Xây Dựng Phương Pháp Đo Tương Tác Thụ Thể Và Phối Tử Đặc Hiệu Không Sử Dụng Phóng Xạ

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu hus xây dựng phương pháp đo tương tác thụ thể và phối tử đặc hiệu không sử dụng phóng xạ phục vụ, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất biện

• Tác giả: Nguyễn Anh Lương
• Người hướng dẫn: PGS. Đinh Đoàn Long
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Xây dựng phương pháp đo tương tác thụ thể và phối tử đặc hiệu không dùng đồng vị phóng xạ phục vụ định hướng phát triển thuốc ở Việt Nam
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2011
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Khái quát về lƣợc lý phân tử
• 1.2. Các đích tác dụng của thuốc
• 1.3. Về thụ thể kết cặp G protein (GPCR)
• 1.4. Thụ thể angiotensin II
• 1.5. Các phƣơng pháp nghiên cứu xác định tƣơng tác thụ thể và phối tử
• 1.6. Y học cổ truyền và tài nguyên dƣợc liệu
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
• 2.1. Phƣơng pháp nghiên cứu
• 2.2. Quy trình chiết xuất dịch chiết methanol
• 2.3. Thu thụ thể màng
• 2.4. Xác định nồng độ protein sử dụng phƣơng pháp Bradford
• 2.5. Phƣơng pháp elisa để xác định lƣợng phối tử gắn fluorescein
• 2.6. Quy trình thí nghiệm liên kết (binding assay)
• 2.7. Phản ứng tƣơng tác giữa các phối tử đã biết và dịch chiết với thụ thể đích
• 2.8. Phƣơng pháp xử lý kết quả
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Xác định nồng độ protein thu đƣợc từ gan chuột
• 3.2. Tối ƣu phản ứng ELISA
• 3.3. Tối ƣu nồng độ protein thụ thể trong phản ứng liên kết
• 3.4. Thí nghiệm liên kết thụ thể - phối tử đặc hiệu (thí nghiệm bão hòa)
• 3.5. Phả ứng cạnh tranh của F-AT II với các phối tử đã biết
• 3.6. Nghiên cứu sàng lọc một số dịch chiết thực vật
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN
• KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Phương Pháp Đo Tương Tác Thụ Thể Không Phóng Xạ

Phương pháp đo tương tác thụ thể không phóng xạ đang trở thành một xu hướng quan trọng trong nghiên cứu phát triển thuốc tại Việt Nam. Với sự phát triển của công nghệ và nhu cầu ngày càng cao trong việc tìm kiếm các phương pháp an toàn và hiệu quả, việc áp dụng các phương pháp này giúp giảm thiểu rủi ro liên quan đến việc sử dụng phóng xạ. Nghiên cứu này không chỉ giúp xác định các thụ thể mà còn mở ra hướng đi mới cho việc phát triển thuốc từ các nguồn tài nguyên sinh học phong phú của Việt Nam.

1.1. Khái Niệm Về Tương Tác Thụ Thể Trong Dược Lý

Tương tác thụ thể là quá trình mà các phân tử thuốc gắn vào thụ thể trên bề mặt tế bào, từ đó kích hoạt hoặc ức chế các phản ứng sinh học. Việc hiểu rõ về cơ chế này là rất quan trọng trong việc phát triển thuốc mới, đặc biệt là trong bối cảnh dược lý phân tử.

1.2. Lợi Ích Của Phương Pháp Đo Không Phóng Xạ

Phương pháp đo không phóng xạ mang lại nhiều lợi ích, bao gồm giảm thiểu rủi ro cho người nghiên cứu và môi trường. Ngoài ra, nó còn giúp tăng cường độ chính xác trong việc xác định các tương tác giữa thụ thể và phối tử, từ đó nâng cao hiệu quả trong phát triển thuốc.

