Luận văn: Xác định ginsenosid trong TPCN nhân sâm (Panax Ginseng) - Nguyễn Thị Hạnh

Luận văn nghiên cứu phương pháp xác định ginsenosid trong thực phẩm chức năng chứa nhân sâm Panax Ginseng. Tài liệu hữu ích cho phân tích và kiểm nghiệm.

• Tác giả: Nguyễn Thị Hạnh
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Ánh Hường
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Hóa phân tích
• Đề tài: Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định một số ginsenosid trong thực phẩm chức năng chứa nhân sâm (Panax Ginseng)
• Loại tài liệu: Luận văn Thạc sĩ Khoa học
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Khái niệm về Ginsenosid và Tầm Quan Trọng trong TPCN Nhân Sâm

Ginsenosid là những hợp chất saponin chủ yếu có trong nhân sâm (Panax ginseng), đóng vai trò quyết định trong công dụng sinh học của thực phẩm chức năng. Những ginsenosid chính như Rg1 và Rb1 là các chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng và hiệu lực của TPCN nhân sâm. Việc xác định ginsenosid không chỉ giúp kiểm soát chất lượng sản phẩm mà còn đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm cho người tiêu dùng. Các phương pháp phân tích ginsenosid ngày càng được hoàn thiện, cho phép phát hiện chính xác nồng độ các hợp chất này trong các dạng TPCN khác nhau như viên nang, bột, dung dịch. Hiểu rõ về cấu trúc và tính chất của ginsenosid giúp lựa chọn phương pháp phân tích phù hợp nhất.

1.1. Định nghĩa Ginsenosid

Ginsenosid là những saponin triterpenoid có aglycon là protopanaxadiol, protopanaxatriol hoặc acid oleanolic. Các hợp chất này có công thức C6H11O-glucose với các biến thể khác nhau, tạo nên hơn 30 loại ginsenosid khác nhau. Trong đó, Rg1 và Rb1 là hai loại chính được nghiên cứu và định lượng nhiều nhất trong các TPCN nhân sâm.

1.2. Tác dụng Sinh học của Ginsenosid

Mỗi loại ginsenosid có tác dụng đặc trưng riêng. Ginsenosid Rg1 hỗ trợ tăng cường sức đề kháng, cải thiện suy giảm nhận thức. Ginsenosid Rb1 giúp tăng cường miễn dịch, giảm căng thẳng. Việc định lượng chính xác các ginsenosid này là cơ sở để đánh giá hiệu lực thực phẩm chức năng.

II. Phương Pháp HPLC trong Xác Định Ginsenosid

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp phổ biến nhất để xác định ginsenosid trong TPCN nhân sâm. Phương pháp này cho phép tách biệt các thành phần một cách hiệu quả, với độ phân giải cao và lặp lại tốt. HPLC pha đảo (RP-HPLC) sử dụng gradient acetonitril (ACN) và nước, cho phép phát hiện các ginsenosid khác nhau dựa trên thời gian lưu giữ (tR) riêng. Kết hợp với detector PDA (mảng diod quang), phương pháp này có thể định lượng chính xác nồng độ ginsenosid ngay cả ở nồng độ thấp. Các chương trình gradient khác nhau được khảo sát để tối ưu hóa điều kiện tách biệt, đảm bảo độ tuyến tính cao (R² > 0.99) trong xây dựng đường chuẩn. Phương pháp HPLC đã được xác nhận theo tiêu chuẩn AOAC và USP.

2.1. Nguyên Lý và Ưu Điểm của HPLC

HPLC hoạt động dựa trên nguyên lý phân vùng giữa pha tĩnh và pha động. Ưu điểm chính bao gồm độ phân giải cao, thời gian phân tích nhanh, độ lặp lại tốt (RSD < 5%), và khả năng phát hiện đồng thời nhiều ginsenosid. Giới hạn phát hiện (LOD) thấp cho phép phát hiện các tạp chất ở nồng độ μg/mL.

2.2. Điều Kiện Tối Ưu và Xây Dựng Đường Chuẩn

Các chương trình gradient được thiết kế sử dụng ACN và nước chứa 0.1% acid acetic. Chiết mẫu sử dụng methanol 70% hoặc n-butanol cho hiệu quả cao nhất. Đường chuẩn được xây dựng từ 5-7 điểm nồng độ, đạt độ tuyến tính R² > 0.99. Giới hạn định lượng (LOQ) thường ở mức 0.1-0.5 μg/mL tùy theo ginsenosid.

