Nghiên cứu phương pháp xác định vi khuẩn Bacillus laterosporus trong chế phẩm sinh học

Nghiên cứu phương pháp xác định vi khuẩn Bacillus laterosporus trong chế phẩm sinh học, góp phần nâng cao hiệu quả ứng dụng trong nông nghiệp.

• Tác giả: Đỗ Thủy Nguyên
• Người hướng dẫn: TS. Ninh Thị Thảo
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học thực vật
• Đề tài: Nghiên Cứu Xây Dựng Phương Pháp Xác Định Vi Khuẩn Bacillus Laterosporus Trong Chế Phẩm Sinh Học
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 2. MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU
• 3. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 3.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn Bacillus laterosporus
• 3.2. Lịch sử phát hiện
• 3.3. Đặc tính đối kháng
• 3.4. Các đặc tính và công dụng khác
• 3.5. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Bacillus laterosporus
• 3.6. Các phƣơng pháp nghiên cứu xác định Bacillus laterosporus
• 3.7. Giới thiệu về chế phẩm sinh học “Kaito Nano Hữu Cơ”
• 4. ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 4.1. Đối tƣợng, vật liệu nghiên cứu
• 4.2. Thời gian, địa điểm nghiên cứu
• 4.3. Đối tƣợng nghiên cứu
• 4.4. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu
• 4.5. Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu
• 4.5.1. Nội dung 1: Phân lập vi khuẩn Bacillus laterosporus từ chế phẩm sinh học
• 4.5.2. Phƣơng pháp làm thuần, giữ giống
• 4.5.3. Nội dung 2: Đánh giá các đặc điểm hình thái và đặc điểm hóa sinh của các mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus phân lập giả định
• 4.5.4. Nội dung 3: Định danh vi khuẩn Bacillus laterosporus tuyển chọn bằng phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide 16S rRNA và PCR với mồi đặc hiệu
• 4.5.5. Phần mềm xử lý số liệu
• 5. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 5.1. Kết quả phân lập vi khuẩn
• 5.2. Ảnh hƣởng của tỷ lệ pha loãng mẫu ban đầu đến kết quả phân lập vi khuẩn
• 5.3. Ảnh hƣởng của nồng độ pha loãng mẫu đến kết quả phân lập vi khuẩn
• 5.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ xử lý mẫu đến kết quả phân lập vi khuẩn
• 5.5. Ảnh hƣởng của thời gian xử lý mẫu đến kết quả phân lập vi khuẩn
• 5.6. Khảo sát đặc điểm sinh học và phản ứng hóa sinh của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
• 5.7. Đánh giá đặc điểm hình thái các mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus giả định
• 5.8. Phân tích đặc tính hóa sinh các mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus giả định
• 5.9. Định danh mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus phân lập bằng phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide 16S rRNA và phƣơng pháp PCR sử dụng mồi đặc hiệu
• 5.10. Kết quả tách chiết DNA
• 5.11. Định danh mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus phân lập bằng phƣơng pháp PCR sử dụng mồi đặc hiệu
• 5.12. Tính toán tổng số vi khuẩn Bacillus laterosporus trong chế phẩm sinh học
• 6. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về phương pháp xác định vi khuẩn Bacillus laterosporus

Vi khuẩn Bacillus laterosporus là một trong những vi khuẩn quan trọng trong chế phẩm sinh học. Chúng có khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh và thúc đẩy sự phát triển của thực vật. Việc xác định chính xác loài vi khuẩn này trong chế phẩm sinh học là rất cần thiết để đảm bảo chất lượng sản phẩm. Phương pháp xác định vi khuẩn Bacillus laterosporus bao gồm nhiều bước từ phân lập đến định danh.

1.1. Giới thiệu về Bacillus laterosporus và vai trò của nó

Bacillus laterosporus là một vi khuẩn Gram dương, hình que, có khả năng sinh bào tử. Chúng được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp nhờ khả năng ức chế nấm và vi khuẩn gây hại. Vi khuẩn này cũng giúp cải thiện sự phát triển của cây trồng thông qua việc kích thích bộ rễ.

1.2. Tầm quan trọng của việc xác định vi khuẩn trong chế phẩm sinh học

Việc xác định chính xác Bacillus laterosporus trong chế phẩm sinh học giúp đảm bảo hiệu quả sử dụng và an toàn cho cây trồng. Điều này cũng góp phần nâng cao chất lượng sản phẩm nông nghiệp và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.

II. Thách thức trong việc xác định Bacillus laterosporus

Mặc dù Bacillus laterosporus có nhiều ứng dụng trong nông nghiệp, việc xác định chính xác loài vi khuẩn này gặp nhiều thách thức. Các phương pháp hiện tại có thể không đủ nhạy để phát hiện vi khuẩn trong các chế phẩm phức tạp. Hơn nữa, sự hiện diện của các vi khuẩn khác có thể gây nhầm lẫn trong quá trình phân tích.

2.1. Các vấn đề trong phương pháp phân lập vi khuẩn

Phương pháp phân lập vi khuẩn thường gặp khó khăn trong việc tách biệt Bacillus laterosporus khỏi các vi khuẩn khác. Điều này có thể dẫn đến kết quả không chính xác trong việc xác định số lượng và chất lượng vi khuẩn trong chế phẩm.

2.2. Khó khăn trong việc định danh vi khuẩn

Việc định danh Bacillus laterosporus thông qua các phương pháp sinh học phân tử như PCR có thể gặp khó khăn do sự tương đồng gen với các loài khác. Điều này yêu cầu sử dụng các mồi đặc hiệu để đảm bảo độ chính xác cao.

III. Phương pháp xác định Bacillus laterosporus hiệu quả

Để xác định Bacillus laterosporus trong chế phẩm sinh học, cần áp dụng các phương pháp hiện đại và chính xác. Các phương pháp này bao gồm phân lập, đánh giá hình thái, và định danh gen. Sự kết hợp giữa các phương pháp này sẽ giúp nâng cao độ chính xác trong việc xác định vi khuẩn.