II. Thách Thức Trong Nghiên Cứu Phát Triển Thuốc Ở Việt Nam

Việt Nam đang đối mặt với nhiều thách thức trong nghiên cứu phát triển thuốc, đặc biệt là trong việc áp dụng các phương pháp hiện đại. Thiếu trang thiết bị, nguồn nhân lực chất lượng cao và kinh phí nghiên cứu là những vấn đề chính. Hơn nữa, việc thiếu các nghiên cứu cơ bản về dược lý phân tử cũng làm hạn chế khả năng phát triển thuốc mới.

2.1. Thiếu Trang Thiết Bị Nghiên Cứu Hiện Đại

Nhiều phòng thí nghiệm tại Việt Nam chưa được trang bị đầy đủ các thiết bị cần thiết để thực hiện các nghiên cứu phức tạp. Điều này ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng thực hiện các thí nghiệm và nghiên cứu về tương tác thụ thể.

2.2. Nguồn Nhân Lực Chất Lượng Thấp

Việc thiếu hụt nguồn nhân lực có trình độ chuyên môn cao trong lĩnh vực dược lý và nghiên cứu thuốc là một thách thức lớn. Điều này dẫn đến việc khó khăn trong việc thực hiện các nghiên cứu phức tạp và phát triển thuốc mới.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Tương Tác Thụ Thể Không Phóng Xạ

Các phương pháp nghiên cứu tương tác thụ thể không phóng xạ đang được áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu phát triển thuốc. Những phương pháp này bao gồm các kỹ thuật như ELISA, Western blot và các phương pháp sinh học phân tử khác. Những kỹ thuật này không chỉ giúp xác định các thụ thể mà còn cho phép nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động của thuốc.

3.1. Kỹ Thuật ELISA Trong Nghiên Cứu Tương Tác

Kỹ thuật ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) là một trong những phương pháp phổ biến nhất để xác định nồng độ của các phân tử trong mẫu. Phương pháp này cho phép phát hiện và định lượng các thụ thể và phối tử một cách chính xác.

3.2. Phương Pháp Western Blot Để Phân Tích Protein

Western blot là một kỹ thuật quan trọng trong việc xác định và phân tích các protein trong mẫu. Phương pháp này giúp xác định sự hiện diện và nồng độ của các thụ thể trong các mẫu sinh học, từ đó cung cấp thông tin quan trọng cho nghiên cứu phát triển thuốc.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Phương Pháp Đo Tương Tác

Việc áp dụng các phương pháp đo tương tác thụ thể không phóng xạ đã mang lại nhiều kết quả tích cực trong nghiên cứu phát triển thuốc tại Việt Nam. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc sử dụng các phương pháp này giúp phát hiện các hợp chất có hoạt tính sinh học từ các nguồn tài nguyên thiên nhiên, đặc biệt là từ các cây thuốc truyền thống.

4.1. Nghiên Cứu Các Hợp Chất Từ Cây Thuốc

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các hợp chất chiết xuất từ cây thuốc có thể có tác dụng điều trị hiệu quả. Việc áp dụng các phương pháp đo không phóng xạ giúp xác định các hợp chất này một cách chính xác và nhanh chóng.

4.2. Kết Quả Nghiên Cứu Về Thụ Thể Angiotensin II

Nghiên cứu về thụ thể angiotensin II đã cho thấy nhiều tiềm năng trong việc phát triển thuốc điều trị huyết áp. Các kết quả cho thấy rằng việc sử dụng các phương pháp không phóng xạ giúp xác định các tương tác một cách hiệu quả.

V. Kết Luận Về Tương Lai Của Phát Triển Thuốc Ở Việt Nam

Tương lai của phát triển thuốc ở Việt Nam phụ thuộc vào việc áp dụng các phương pháp nghiên cứu hiện đại và hiệu quả. Việc phát triển các phương pháp đo tương tác thụ thể không phóng xạ sẽ mở ra nhiều cơ hội mới cho nghiên cứu và phát triển thuốc, đồng thời giúp nâng cao chất lượng cuộc sống cho người dân.