III. Phương Pháp HPTLC trong Xác Định Ginsenosid

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) là phương pháp bán định lượng hiệu quả để xác định ginsenosid trong các TPCN nhân sâm. Phương pháp này nhanh hơn HPLC về thời gian phân tích, chi phí thấp hơn, phù hợp với kiểm định hàng loạt. Hệ pha động được khảo sát bao gồm các dung môi như methanol, nước, và acid, với hệ số lưu giữ (Rf) đặc trưng cho mỗi ginsenosid. Phát hiện UV-VIS tại bước sóng 254 nm hoặc 280 nm cho phép nhận diện các ginsenosid dựa trên mức di động trên tấm. Phương pháp HPTLC có độ lặp lại tốt (RSD < 10%) và hiệu suất thu hồi cao (85-105%), phù hợp làm phương pháp sàng lọc nhanh chóng trước khi tiến hành HPLC chi tiết hơn.

3.1. Nguyên Lý và Ứng Dụng của HPTLC

HPTLC dựa trên nguyên lý hấp phụ của các ginsenosid trên tấm silica gel. Mức di động của Rg1 khác với Rb1, tạo nên các vết riêng biệt dễ nhận diện. Ứng dụng chính là kiểm tra nhanh thành phần ginsenosid trong TPCN, xác định tạp chất, hoặc phát hiện ginsenosid giả mạo. Phương pháp này tiết kiệm chi phí và thời gian so với HPLC.

3.2. Pha Động và Điều Kiện Tối Ưu HPTLC

Các pha động được khảo sát gồm methanol-nước, ethyl acetate-methanol-nước với các tỷ lệ khác nhau. Hệ số Rf được tính toán và lập bảng tham chiếu cho từng ginsenosid. Phát hiện sử dụng UV 254 nm hoặc tẩm reagent phát triển màu. Độ phân giải (Rs) giữa các vết phải lớn hơn 1.5 để phân tách tốt.

IV. Quy Trình Mẫu và Kiểm Định Phương Pháp Xác Định Ginsenosid

Quy trình chuẩn bị mẫu là bước quan trọng quyết định độ chính xác của xác định ginsenosid. Mẫu TPCN nhân sâm dưới các dạng viên nang cứng, viên nang mềm, bột, hoặc dung dịch được xử lý khác nhau. Chiết mẫu sử dụng methanol 70% hoặc n-butanol với số lần chiết khác nhau để đạt hiệu suất tối đa. Kiểm định phương pháp bao gồm đánh giá độ tuyến tính (R² > 0.99), độ chính xác (hiệu suất thu hồi 85-105%), độ lặp lại (RSD < 5% cho nội bộ, < 10% cho liên phòng), và tính chọn lọc (phân tách các ginsenosid khác nhau). Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) được xác định theo hướng dẫn ICH. Các chất chuẩn cần có độ tinh khiết ≥ 98%, được chuẩn độ trước sử dụng. Phương pháp được xác nhận theo tiêu chuẩn AOAC, USP hoặc EP.

4.1. Chuẩn Bị và Chiết Mẫu

Mẫu TPCN được xay nhuyễn (nếu là bột), hoặc tách nội dung viên nang. Chiết mẫu thực hiện với methanol 70% hoặc n-butanol ở tỷ lệ 1:10 đến 1:20 (m/v), cục bộ trong 30-60 phút. Lọc mẫu qua vải lọc rồi lọc 0.45 μm trước khi tiêm vào hệ HPLC. Lặp lại chiết 2-3 lần để đạt hiệu suất cao nhất, gộp dung dịch chiết lại với nhau.

4.2. Kiểm Định và Xác Thực Phương Pháp

Tuyến tính được đánh giá bằng cách xây dựng đường chuẩn từ 5-7 nồng độ, tính hệ số tương quan R². Chính xác kiểm tra qua hiệu suất thu hồi bằng cách thêm chất chuẩn vào mẫu ở 3 nồng độ (50%, 100%, 150%). Lặp lại đánh giá bằng cách chiết và đo 6 lần cùng mẫu, tính RSD. Tính chọn lọc xác định bằng khả năng phân tách các ginsenosid khác nhau.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Từ xa xƣa, nhân sâm (tên khoa học là Panax Ginseng) đã đƣợc xem là thảo dƣợc quý hiếm. Hoạt chất chính tạo nên tác dụng kỳ diệu của nhân sâm là thành phần ginsenosid. Hợp chất này đƣợc phân thành hai nhóm chính là nhóm Rb1 và nhóm Rg1. Vài năm gần đây nhiều nhà khoa học hƣớng tới sự quan tâm đặc biệt tới nhân sâm với rất nhiều nghiên cứu đƣợc công bố.