3.1. Phân lập vi khuẩn từ chế phẩm sinh học

Quá trình phân lập vi khuẩn Bacillus laterosporus bắt đầu bằng việc nuôi cấy mẫu trong môi trường thích hợp. Việc điều chỉnh các yếu tố như nhiệt độ, pH và thời gian nuôi cấy là rất quan trọng để đạt được kết quả tốt nhất.

3.2. Đánh giá đặc điểm hình thái và hóa sinh

Sau khi phân lập, các mẫu vi khuẩn cần được đánh giá về đặc điểm hình thái và hóa sinh. Điều này bao gồm việc quan sát hình dạng, kích thước và khả năng sinh enzyme của vi khuẩn để xác định chính xác loài.

3.3. Định danh vi khuẩn bằng phương pháp PCR

Phương pháp PCR sử dụng mồi đặc hiệu cho gen 16S rRNA là một trong những cách hiệu quả nhất để định danh Bacillus laterosporus. Kết quả PCR sẽ cho thấy sự hiện diện của vi khuẩn trong mẫu chế phẩm.

IV. Ứng dụng thực tiễn của Bacillus laterosporus trong nông nghiệp

Bacillus laterosporus có nhiều ứng dụng trong nông nghiệp, đặc biệt là trong sản xuất phân bón sinh học. Vi khuẩn này không chỉ giúp cải thiện sức khỏe cây trồng mà còn tăng năng suất và chất lượng nông sản. Các chế phẩm sinh học chứa Bacillus laterosporus đang được sử dụng rộng rãi trên thị trường.

4.1. Tác động tích cực đến sự phát triển của cây trồng

Nghiên cứu cho thấy Bacillus laterosporus có khả năng thúc đẩy sự phát triển của bộ rễ, từ đó tăng cường khả năng hấp thụ dinh dưỡng của cây. Điều này giúp cây trồng phát triển khỏe mạnh và chống chịu tốt hơn với điều kiện môi trường khắc nghiệt.

4.2. Khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh

Bacillus laterosporus có khả năng ức chế nhiều loại nấm và vi khuẩn gây hại cho cây trồng. Việc sử dụng chế phẩm chứa vi khuẩn này giúp giảm thiểu sự lây lan của bệnh tật trong nông nghiệp.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của Bacillus laterosporus

Vi khuẩn Bacillus laterosporus có tiềm năng lớn trong nông nghiệp bền vững. Việc phát triển các phương pháp xác định chính xác vi khuẩn này sẽ góp phần nâng cao chất lượng chế phẩm sinh học. Tương lai, Bacillus laterosporus có thể trở thành một trong những vi khuẩn chủ chốt trong sản xuất nông nghiệp hữu cơ.

5.1. Tương lai của nghiên cứu Bacillus laterosporus

Nghiên cứu về Bacillus laterosporus sẽ tiếp tục mở rộng, đặc biệt là trong việc phát triển các chế phẩm sinh học mới. Các nghiên cứu này sẽ giúp tối ưu hóa quy trình sản xuất và ứng dụng vi khuẩn trong nông nghiệp.

5.2. Định hướng phát triển sản phẩm chứa Bacillus laterosporus

Các sản phẩm chứa Bacillus laterosporus sẽ được phát triển với công nghệ tiên tiến hơn, nhằm nâng cao hiệu quả và an toàn cho người tiêu dùng. Điều này sẽ thúc đẩy sự phát triển bền vững trong nông nghiệp.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong xu thế phát triển nông nghiệp hiện đại, canh tác hữu cơ tại Việt Nam đang được đẩy mạnh nhằm hạn chế sự tích tụ nitrate, giảm thiểu tồn dư phân bón hóa học và thuốc bảo vệ thực vật, đồng thời bảo vệ nguồn tài nguyên đất, nước và sức khỏe cộng đồng. Cùng với xu hướng này, các chế phẩm sinh học và phân bón hữu cơ vi sinh chứa các vi sinh vật hữu ích—đặc biệt là nhóm vi khuẩn sinh nội bào tử—đóng vai trò thiết yếu trong việc phân giải lân khó tan, cố định đạm, kích thích bộ rễ phát triển và đối kháng các mầm bệnh hại rễ.

Trong số các vi sinh vật hữu ích, vi khuẩn Bacillus laterosporus (hiện được phân loại là Brevibacillus laterosporus) được ứng dụng rộng rãi nhờ khả năng tiết enzyme chitinase mạnh mẽ, ức chế các tác nhân nấm bệnh (Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani,...) và vi khuẩn gây hại (Escherichia coli), kiểm soát tuyến trùng và côn trùng, đồng thời hỗ trợ thực vật hấp thu dinh dưỡng và tăng cường khả năng quang hợp. Chủng vi khuẩn này đã được đăng ký trong thành phần của nhiều sản phẩm sinh học trên thị trường như Kaito Nano Hữu Cơ, Bio Sun, hoặc phân bón hữu cơ vi sinh Trichoderma Bacillus HLC.

Tuy nhiên, tại Việt Nam, hệ thống tiêu chuẩn kỹ thuật hiện hành chưa ban hành quy chuẩn riêng biệt để kiểm tra, đánh giá định tính và định lượng vi khuẩn Bacillus laterosporus trong phân bón vi sinh và chế phẩm sinh học. Thực tế này gây khó khăn cho công tác quản lý chất lượng nông nghiệp và bảo vệ quyền lợi người sử dụng.

Từ đòi hỏi thực tiễn nêu trên, đề tài khóa luận hướng tới các mục tiêu và nhiệm vụ cụ thể:

1. Xác định phương pháp chuẩn bị mẫu thích hợp cho quá trình phân lập vi khuẩn Bacillus laterosporus trong chế phẩm sinh học.
2. Đánh giá được các đặc điểm hình thái và sinh hóa của các mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus giả định trong chế phẩm sinh học.
3. Định danh được vi khuẩn Bacillus laterosporus bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA kết hợp kỹ thuật PCR sử dụng mồi đặc hiệu.