5.1. Hướng Đi Mới Trong Nghiên Cứu Dược Lý

Việc áp dụng các phương pháp nghiên cứu hiện đại sẽ giúp nâng cao chất lượng nghiên cứu dược lý tại Việt Nam. Điều này không chỉ giúp phát hiện thuốc mới mà còn cải thiện quy trình phát triển thuốc.

5.2. Tăng Cường Hợp Tác Quốc Tế Trong Nghiên Cứu

Hợp tác quốc tế trong nghiên cứu phát triển thuốc sẽ giúp Việt Nam tiếp cận với các công nghệ và phương pháp mới. Điều này sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho việc phát triển thuốc và nâng cao năng lực nghiên cứu trong nước.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Việt Nam là một trong những nước có nguồn tài nguyên sinh vật đa dạng và phong phú trên thế giới với hơn 13.200 loài thực vật và khoảng 10.000 loài động vật đã được xác định, với nhiều nhóm loài sinh vật có tính tính đặc hữu cao, có giá trị khoa học và thực tiễn lớn. Xuất phát từ nền văn hóa đa dạng bản sắc với rất nhiều dân tộc sống trải dài trên khắp lãnh thổ với các điều kiện tự nhiên và lịch sử riêng đã hình thành nên một nền Y học cổ truyền với lịch sử lâu đời hàng nghìn năm, với rất nhiều kinh nghiệm trong sử dụng thuốc trong đời sống. Việc dùng thuốc trong nhân dân đã có từ rất lâu đời, tích lũy dưới dạng kinh nghiệm, thường chỉ được truyền miệng qua nhiều thế hệ. Hơn 3800 bài thuốc đã được sưu tầm lại, cùng với hàng nghìn bài thuốc lưu truyền trong dân gian, đặc biệt là trong cộng đồng các dân tộc thiểu số.

Tuy nhiên, rất nhiều các bài thuốc và các nguyên liệu làm thuốc như vậy vẫn chưa được nghiên cứu cơ chế tác động cũng như cơ sở khoa học vẫn chưa được xác định. Có nhiều phương pháp nghiên cứu sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học trong phát triển thuốc trên thế giới, trong đó phổ biến là phương pháp sử dụng đồng vị phóng xạ (như 3H, 125I) để nghiên cứu trên các đích phân tử của thuốc. Tuy nhiên, những phương pháp này chưa được áp dụng trong điều kiện Việt Nam với nguyên nhân chính là hầu hết các phòng thí nghiệm sinh dược học của ta thiếu trang thiết bị nghiên cứu, bảo quản và loại thải các chất phóng xạ. Vì vậy lý do đó, chúng tôi tiến hành đề tài “Xây dựng phƣơng pháp đo tƣơng tác thụ thể và phối tử đặc hiệu không dùng đồng vị phóng xạ phục vụ định hƣớng phát triển thuốc ở Việt Nam” nhằm tiến tới ứng dụng mô hình này nhằm sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học trên đích phân tử có nguồn gốc từ các cây thuốc, bài thuốc được sử dụng hiệu quả trong y học cổ truyền với các tác dụng chữa bệnh tương ứng.

LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Trong Luận văn này, chúng tôi tập trung vào đích phân tử là thụ thể angiotensin II, đây là đích tác dụng đã được biết của nhiều thuốc có tác dụng hạ huyết áp với cơ chế phân tử đã được nghiên cứu tương đối rõ, đồng thời bước đầu tiến hành thử nghiệm với một số dịch chiết từ một số cây thuốc Việt Nam đã được biết trong y học cổ truyền với tác dụng trong điều hòa huyết áp và điều trị các chứng bệnh liên quan đến tim, mạch và hệ tuần hoàn. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Khái quát về dƣợc lý phân tử Dược lý phân tử (molecular pharmacology) là môn khoa học nghiên cứu về tương tác của thuốc lên cơ thể sống ở cấp độ phân tử và tế bào, và gồm hai phân môn chính là dược động học (pharmacokinetics) và dược lực học (pharmacodynamics).