Ở Việt Nam cũng nhƣ trên thế giới, nhân sâm đƣợc biết đến không chỉ là nguồn dinh dƣỡng quý báu mà còn là một vị thuốc vô cùng quan trọng. Theo nghiên cứu khoa học và sách đông y thì nhân sâm có nhiều tác dụng tốt cho sức khỏe con ngƣời. Ở Việt Nam hiện nay, nhu cầu sử dụng nhân sâm tăng cao. Nguồn nguyên liệu này chủ yếu đƣợc nhập từ Trung Quốc, Hàn Quốc… nên rất dễ bị giả mạo, sản phẩm nhập về chất lƣợng không đáp ứng đƣợc chất lƣợng.

Vì vậy việc kiểm soát tính đúng và chất lƣợng nguyên liệu đầu vào là rất quan trọng. Tuy nhiên, việc kiểm nghiệm chất lƣợng nguyên liệu nhân sâm và thực phẩm chức năng chứa nhân sâm ở nƣớc ta vẫn còn nhiều hạn chế dẫn tới tình trạng ngƣời dân sử dụng nhầm dƣợc liệu hoặc mua phải dƣợc liệu đã bị chiết hết hoạt chất, kém chất lƣợng. Điều này không những gây ảnh hƣởng đến sức khỏe của ngƣời bệnh, quyền lợi ngƣời tiêu dùng mà còn gây mất lòng tin của mọi ngƣời khi sử dụng thuốc từ dƣợc liệu nói chung, gây tổn hại cho ngành Y tế và Kinh tế của đất nƣớc. Thông thƣờng các phƣơng pháp đƣợc sử dụng để phân tích hàm ginsenosid Rg1 và Rb1 bao gồm: các phƣơng pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS), điện di mao quản (CE), sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPTLC), sắc ký bản mỏng hiệu năng cao (HPTLC).

ở Việt Nam phƣơng pháp đƣợc sử dụng chủ yếu là phƣơng pháp HPLC. Phƣơng pháp HPLC đƣợc áp dụng tại viện Kiểm Nghiệm An Toàn Vệ Sinh Thức Phẩm Quốc Gia để định tính và định lƣợng ginsenosid trong thực phẩm chức năng có chứa nhân sâm. Tuy nhiên chƣa có tiêu chuẩn về việc định lƣợng ban hành ở Việt Nam. Do vậy việc áp dụng phụ thuộc vào điều kiện phòng thí nghiệm cụ thể.

Ngoài ra, phƣơng pháp HPTLC cho thấy tiềm năng áp dụng để kiểm tra nhanh chất lƣợng của nhân sâm và các sản phẩm từ 3 sâm. Do vậy chúng tôi lựa chọn đề tài nghiên cứu với hi vọng xây dựng một phƣơng pháp nhằm so sánh, kiểm chứng phƣơng pháp phân tích. Xuất phát từ những yêu cầu trên, chúng tôi tiến hành đề tài : “Nghiên cứu phƣơng pháp xác định một số ginsenosid trong thực phẩm chức năng chứa nhân sâm (Panax Ginseng)”. Mục tiêu nghiên cứu:  Xây dựng phƣơng pháp xác định đồng thời hai ginsenosid (Rg1 và Rb1) bằng kỹ thuật HPTLC và HPLC.

 Thẩm định phƣơng pháp đã đã xây dựng theo các tiêu chí của thế giới.  Áp dụng triển khai phân tích một số mẫu thực phẩm chức năng chứa nhân sâm trên thị trƣờng Hà Nội. 4 CHƢƠNG 1 – TỔNG QUAN 1. Tổng quan về nhân sâm và hoạt chất trong nhân sâm 1.

Giới thiệu chung về nhân sâm Bộ phận thƣờng sử dụng là rễ củ đã đƣợc phơi hay sấy khô của Nhân sâm (Panax ginseng C. Meyer) thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae). Họ Nhân sâm (Araliaceae Juss.) còn có tên gọi khác là họ Ngũ gia bì. Hầu nhƣ tất cả các loài trong họ nhân sâm (Araliaceae) đều đƣợc sử dụng làm thuốc trong Y học cổ truyền ở nhiều nƣớc Á-Âu; đặc biệt là ở các nƣớc Đông-Bắc Á.