• Đối tượng nghiên cứu: Mẫu chế phẩm sinh học thương mại “Kaito Nano Hữu Cơ” (sản xuất từ nguồn nguyên liệu phân bò sử dụng chế phẩm vi sinh Nano-Gro™ của công ty Custom Biologicals – Inc USA).
• Phạm vi không gian: Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ sinh học Thực vật, Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
• Phạm vi thời gian: Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 07/2022 đến tháng 12/2022.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận thuộc loại hình nghiên cứu thực nghiệm phòng thí nghiệm (vi sinh vật học ứng dụng và sinh học phân tử).

Khung lý thuyết và khái niệm chuyên ngành

• Phân loại học và đặc tính vi sinh: Bacillus laterosporus là trực khuẩn Gram dương, tạo nội bào tử, thuộc họ Paenibacillaceae (được xếp vào chi Brevibacillus thuộc cụm Brevibacillus brevis). Điểm đặc trưng cấu trúc dưới kính hiển vi điện tử là sự hình thành thể ký sinh dạng phiến mỏng hình chiếc xuồng (Canoe-Shaped Parasporal Body - CSPB) gắn chặt vào vách bào tử (Spore Coat - SC) tạo thành phức hợp SC-CSPB.
• Cơ sở sinh học phân tử: Phân tích trình tự 16S rRNA cung cấp định hướng cấp chi, nhưng do độ tương đồng rất cao giữa các loài thuộc chi Bacillus, việc định danh chính xác loài đòi hỏi chỉ thị đặc hiệu. Tác giả sử dụng gen cpbB—trình tự nucleotide mã hóa cho protein liên kết với phức hợp SC-CSPB có trọng lượng phân tử khoảng 14 kDa (dựa trên sáng chế quốc tế WO 2016/135766 A1)—như một dấu thị phân tử duy nhất để nhận diện loài B. laterosporus.
• Tiêu chuẩn kỹ thuật đối chiếu: Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 6404:2016 (tương đương tiêu chuẩn quốc tế ISO 7218) về yêu cầu kỹ thuật đếm khuẩn lạc vi sinh vật (khoảng tin cậy từ 10 đến 300 khuẩn lạc/đĩa petri).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

• Xử lý sốc nhiệt và phân lập mẫu: Hòa tan chế phẩm trong dung dịch NaCl 0,85%, khảo sát ảnh hưởng của các tỷ lệ pha loãng (1:9 đến 1:49 w/v), nhiệt độ xử lý (nhiệt độ phòng, 60°C, 70°C, 80°C, 90°C, 100°C) và thời gian xử lý (3, 5, 7, 10 phút) để tiêu diệt tế bào sinh dưỡng của các vi sinh vật không sinh bào tử. Mẫu sau sốc nhiệt được pha loãng bậc 10 (từ 10⁻⁴ đến 10⁻⁸) và cấy trang trên môi trường Luria Bertani (LB) agar, ủ ở 37°C trong 20 giờ.
• Làm thuần và bảo quản giống: Cấy ria phân lập khuẩn lạc đơn trên thạch đĩa LB; giữ giống ngắn hạn trên thạch nghiêng LB ở 4°C và giữ giống dài hạn trong glycerol 30% ở -80°C.
• Xác định đặc tính hình thái và hóa sinh:
  • Nhuộm Gram tế bào vi khuẩn (thuốc nhuộm tím gentian, dung dịch lugol, cồn khử màu 96° và fuchsine), soi kính hiển vi vật kính dầu độ phóng đại 100×.
  • Phản ứng Methyl Red (MR): kiểm tra khả năng lên men glucose sinh acid hữu cơ bền (thuốc thử đỏ methyl).
  • Phản ứng Voges-Proskauer (VP): phát hiện acetoin trong điều kiện yếm khí bằng hỗn dịch α-naphthol 5% và dung dịch kiềm.
  • Khả năng đồng hóa citrate: nuôi cấy trên môi trường thạch nghiêng Simmon’s Citrate Agar (SCA) chứa chỉ thị bromothymol blue.
  • Hoạt tính enzyme ngoại bào: thử nghiệm phân giải protein trên môi trường thạch gelatin 1% (nhuộm amido đen 10B) và phân giải tinh bột trên môi trường thạch tinh bột 1% (nhuộm dung dịch lugol), tính hiệu số đường kính vòng phân giải $D - d$ (cm).
• Phương pháp phân tử:
  • Tách chiết DNA tổng số bằng đệm CTAB cải tiến (bổ sung Lysozyme 20 mg/ml, β-mercaptoethanol, SDS 20%, làm sạch bằng Phenol:Chloroform:Isoamylalcohol 25:24:1 và kết tủa bằng ethanol lạnh).
  • Phản ứng PCR khuếch đại vùng gen 16S rRNA bằng cặp mồi phổ biến 27F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) và 1492R (5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’).
  • Phản ứng PCR khuếch đại gen đặc hiệu cpbB (kích thước sản phẩm 600 bp, nhiệt độ gắn mồi 48°C) với cặp mồi CPBB_F (5'-CTA TTT ACA CGG GCG TACG-3') và CPBB_R (5'-CAT TCT TTT GAA AGTAGTAAG AAG-3').
  • Chạy điện di trên gel agarose 1% trong đệm 1× TAE ở điện thế 80V trong 45 phút, chụp ảnh gel huỳnh quang trên hệ thống BioRad; sử dụng chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis làm đối chứng âm.
• Xử lý số liệu: Thống kê mô tả bằng phần mềm Minitab; đọc sắc ký đồ giải trình tự qua Chromas; phân tích mức độ đồng đồng trình tự bằng công cụ BLAST trên cơ sở dữ liệu NCBI/GenBank.

---

Nội dung chính theo từng chương

Phần 2: Tổng quan tài liệu

Tác giả hệ thống hóa lịch sử phát hiện chủng vi khuẩn từ các nghiên cứu ban đầu của White (1912) trên ong mật và Laubach (1916) trên mẫu nước ngọt, cho tới việc tái phân loại vào chi Brevibacillus. Chương tổng quan trình bày chi tiết về cấu trúc thể ký sinh hình xuồng CSPB gắn bên bào tử và các thể vùi PB có độc tính sinh học đối với ấu trùng sâu bọ (Coleoptera, Lepidoptera, Diptera) và động vật thân mềm (Biomphalaria glabrata).