Dược lý phân tử bao gồm nhiều lĩnh vực nghiên cứu về tác dụng của phân tử thuốc đến toàn bộ cơ thể. Dựa vào những hiểu biết về hóa sinh, sinh lý, bệnh học, sinh học phân tử và hóa hữu cơ để thấy rõ tác dụng của thuốc ở mức độ phân tử đưa đến áp dụng trong điều trị. Qua dược lý phân tử, chúng ta có thể hiểu sâu sắc cơ chế phân tử tác dụng của thuốc, phát hiện thuốc mới, đề xuất những hướng dẫn sử dụng thuốc an toàn, hiệu quả trong điều trị hoặc ngăn chặn những phản ứng có hại của thuốc khi sử dụng. Nội dung chủ yếu của dược lý phân tử là dược lý học về tác dụng của thuốc ở mức dưới tế bào [2].

Dược lý phân tử thể hiện ở nhiều giai đoạn của phân tử thuốc trong cơ thể, hiện nay dược lý phân tử được nghiên cứu với các hướng chính đó là: 1) Nghiên cứu tác dụng thuốc lên màng tế bào 2) Nghiên cứu hóa sinh dược lý phân tử đối với thụ thể màng tế bào 3) Nghiên cứu hóa sinh dược lý phân tử đối với enzym tế bào 4) Nghiên cứu hóa sinh dược lý phân tử trên gen 1. Các đích tác dụng của thuốc Theo phân tích của Overington và cộng sự [38] hơn 21.000 sản phẩm thuốc lưu hành trên thị trường Mỹ, có nguồn gốc từ 1357 thuốc dưới các dạng thành phần, các dạng muối, vitamin. Trong đó có 1204 các thuốc phân tử nhỏ, và 166 thuốc sinh học. Khoảng 27% các thuốc này liên quan tới thụ thể kết cặp G protein, 13% tới thụ thể nhân, 7,9% tới các thụ thể liên kết với kênh ion (hình 1.

3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Các thụ thể GPCR Các thụ thể nhân Các kênh ion liên kết phối tử Các kênh ion điện thế Protein liên kết penicillin Enzyme giống như myeloperoxidase Protein vận chuyển chất dẫn truyền thần kinh DNA topoisomerase typ II Fibronectin typ III Cytochrome P450 Hình 1. Phân bố các họ gen với đích tác dụng của các thuốc hiện nay. Hầu hết các thuốc tác dụng lên cơ thể, tế bào thông qua một số cơ chế phân tử khác nhau. Mỗi cơ chế được thích ứng thông qua sự tiến hóa của các họ protein riêng, giúp truyền được nhiều loại tín hiệu.

Các họ protein này bao gồm các thụ thể trên bề mặt và bên trong tế bào cùng với các enzym và thành phần khác giúp tạo ra, khuếch đại, phối hợp và kết thúc các tín hiệu từ phân tử tác động là thuốc và các chất nội sinh. Có 5 cơ chế truyền tín hiệu qua màng tế bào cơ bản (hình 1. Mỗi loại sử dụng một chiến lược khác nhau để vượt qua các rào cản là lớp kép phospholipid của màng tế bào. Các chiến lược được sử dụng là (1) phối tử (ligand) tan trong lipid vượt qua màng sinh chất và tác động lên một thụ thể nội bào; (2) protein thụ thể xuyên màng có hoạt tính enzym nội bào được điều khiển dị lập thể bởi một phối tử liên kết vào một vị trí trên miền ngoại bào của protein này; (3) thụ thể xuyên màng liên kết và kích thích một protein kinase; (4) kênh ion liên kết với tương tác với phối tử ( điều khiển hoạt động của kênh bằng liên kết với phối tử); hoặc (5) protein 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] thụ thể xuyên màng kích thích G protein, từ đó điều khiển một chất truyền tin thứ 2 trong tế bào.