Sâm trồng gọi là viên sâm, sâm mọc hoang gọi là sơn sâm. Viên sâm: Sâm trồng, phơi hoặc sấy khô, rễ cái có hình thoi hoặc hình trụ tròn, dài khoảng 3 - 15 cm, đƣờng kính 1 - 2 cm, mặt ngoài màu vàng hơi xám, phần trên hoặc toàn bộ rễ có nếp nhăn dọc rõ, có khía vân ngang, thô, không liên tục, rải rác và nông. phần dƣới có 2 - 3 rễ nhánh và nhiều rễ con nhỏ, dài, thƣờng có mấu dạng củ nhỏ không rõ. Chất tƣơng đối cứng, mặt bẻ màu trắng hơi vàng, có tinh bột rõ, tầng phát sinh vòng tròn, màu vàng hơi nâu, vỏ có ống tiết nhựa, dạng điểm, màu vàng nâu và những kẽ nứt dạng xuyên tâm.

Mùi thơm đặc trƣng, vị hơi đắng và ngọt. Hồng sâm: Hấp, sấy và phơi khô rễ viên sâm thu đƣợc Hồng sâm; Hồng sâm có dạng rễ cái hình thon hoặc hình trụ, dài khoảng 3 - 15 cm, đƣờng kính 1 - 2 cm, mặt ngoài trong mờ, màu nâu hơi đỏ, đôi khi có một vài vết đốm màu nâu hơi vàng thẫm, có rãnh dọc, vân nhăn và các vết sẹo rễ con; phần đầu rễ cái có các vòng tròn gián đoạn, không rõ nét, phần đuôi rễ cái mang 2-3 rễ nhánh vặn xoắn, chéo nhau và nhiều rễ con cong queo, hoặc chỉ mang những vết sẹo thân, tròn, lõm (Lô uyển); một số thân rễ mang 1 - 2 rễ phụ, còn nguyên dạng hoặc đã gẫy (gọi là đinh). Chất cứng và giòn, mặt bẻ gẫy nhẵn, tựa nhƣ sừng. Mùi thơm đặc trƣng, vị ngọt và hơi đắng.

5 Sơn sâm: Nhân sâm mọc hoang, phơi hay sấy khô. Dƣợc liệu là rễ cái, dài bằng hoặc ngắn hơn thân rễ, có hình chữ V, hình thoi hoặc hình trụ, dài 2 - 10 cm, mặt ngoài màu vàng hơi xám, có vân nhăn dọc, đầu trên có các vòng vân ngang, trũng sâu, dày đặc, thƣờng có 2 rễ nhánh, các rễ con trông rõ ràng, mảnh dẻ, nhỏ sắp xếp có thứ tự; có mấu nổi lên rõ gọi là “mấu hạt trân châu”. Thân rễ mảnh dẻ, nhỏ, dài, bộ phận trên có các vết sẹo thân, dày đặc, các rễ phụ tƣơng đối dày đặc, trông tựa nhƣ hình hạt táo. Nhân sâm mọc hoang và đƣợc trồng ở đông bắc Trung quốc, Triều Tiên, Liên xô cũ.

Việc trồng trọt nhân sâm rất công phu, sau 5-6 năm mới thu hoạch. Đất phải tốt. Cây ƣa bóng râm. Thu hoạch vào mùa xuân và mùa thu, rễ củ đƣợc rửa sạch, phơi nắng nhẹ, hoặc sấy nhẹ đến khô.

Ngƣời ta cho rằng loại mọc hoang có giá trị hơn loại trồng. Hiện nay nƣớc ta chƣa trồng đƣợc, còn phải nhập nhân sâm của nƣớc ngoài. Hiện nay các nhà khoa học đã tìm ra trong nhân sâm có chứa nhiều thành phần khác nhau, tuy nhiên ginsenosid, chính là thành phần quyết định tác dụng của nhân sâm. Đây chính là chất có khả năng tạo ra những ảnh hƣởng tích cực đối với sức khỏe.

Tác dụng đặc trƣng của nhân sâm Theo y học cổ truyền nhân sâm có công dụng: Đại bổ nguyên khí, ích huyết, kiện tỳ ích phế, sinh tân, an thần ích trí. Chủ trị: Khí hƣ muốn thoát, chân tay lạnh, mạch vi, tỳ hƣ, kém ăn, phế hƣ ho suyễn; tân dịch thƣơng tổn, miệng khát nƣớc, nội nhiệt tiêu khát, đái tháo, bệnh lâu ngày gầy yếu, tâm hồi hộp, suy tim kiệt sức, hay choáng ngất. Thành phần hoạt chất của ginsenosid trong nhân sâm có tác dụng đặc trƣng khác nhau đƣợc tóm tắt trong bảng 1. Tác dụng đặc trưng của từng loại ginsenosid Ginsenosid Tác dụng đặc trƣng Ro Phân giải rƣợu, chống viêm gan và phục hồi hƣ tổn gan.