Văn bản ghi nhận các cơ chế đối kháng chính: sản sinh peptide kháng sinh (BL-A60 khối lượng 1,6 kDa bền nhiệt đến 100°C và dải pH 3–11; laterosporulin 5,6 kDa; laterosporamine), tổng hợp enzyme chitinase (như ChiA1 69,4 kDa ở chủng Lak1210) giúp phá hủy thành tế bào nấm thực vật (Fusarium, Rhizoctonia, Botrytis). Về phương diện nhận diện loài, tác giả phân tích giới hạn của việc chỉ dùng 16S rRNA và làm rõ tính khả thi của việc khai thác hai gen chỉ thị cpbA (28 kDa) và cpbB (14 kDa).

Cuối chương, tác giả công bố thành phần định danh của chế phẩm “Kaito Nano Hữu Cơ” theo nhãn mác: chứa 4 chủng nấm Trichoderma (T. viride, T. kiningii, T. harzianum, T. polysporum tối thiểu 2,5 tỷ bào tử/g), 5 loài Bacillus (B. subtilis, B. laterosporus, B. licheniformis, B. megaterium, B. pumilus tối thiểu 2,5 tỷ bào tử/g) và vi khuẩn cố định đạm Paenibacillus polymyxa (5 tỷ bào tử/g).

Phần 3: Đối tượng, vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả toàn bộ trang thiết bị phòng thí nghiệm đạt chuẩn vô trùng và hệ hóa chất thí nghiệm. Nội dung thực nghiệm được kết cấu thành 3 nội dung trọng tâm:

1. Thiết kế 4 thí nghiệm đơn yếu tố nhằm khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng ban đầu, nồng độ pha mẫu, nhiệt độ và thời gian sốc nhiệt.
2. Quy trình làm sạch dòng vi khuẩn, kỹ thuật bảo quản giống và các phương pháp thử nghiệm sinh hóa cơ bản (nhuộm Gram, MR, VP, SCA, protease, amylase).
3. Quy trình 16 bước tách chiết DNA bằng CTAB cải tiến cùng thông số luân nhiệt phản ứng PCR cho cặp mồi 16S rRNA và mồi đặc hiệu gen cpbB.

Phần 4: Kết quả và thảo luận

Chương thực nghiệm cung cấp các dữ liệu định lượng cụ thể qua các bước sàng lọc:

1. Tối ưu hóa điều kiện chuẩn bị mẫu phân lập

Các thử nghiệm kiểm tra mật độ khuẩn lạc trên đĩa sau 20 giờ nuôi cấy cho thấy các biến động phụ thuộc thông số xử lý:

Chỉ tiêu khảo nghiệm	Thông số khảo sát	Mật độ khuẩn lạc trung bình (CFU/đĩa)	Đánh giá & Quyết định lựa chọn
Tỷ lệ pha loãng ban đầu (w/v)	CT1 (1:9) CT2 (1:19) CT3 (1:29) CT4 (1:39) CT5 (1:49)	149,67 ± 18,01 114,00 ± 15,10 66,33 ± 13,20 12,33 ± 5,86 1,00 ± 0,00	Các tỷ lệ từ 1:9 đến 1:39 đều nằm trong giới hạn TCVN 6404:2016 (10–300 khuẩn lạc/đĩa). Tác giả chọn 1:19 để cố định cho các thí nghiệm tiếp theo.
Nồng độ pha loãng mẫu	CT1 (10⁻⁴) CT2 (10⁻⁵) CT3 (10⁻⁶) CT4 (10⁻⁷) CT5 (10⁻⁸)	274,33 ± 18,52 185,67 ± 26,76 129,67 ± 15,87 94,33 ± 14,29 34,67 ± 7,51	Nồng độ 10⁻⁷ cho mật độ khuẩn lạc phân bố đồng đều, đếm thuận lợi, đạt chuẩn TCVN. Tác giả chọn 10⁻⁷.
Nhiệt độ xử lý mẫu (trong 5 phút)	CT1 (Nhiệt độ phòng) CT2 (60°C) CT3 (70°C) CT4 (80°C) CT5 (90°C) CT6 (100°C)	> 500 (quá dày) > 500 (quá dày) 274,33 ± 17,62 109,67 ± 10,60 41,67 ± 16,26 2,67 ± 1,53	Ở nhiệt độ thường và 60°C không tiêu diệt được tạp khuẩn; ở 90–100°C số lượng bào tử sống sót giảm mạnh. Tác giả chọn 80°C.

Từ các thử nghiệm trên, điều kiện chuẩn bị mẫu tối ưu được xác lập: pha loãng ban đầu tỷ lệ 1:19 trong dung dịch NaCl 0,85%, sốc nhiệt ở 80°C trong 5 phút, pha loãng mẫu đến nồng độ 10⁻⁷ và cấy trang 100 µl lên đĩa thạch LB.

2. Đặc điểm hình thái và sinh hóa của các chủng tuyển chọn

Từ 20 mẫu vi khuẩn phân lập ban đầu, qua nuôi cấy thuần khiết và quan sát hình thái khuẩn lạc kết hợp nhuộm Gram, tác giả đã tuyển chọn được 5 chủng giả định gồm T7, T10, T12, T16 và T19. Các chủng này đều có khuẩn lạc tròn, màu be hoặc trắng, viền ria, mặt nhẵn, phẳng, tế bào dạng hình que và bắt màu Gram dương.

Kết quả kiểm tra sinh hóa của 5 chủng tuyển chọn:

• Phản ứng MR: Âm tính (dịch nuôi cấy giữ màu vàng, pH ≥ 6,0).
• Phản ứng VP: Âm tính (không xuất hiện phức màu đỏ trên bề mặt).
• Biến dưỡng Citrate: Âm tính (môi trường Simmon’s Citrate Agar giữ nguyên màu xanh lục, không chuyển sang màu xanh dương, chứng tỏ không sử dụng citrate làm nguồn carbon duy nhất).
• Hoạt tính enzyme ngoại bào: Cả 5 chủng đều biểu hiện vòng phân giải gelatin (sinh protease ngoại bào) và vòng phân giải tinh bột (sinh amylase ngoại bào) rõ rệt.

