣợc chọn để chỉ loài vi khuẩn này. Năm 1946, Steinhaus đã liệt kê chúng trong số các loài vi khuẩn hình thành bào tử.
Theo kết quả của các nghiên cứu phân loại gần đây dựa trên phân tích trình 6 tự 16S rRNA, loài này đã đƣợc chuyển vào chi Brevibacillus mới trong cụm Brevibacillus brevis (Ruiu, 2013). Túi bào tử của vi khuẩn Bacillus laterosporus. SW: thành túi bào tử; Sp: bào tử; SC: vách bào tử; CSPB: thể ký sinh hình xuồng (Ruiu và cs. Các giả thuyết khác nhau đã đƣợc đƣa ra về vai trò và chức năng có thể có của các thể ký sinh có thể đóng vai trò là đơn vị lƣu trữ nếu bào tử nảy mầm trong môi trƣờng thiếu hụt, có thể hỗ trợ sự nảy mầm của bào tử hoặc có thể là vách phụ hoặc chỉ là biến dạng của vách bào tử.
Tuy nhiên, chức năng cụ thể vẫn chƣa đƣợc 7 xác nhận cho đến nay. Fitz James và Young (1958) đã phân tích thành phần hóa học của cấu trúc vách bào tử, sau khi phát triển một phƣơng pháp tách nó ra khỏi nguyên sinh bào tử. Theo nghiên cứu của họ, các thành phần chính của CSPB là photpho và cs nitrogen. Ngoài ra còn có protein đƣợc thu hồi thông qua chiết xuất kiềm với sự có mặt của chất khử (alkali -thioglycollate) phá vỡ liên kết S-S.
Kết quả phân tích kết hợp giữa hình thái và hóa học cho thấy thành phần photpho là một phần của cấu trúc thể ký sinh hình xuồng, còn lại các protein chiết xuất là chất nền của CSPB (Fitz James và Young, 1958). Các thể ký sinh khác (PB), khác biệt với CSPB, đƣợc tìm thấy bên trong túi bào tử bởi Montaldi và Roth (1990). Đây là các thể ký sinh, hình cầu với dạng góc cạnh hoặc vân với các dải song song xen kẽ. Chức năng của các cấu trúc này chƣa đƣợc làm rõ nhƣng có ý kiến cho rằng chúng có liên quan đến hoạt động diệt côn trùng chống lại Diptera của vi khuẩn Bacillus laterosporus (Ruiu và cs.
Đặc tính đối kháng Một số chủng vi khuẩn Bacillus laterosporus thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với các loại vi khuẩn và nấm khác nhau. Đặc tính sinh học này cũng đƣợc thấy ở các loài khác của chi Brevibacillus và có liên quan đến việc sản xuất nhiều loại enzyme và kháng sinh (Chandel và cs. Một chủng Bacillus laterosporus đƣợc phân lập từ bùn ở Ấn Độ, đƣợc gọi là BPM3, đƣợc báo cáo rằng có khả năng ức chế sự phát triển của nấm thực vật Fusarium oxysporum f. & Ravenel, Magnaporthe grisea (Hebert) Barr và Rhizoctonia oryzae Ryker & Gooch, và của cầu khuẩn Gram dƣơng Staphylococcus aureus Rosenbach (Saikia và cs.
Bằng chứng về sự ức chế nấm cũng đƣợc ghi nhận ở chủng vi khuẩn Bacillus laterosporus ZQ2 đƣợc phân lập từ rễ cây táo ở Trung Quốc. Chủng vi khuẩn ZQ2 có khả năng ức chế nấm gây bệnh trên cây táo bao gồm Rhizoctonia solani Kuhn, 8 Fusarium oxysporum Schlecht, F.), Aspergillus fumigatus Fres, Alternaria alternata (Fr.) Keissler, Valsa sordida Nits, Colletotrichum gloeosporioides (Penz., Botrytis cinerea Pers. và Physalospora piricola Nose.