Các cơ chế truyền tín hiệu cơ bản. Cơ chế thứ nhất (1) Một phân tử tín hiệu (phối tử) hóa học hòa tan trong lipid đi qua màng sinh chất và tác động lên các thụ thể nội bào (mà có thể là một enzym hoặc một yếu tố điều hòa sự phiên mã của gen). (2) Phân tử tín hiệu liên kết với miền ngoại bào của một protein xuyên màng, qua đó kích hoạt hoạt tính enzym của miền nội bào của protein này. (3) Phân tử tín hiệu liên kết với miền ngoại bào của một thụ thể liên kết xuyên màng với một protein kinase, làm kích hoạt protein kinase này.

(4) Phân tử tín hiệu liên kết và trực tiếp điều khiển việc mở một kênh ion. (5) phân tử tín hiệu liên kết với một thụ thể bề mặt tế bào mà liên kết với một enzym tác động bởi một G protein. Thụ thể kết cặp G protein (GPCR) Hơn 26% các thuốc được bán trên thị trường có liên quan tới nhóm thụ thể này; đây là nhóm thụ thể phổ biến được biểu hiện trên bề mặt của nhiều loại tế bào. Protein liên kết vào màng tế bào thông qua 7 lần xuyên màng, do đó còn được gọi với tên khác là thụ thể 7 lần xuyên màng (hay 7TM).

Các G protein là các phân tử kết cặp với loại thụ thể này để truyền tín hiệu được sinh ra sau khi phối tử (hay chất gắn đặc hiệu) liên kết vào thụ thể rồi truyền tín hiệu vào trong tế bào. Hệ gen người có hơn 1000 gen mã hóa cho các GPCR, trong đó ước tính có khoảng 400 GPCR có 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] tiềm năng là các đích tác dụng của các loại thuốc. Các nghiên cứu về vai trò, chức năng của các thụ thể GPCR vẫn đang tiếp tục được triển khai và phát triển. Các thụ thể nhân (NR) Các thụ thể này liên kết với các phối tử bên trong tế bào và về số lượng có lẽ ít hơn nhiều so với các thụ thể trên màng tế bào.

Sau khi phối tử liên kết, một phức hợp được hình thành giữa thụ thể và phối tử đi vào trong nhân tế bào để “đóng” hoặc “mở” các gen đặc trưng. Các thụ thể nhân liên kết với các phân tử ưa lipid như các dẫn xuất của steroid, retinoid (như các hoocmon giới tính và vitamin A) có ảnh hưởng sâu sắc tới sinh lý con người. Hệ gen người mã hóa cho khoảng 50 thụ thể nhân, một nửa số đó là các thụ thể độc thân (orphan receptor), nghĩa là các thụ thể chưa xác định được phối tử đặc hiệu. Thụ thể cytokine Một họ các protein có nhiều hơn 1 chuỗi protein được nhúng vào màng tế bào.

Các phối tử cytokine là các protein như interleukin, interferon và các yếu tố tăng trưởng. Vì các phân tử nhỏ không thể phá vỡ liên kết của cytokine liên kết với thụ thể của nó, nên các thuốc được sử dụng thường là các protein lớn hơn. Đó là các kháng thể hoặc các dạng tái tổ hợp của thụ thể mà hoạt động như những cái bẫy để ngăn cản sự liên kết của phối tử vào thụ thể. Các protease Đó là những enzym cắt protein ở những điểm xác định bởi các trình tự axit amin đặc hiệu.

Các protease có nhiều vai trò trong cơ thể, như tham gia phản ứng đông máu, sản xuất các hoocmon peptit và cần cho chu kỳ sống của các virut như HIV. Mặc dù các thuốc ức chế protease hiện vẫn là một thách thức lớn trong nghiên cứu thuốc, nhưng đã có một số thuốc đã được thương mại hóa có đích tác dụng là lớp enzym này. Các protein kinase 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Đây là một họ enzym lớn giúp gắn nhóm photphat (-PO3) vào một phân tử protein để họa hóa nó trong tế bào. Quá trình photphoryl hóa được dùng để chuyển tín hiệu từ ngoài tế bào qua các thụ thể trên màng để đi vào nhân tế bào, ở đó chúng khởi động sự biểu hiện của gen.