3. Định danh ở mức độ phân tử

• Tách chiết DNA: DNA tổng số của 5 chủng tuyển chọn đạt độ tinh sạch cao, vạch điện di sắc nét.
• Giải trình tự 16S rRNA: Mẫu đại diện T10 được nhân bản đoạn gen 16S rRNA bằng cặp mồi 27F/1492R, gửi giải trình tự tại Công ty Macrogen (Hàn Quốc). Kết quả phân tích BLAST trên NCBI khẳng định độ tương đồng cao với các loài thuộc chi Bacillus và Brevibacillus.
• PCR với mồi đặc hiệu gen cpbB: Phản ứng PCR với cặp mồi CPBB_F và CPBB_R trên các mẫu vi khuẩn T10, T12, T16, T19 đều xuất hiện vạch băng đặc hiệu kích thước chuẩn 600 bp. Mẫu đối chứng âm Bacillus thuringiensis và mẫu đối chứng trắng hoàn toàn không xuất hiện băng vạch. Kết quả khẳng định gen cpbB là chỉ thị phân tử tin cậy để định danh loài Bacillus laterosporus.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính

• Xác lập bộ thông số kỹ thuật chuẩn bị mẫu phân lập Bacillus laterosporus từ chế phẩm vi sinh hữu cơ: tỷ lệ hòa tan mẫu 1:19 (w/v) trong NaCl 0,85%, xử lý sốc nhiệt ở 80°C trong thời gian 5 phút, độ pha loãng cấy mẫu tối ưu là 10⁻⁷ trên đĩa môi trường LB.
• Sàng lọc và phân lập thành công 5 mẫu vi khuẩn mang đầy đủ đặc trưng sinh học của loài (T7, T10, T12, T16, T19): trực khuẩn Gram dương, hình thái khuẩn lạc trắng/be phẳng, viền ria, mang hoạt tính protease và amylase, đồng thời cho kết quả âm tính đồng nhất đối với các thử nghiệm MR, VP và biến dưỡng citrate.
• Chứng minh tính đặc hiệu tuyệt đối của đoạn mồi khuếch đại gen cpbB (600 bp) trong việc phân biệt Bacillus laterosporus với các loài khác trong cùng chi (Bacillus thuringiensis).

Đóng góp thực tiễn và khoa học

• Đề tài đã hoàn thiện một quy trình kiểm nghiệm kết hợp ba cấp độ: xử lý hình thái – đặc tính sinh hóa – chỉ thị phân tử đặc hiệu, giải quyết triệt để vấn đề nhầm lẫn loài do sự tương đồng quá lớn của đoạn gen 16S rRNA giữa các vi khuẩn họ Paenibacillaceae.
• Cung cấp dẫn liệu khoa học trực tiếp và phương pháp thử nghiệm tin cậy phục vụ công tác kiểm tra, giám sát chất lượng các loại phân bón vi sinh và chế phẩm sinh học thương mại, góp phần vào việc xây dựng Tiêu chuẩn Quốc gia (TCVN) cho chỉ tiêu Bacillus laterosporus tại Việt Nam.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Các thí nghiệm của khóa luận mới chỉ triển khai trên một đối tượng sản phẩm thương phẩm duy nhất là “Kaito Nano Hữu Cơ”; phản ứng giải trình tự gen 16S rRNA mới được thực hiện trên mẫu đại diện T10 do giới hạn kinh phí và thời gian.
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  • Mở rộng phạm vi áp dụng quy trình trên nhiều dạng chế phẩm sinh học, phân bón hữu cơ dạng bột, dạng lỏng và các mẫu đất nông nghiệp khác nhau.
  • Ứng dụng kỹ thuật Real-time PCR (qPCR) kết hợp cặp mồi đặc hiệu gen cpbB và cpbA nhằm rút ngắn thời gian phân tích, cho phép định lượng trực tiếp mật độ bào tử B. laterosporus mà không cần qua bước nuôi cấy vi sinh truyền thống.

---

Giá trị tham khảo

• Đối tượng thụ hưởng:
  • Sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Vi sinh vật học Nông nghiệp, Bảo vệ Thực vật và Khoa học Đất.
  • Kỹ thuật viên kiểm nghiệm tại các trung tâm kiểm định phân bón, phòng phân tích chất lượng nông sản và các cơ quan quản lý chất lượng chế phẩm vi sinh.
• Phần nội dung có giá trị ứng dụng cao:
  • Quy trình xử lý mẫu sốc nhiệt loại trừ vi khuẩn tạp (80°C, 5 phút, độ loãng 10⁻⁷).
  • Quy trình tách chiết DNA vi khuẩn sinh bào tử bằng đệm CTAB kết hợp enzyme Lysozyme.
  • Trình tự cặp mồi CPBB_F / CPBB_R và chu trình nhiệt PCR nhân bản đoạn gen đặc hiệu 600 bp.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao nghiên cứu lại chọn tỷ lệ pha loãng ban đầu là 1:19 và độ pha loãng 10⁻⁷ để cấy trang?
Theo quy định tại TCVN 6404:2016, số lượng khuẩn lạc trên đĩa nuôi cấy phục vụ việc định tính và định lượng vi sinh vật phải dao động từ 10 đến 300 khuẩn lạc/đĩa. Ở tỷ lệ 1:19, số lượng khuẩn lạc trung bình thu được là 114,00 ± 15,10 khuẩn lạc/đĩa; ở độ pha loãng 10⁻⁷, số lượng khuẩn lạc là 94,33 ± 14,29 khuẩn lạc/đĩa. Đây là khoảng mật độ tối ưu, đảm bảo độ tin cậy thống kê và giúp việc đếm khuẩn lạc đơn lẻ bằng mắt thường đạt độ chính xác cao nhất.