Rb1 Là Saponin có thể kiểm chế hệ thống thần kinh trung ƣơng làm dịu cơn đau, bảo vệ tế bào gan. Rb2 Ngăn ngừa, hạn chế bệnh tiểu đƣờng, phòng chống xơ cứng gan, đẩy nhanh khả năng hấp thụ của tế bào gan. Rc Làm dịu cơn đau, tăng tốc độ tổng hợp protein. Ức chế sự tăng trƣởng của tế bào ung thƣ, ngăn cản hoặc hạn chế sự phát triển của ung thƣ vú Rd Đẩy nhanh hoạt động của vỏ tuyến thƣợng thận Re Bảo vệ gan, làm tăng tốc độ tổng hợp của các tế bào tủy.

Rf Làm dịu cơn đau trong các tế bào não Rg1 Khả năng gây hƣng phấn thần kinh trung ƣơng, chống và phục hồi mỏi mệt, cải thiện trí nhớ, tạo DNA, RNA, kích hoạt protease. Rg2 Hạn chế sự gắn kết các tiểu cầu máu, phục hồi trí nhớ, tăng khả năng lƣu thông máu lên não, kéo dài thời gian sống của tế bào. Rh1 Bảo vệ gan, hạn chế khối u, ngăn chặn gắn kết tiểu cầu máu. Rh2 Ức chế các tế bào ƣng thƣ, hạn chế khối u phát triển 1.

Vài nét về nhóm hoạt chất ginsenosid Thành phần chủ yếu trong rễ sâm là saponin triterpen. Khi thuỷ phân các saponin này thu đƣợc 3 loại sapogenin là: acid oleanolic, 20 (s) protopanaxadiol và 20 (s) protopanaxatriol, hai loại sau có cấu trúc damaran. Các Saponin trong Nhân sâm gọi là ginsenosid đƣợc phân loại dựa vào cấu trúc của ba sapogenin trên. Saponin còn gọi là saponosid là một nhóm glycosid gặp rộng rãi trong thực vật, đôi khi trong động vật (Hải sâm, cá sao).

Tuy nhiên Saponin ở Nhân sâm có cấu tạo hoá 7 học khác so với giới thực vật khác, để phân biệt sự khác biệt này ngƣời ta gọi là Ginsenosid là từ ghép của Nhân sâm (ginseng) + glicozit (glycosid). Hầu hết các ginsenosid có cấu trúc dammarane triterpenoid với bộ khung gồm bốn vòng steroid cố định. Nhiều gốc đƣờng khác nhau (ví dụ nhƣ glucose, rhamnose, xylose và arabinose) gắn ở vị trí C-3, C-6 hoặc C-20. Ginsenosid đƣợc đặt tên là 'Rx', với 'R' là viết tắt của gốc và 'x' mô tả mức di động của chúng trên các tấm sắc ký lớp mỏng, tính phân cực giảm từ chỉ số "một" đến "h".Ví dụ, Ra là một hợp chất phân cực ít nhất và Rb phân cực hơn so với Ra.

Độ phân cực của các ginsenosid dẫn đến khả năng phân tách của của các ginsenosid cũng khác nhau đƣợc minh họa trên hình 1. Mức di động của các ginsenosid 'Rx' trên tấm sắc ký lớp mỏng Chất lƣợng và thành phần của ginsenosid trong cây nhân sâm bị ảnh hƣởng bởi các yếu tố nhƣ: loài, tuổi, bộ phận của cây, phƣơng pháp canh tác, mùa thu hoạch và phƣơng pháp bảo quản. Tổng hàm lƣợng Saponin trong nhân sâm là tỷ lệ thuận với độ tuổi của nó, đạt tới mức đỉnh điểm vào khoảng sáu tuổi. Hợp chất Saponin thƣờng đƣợc cấu tạo từ hai phần:  Phần đƣờng : glycol, phổ biến là D-glucose, D-galactose, L-arabinose, acid galactunoic, acid D-glucuronic.

8  Phần phi đƣờng : aglycol ( còn gọi là Sapogenin), là phần chính quyết định hoạt tính của hợp chất Saponin. Phần aglycol của Saponin có trong nhân sâm đƣợc chia thành ba loại: protopanaxadiol, protopanaxatriol và oleanane. Trong đó, protopanaxadiol và protopanaxatriol là những Saponin triterpenoid tetracyclic có cấu trúc dammarane, còn oleanane là Saponin triterpenoide pentacylic. Những hoạt tính sinh học rất đặc biệt của nhân sâm là do những Saponin có cấu trúc dammarane mang lại.

Cấu trúc các Saponin có aglycon là protopanaxadiol đƣợc minh họa trong hình 1.