2. Mục đích của việc xử lý nhiệt mẫu ở 80°C trong 5 phút là gì và tại sao không chọn mức 60°C hay 100°C?
Việc xử lý nhiệt nhằm sốc nhiệt để tiêu diệt toàn bộ tế bào sinh dưỡng và các loài vi khuẩn không có khả năng sinh bào tử trong mẫu chế phẩm. Thí nghiệm cho thấy ở nhiệt độ phòng và 60°C, mật độ khuẩn lạc mọc dày đặc (> 500 khuẩn lạc/đĩa), không thể phân lập riêng rẽ. Ngược lại, ở 100°C, nhiệt độ quá cao làm tổn thương cả nội bào tử, khiến số lượng khuẩn lạc giảm xuống chỉ còn 2,67 ± 1,53 CFU/đĩa. Mức nhiệt 80°C trong 5 phút duy trì số lượng khuẩn lạc ổn định (109,67 ± 10,60 CFU/đĩa), đảm bảo chọn lọc đúng các chủng sinh bào tử.

3. Các đặc điểm hóa sinh đặc trưng nào xác định 5 chủng vi khuẩn tuyển chọn (T7, T10, T12, T16, T19)?
Cả 5 chủng đều cho kết quả âm tính với phản ứng Methyl Red (không duy trì nồng độ acid cao khi lên men glucose), âm tính với phản ứng Voges-Proskauer (không tạo acetoin), không có khả năng sử dụng citrate làm nguồn carbon duy nhất trên môi trường SCA (thạch giữ nguyên màu xanh lục), đồng thời biểu hiện hoạt tính sinh enzyme ngoại bào protease (thủy phân gelatin) và amylase (thủy phân tinh bột).

4. Vì sao nghiên cứu phải sử dụng cặp mồi đặc hiệu khuếch đại gen cpbB thay vì chỉ giải trình tự 16S rRNA?
Vùng gen 16S rRNA có mặt ở hầu hết các loài vi khuẩn và mức độ tương đồng trình tự giữa các loài thuộc chi Bacillus là rất cao, khiến việc định danh chính xác loài gặp hạn chế. Gen cpbB mã hóa protein 14 kDa liên kết với thể ký sinh hình xuồng (CSPB)—cấu trúc chỉ có duy nhất ở Bacillus laterosporus. Kết quả PCR cho thấy sản phẩm 600 bp chỉ xuất hiện ở các mẫu B. laterosporus mà hoàn toàn không xuất hiện ở chủng vi khuẩn đối chứng Bacillus thuringiensis, chứng minh tính chính xác tuyệt đối ở cấp độ loài.

5. Nhãn mác chế phẩm sinh học “Kaito Nano Hữu Cơ” công bố những thành phần vi sinh vật nào?
Theo nhãn sản phẩm, chế phẩm chứa thành phần vi sinh từ công nghệ Nano-Gro™ gồm: 4 chủng nấm Trichoderma (T. viride, T. kiningii, T. harzianum, T. polysporum) với mật độ tối thiểu 2,5 tỷ bào tử/g; 5 loài vi khuẩn chi Bacillus (B. subtilis, B. laterosporus, B. licheniformis, B. megaterium, B. pumilus) tối thiểu 2,5 tỷ bào tử/g; và vi khuẩn cố định đạm Paenibacillus polymyxa tối thiểu 5 tỷ bào tử/g.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Đỗ Thủy Nguyên đã xây dựng thành công quy trình thực nghiệm đồng bộ để phân lập và định danh vi khuẩn Bacillus laterosporus từ chế phẩm sinh học phức hợp. Nghiên cứu xác lập các thông số xử lý mẫu tối ưu (tỷ lệ pha loãng ban đầu 1:19, xử lý nhiệt 80°C trong 5 phút, nồng độ pha loãng 10⁻⁷), đồng thời xác định các đặc tính hình thái và hóa sinh điển hình của 5 chủng tuyển chọn. Đóng góp nổi bật của đề tài là việc chứng minh và áp dụng thành công cặp mồi đặc hiệu gen cpbB (kích thước 600 bp) để định danh chính xác loài ở mức độ sinh học phân tử, khắc phục triệt để hạn chế của kỹ thuật giải trình tự 16S rRNA. Kết quả này cung cấp cơ sở kỹ thuật và luận cứ khoa học tin cậy cho công tác kiểm định chất lượng phân bón vi sinh và xây dựng Tiêu chuẩn Quốc gia tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Nền nông nghiệp Việt Nam đang có xu hƣớng phát triển theo canh tác hữu cơ để góp phần đảm bảo sức khỏe cho ngƣời tiêu dùng và đảm bảo phát triển nông nghiệp bền vững, đồng thời giảm sự tích tụ nitrate, tồn dƣ các chất hóa học và kim loại nặng ở một số vùng, gây ô nhiễm nguồn nƣớc, môi trƣờng đất và sức khỏe con ngƣời (Anitha và cs. Cùng với sự phát triển nhanh chóng của công nghệ sinh học và nhu cầu đảm bảo các điều kiện sinh thái của đời sống và công nghiệp, ngƣời ta ngày càng quan tâm hơn đến vi khuẩn sinh bào tử. Phân bón và chế phẩm vi sinh có chứa các nhóm vi sinh vật cố định đạm, phân giải chất hữu cơ, phân giải phosphate khó tan, kích thích sinh trƣởng thực vật, ngăn ngừa và phòng trừ bệnh hại tác động từ môi trƣờng hoặc các vi sinh vật gây bất lợi cho cây trồng là một thành phần quan trọng trong nền nông nghiệp bền vững này (Danielsson và cs. Nhiều nghiên cứu trƣớc đây đã xác định đƣợc các nhóm vi sinh vật nhƣ nấm Aspergillus, Penicillium, vi khuẩn Bacillus, Pseudomonas… có khả năng tiết các enzyme để phân giải lân và kali thành dạng dễ tan, hữu dụng cho cây trồng.

Một số vi khuẩn còn có khả năng sinh tổng hợp các chất kích thích sinh trƣởng giúp cây phát triển nhanh. Trong nông nghiệp, các vi khuẩn thuộc chi Bacillus tham gia vào quá trình hòa tan các chất từ khó tan sang dạng dễ tan (Gupta và cs., 2002), giúp cải tạo đất, tăng năng suất cây trồng hoặc đối kháng với một số nấm gây bệnh và vi khuẩn ở vùng rễ cây trồng (Fan và cs., 2012), làm phong phú thêm hệ vi sinh vật đất và trả lại độ phì nhiêu cho đất. Bacillus laterosporus, còn đƣợc biết đến dƣới tên Brevibacillus laterosporus, là nhóm vi khuẩn thuộc chi Bacillus đƣợc nghiên cứu và ứng dụng hết sức rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Bacillus laterosporus tiết một lƣợng lớn chitinase nên có khả năng ức chế mạnh mẽ các loại nấm bệnh và các vi khuẩn có hại nhƣ 1 Escherichia coli, Baculovirus.

Mặt khác, Bacillus laterosporus còn thúc đẩy sự phát triển của thực vật thông qua việc kích thích sự phát triển của bộ rễ, tăng cƣờng khả năng hấp thụ chất dinh dƣỡng và khả năng quang hợp (Song và cs. Chính nhờ đặc tính này mà vi khuẩn Bacillus laterosporus đã và đang đƣợc ứng dụng rộng rãi trong việc sản xuất phân bón và chế phẩm vi sinh. Các chế phẩm sinh học nhƣ Kaito Nano Hữu Cơ, Bio Sun, phân bón hữu cơ nấm đối kháng Trichoderma Bacillus HLC,. có chứa thành phần là Bacillus laterosporus.

Hiện nay, các tiêu chuẩn đã ban hành ở nƣớc ta không thể áp dụng để đánh giá định tính và định lƣợng vi khuẩn Bacillus laterosporus trong phân bón vi sinh và chế phẩm sinh học. Vì vậy, việc xây dựng tiêu chuẩn quốc gia cho các chỉ tiêu vi sinh vật hữu ích, trong đó có phân bón vi sinh có chứa vi khuẩn Bacillus laterosporus là cần thiết để phục vụ cho công tác kiểm tra, quản lý chất lƣợng sản phẩm phân bón vi sinh nhằm nâng cao hiệu quả sản xuất nông nghiệp và bảo vệ quyền lợi của ngƣời tiêu dùng. Việc nghiên cứu xây dựng phƣơng pháp định tính và định lƣợng vi khuẩn Bacillus laterosporus trong mẫu chế phẩm vi sinh ở điều kiện Việt Nam là cần thiết, có ý nghĩa khoa học và ứng dụng. Xuất phát từ thực tiễn đó, từ xu hƣớng nghiên cứu hiện nay trên thế giới và trong nƣớc, đề tài nghiên cứu nhằm phát triển phƣơng pháp xác định vi khuẩn Bacillus laterosporus trong chế phẩm sinh học.

Mục đích và yêu cầu 1. Mục đích Xây dựng phƣơng pháp xác định vi khuẩn Bacillus laterosporus trong chế phẩm sinh học. Yêu cầu - Xác định phƣơng pháp chuẩn bị mẫu thích hợp cho quá trình phân lập vi khuẩn Bacillus laterosporus trong chế phẩm sinh học. 2 - Đánh giá đƣợc các đặc điểm hình thái và sinh hoá của các mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus giả định trong chế phẩm sinh học.

- Định danh đƣợc vi khuẩn Bacillus laterosporus bằng phƣơng pháp giải trình tự 16S rRNA và phƣơng pháp PCR sử dụng mồi đặc hiệu. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Giới thiệu chung về vi khuẩn Bacillus laterosporus Bacillus laterosporus là một vi khuẩn Gram dƣơng, hình que, hình thành nội bào tử, thuộc họ Paenibacillaceae. Bacillus laterosporus là một loài phổ biến đã đƣợc phân lập từ nhiều loại vật liệu nhƣ đất, đá quý, dung nham, nƣớc ngọt, nƣớc biển, côn trùng, bề mặt lá, phân hữu cơ, sữa, pho mát, mật ong, thực phẩm giàu tinh bột, gelatin - nƣớc thải nhà máy, da thú và len, chim cút (Ruiu, 2013).

Bacillus laterosporus đã đƣợc báo cáo là có tiềm năng đƣợc sử dụng nhƣ một tác nhân kiểm soát sinh học với phổ hoạt động sinh học rất rộng - bao gồm ốc sên, tuyến trùng và côn trùng. Chúng có khả năng tạo ra một thể ký sinh phiến mỏng hình chiếc xuồng gắn chặt vào một bên của bào tử (Hong và cs. Ở ngƣời, Bacillus laterosporus tồn tại trong điều kiện axit dạ dày. Sau khi vào ruột, các bào tử bắt đầu nảy mầm và nhân lên sau mỗi 32 phút.

Tuy nhiên, đây là vi khuẩn sống trong đất và cũng giống nhƣ các vi khuẩn sống trong đất khác, chúng sẽ không phát triển thành các khuẩn lạc lớn, sống lâu dài trong ruột. Các khuẩn lạc chỉ tạm thời phát triển và sẽ bắt đầu chết trong vòng 3 ngày hoặc lâu hơn. Các nghiên cứu đã cho thấy rằng Bacillus laterosporus hoàn toàn an toàn với ngƣời (Nivetha và Halka, 2017). Ảnh nhuộm Gram của tế bào Bacillus laterosporus dƣới kính hiển vi (https://microbiology-micro.com/2011/07/brevibacillus-laterosporus.html) Tiềm năng kiểm soát sinh học đối với côn trùng gây bệnh của Bacillus laterosporus đã đƣợc báo cáo chống lại côn trùng theo các bộ khác nhau bao gồm Coleoptera, Lepidoptera, Diptera và chống lại tuyến trùng và động vật thân mềm (Ruiu, 2013).

Ngoài khả năng gây bệnh đối với động vật không xƣơng sống, các chủng Bacillus laterosporus khác nhau còn thể hiện hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng, đặc biệt là đối với vi khuẩn và nấm. Nhiều loại phân tử, bao gồm protein và kháng sinh, có liên quan đến khả năng gây bệnh và phƣơng thức hoạt động đã đƣợc nghiên cứu. Toàn bộ trình tự bộ gen gần đây của Bacillus laterosporus cho thấy tiềm năng sản xuất polyketide, nonribosomal peptide và độc tố của chủng vi khuẩn này (Djukic và cs., 2011; Sharma và cs. Bacillus laterosporus cũng đƣợc liệt kê trong số các chế phẩm sinh học cho động vật có vú và chim (Hong và cs., 2005; Porubcan, 2003), các loại kháng sinh cụ thể có nguồn gốc từ Bacillus laterosporus đã và đang đƣợc sử dụng trong y học (Umezawa và Takeuchi, 1987).

Hình thái khuẩn lạc Bacillus laterosporus (https://microbiology- micro.com/2011/07/brevibacillus-laterosporus. Lịch sử phát hiện Nghiên cứu về tầm quan trọng của mối quan hệ giữa Bacillus laterosporus với côn trùng đã đƣợc ghi nhận sau khi chủng vi khuẩn này đƣợc phân lập lần đầu tiên vào đầu thế kỷ 20 bởi White (1912). Khi đó, ông đang tiến hành nghiên cứu về vi khuẩn ở ong mật châu Âu. Trong số những vi khuẩn gây bệnh, ông đã phân lập đƣợc một loài mới mà ông đặt tên là Bacillus orpheus White (White, 1912).

Một mô tả chi tiết về vi khuẩn này đã đƣợc đƣa ra vào năm 1917 bởi McCray, ngƣời đã phân lập các vi khuẩn sinh bào tử khác nhau của một nhà nuôi ong. Tuy nhiên, một năm trƣớc đó, Bacillus laterosporus đã đƣợc đặt tên và mô tả bởi Laubach, ngƣời đã phân lập đƣợc một chủng khác từ nƣớc ngọt. Sau đó, do sự tƣơng đồng giữa hai chủng phân lập, tên thứ hai đƣợc ƣu tiên hơn và đƣợc chọn để chỉ loài vi khuẩn này. Năm 1946, Steinhaus đã liệt kê chúng trong số các loài vi khuẩn hình thành bào tử.

Theo kết quả của các nghiên cứu phân loại gần đây dựa trên phân tích trình 6 tự 16S rRNA, loài này đã đƣợc chuyển vào chi Brevibacillus mới trong cụm Brevibacillus brevis (Ruiu, 2013). Túi bào tử của vi khuẩn Bacillus laterosporus. SW: thành túi bào tử; Sp: bào tử; SC: vách bào tử; CSPB: thể ký sinh hình xuồng (Ruiu và cs. Các giả thuyết khác nhau đã đƣợc đƣa ra về vai trò và chức năng có thể có của các thể ký sinh có thể đóng vai trò là đơn vị lƣu trữ nếu bào tử nảy mầm trong môi trƣờng thiếu hụt, có thể hỗ trợ sự nảy mầm của bào tử hoặc có thể là vách phụ hoặc chỉ là biến dạng của vách bào tử.

Tuy nhiên, chức năng cụ thể vẫn chƣa đƣợc 7 xác nhận cho đến nay. Fitz James và Young (1958) đã phân tích thành phần hóa học của cấu trúc vách bào tử, sau khi phát triển một phƣơng pháp tách nó ra khỏi nguyên sinh bào tử. Theo nghiên cứu của họ, các thành phần chính của CSPB là photpho và cs nitrogen. Ngoài ra còn có protein đƣợc thu hồi thông qua chiết xuất kiềm với sự có mặt của chất khử (alkali -thioglycollate) phá vỡ liên kết S-S.

Kết quả phân tích kết hợp giữa hình thái và hóa học cho thấy thành phần photpho là một phần của cấu trúc thể ký sinh hình xuồng, còn lại các protein chiết xuất là chất nền của CSPB (Fitz James và Young, 1958). Các thể ký sinh khác (PB), khác biệt với CSPB, đƣợc tìm thấy bên trong túi bào tử bởi Montaldi và Roth (1990). Đây là các thể ký sinh, hình cầu với dạng góc cạnh hoặc vân với các dải song song xen kẽ. Chức năng của các cấu trúc này chƣa đƣợc làm rõ nhƣng có ý kiến cho rằng chúng có liên quan đến hoạt động diệt côn trùng chống lại Diptera của vi khuẩn Bacillus laterosporus (Ruiu và cs.

Đặc tính đối kháng Một số chủng vi khuẩn Bacillus laterosporus thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với các loại vi khuẩn và nấm khác nhau. Đặc tính sinh học này cũng đƣợc thấy ở các loài khác của chi Brevibacillus và có liên quan đến việc sản xuất nhiều loại enzyme và kháng sinh (Chandel và cs. Một chủng Bacillus laterosporus đƣợc phân lập từ bùn ở Ấn Độ, đƣợc gọi là BPM3, đƣợc báo cáo rằng có khả năng ức chế sự phát triển của nấm thực vật Fusarium oxysporum f. & Ravenel, Magnaporthe grisea (Hebert) Barr và Rhizoctonia oryzae Ryker & Gooch, và của cầu khuẩn Gram dƣơng Staphylococcus aureus Rosenbach (Saikia và cs.

Bằng chứng về sự ức chế nấm cũng đƣợc ghi nhận ở chủng vi khuẩn Bacillus laterosporus ZQ2 đƣợc phân lập từ rễ cây táo ở Trung Quốc. Chủng vi khuẩn ZQ2 có khả năng ức chế nấm gây bệnh trên cây táo bao gồm Rhizoctonia solani Kuhn, 8 Fusarium oxysporum Schlecht, F.), Aspergillus fumigatus Fres, Alternaria alternata (Fr.) Keissler, Valsa sordida Nits, Colletotrichum gloeosporioides (Penz., Botrytis cinerea Pers. và Physalospora piricola Nose.