Luận văn thạc sĩ sinh học phân tích biểu hiện một số gen liên quan đến con đường sinh tổng hợp ginsenoside ở sâm ngọc linh panax vietnamensis ha et grushv

Luận văn thạc sĩ sinh học phân tích biểu hiện gen liên quan đến con đường sinh tổng hợp ginsenoside ở sâm Ngọc Linh Panax vietnamensis.

• Tác giả: Vũ Thị Trinh
• Người hướng dẫn: PGS. Lê Thị Thu Hiền
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Phân tích biểu hiện một số gen liên quan đến con đường sinh tổng hợp ginsenoside ở sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. CHI NHÂN SÂM VÀ SÂM NGỌC LINH
• 1.2. NGHIÊN CỨU GIẢI TRÌNH TỰ HỆ GEN Ở CÁC LOÀI THUỘC CHI PANAX
• 1.3. NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN CỦA CÁC GEN CHỨC NĂNG Ở CÁC LOÀI THUỘC CHI PANAX
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
• 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.2.1. Tách chiết và kiểm tra chất lượng RNA tổng số
• 2.2.2. Tổng hợp cDNA
• 2.2.3. Xây dựng dữ liệu các gen liên quan đến con đường sinh tổng hợp ginsenoside
• 2.2.4. Thiết kế các cặp mồi
• 2.2.5. Nhân gen quan tâm sử dụng phương pháp reverse transcription PCR
• 2.2.6. Xác định trình tự gen quan tâm sử dụng phương pháp Sanger
• 2.2.7. Nghiên cứu biểu hiện một số gen chức năng bằng realtime PCR
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH, KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG, ĐỊNH LƯỢNG RNA TỔNG SỐ TỪ MÔ LÁ, THÂN RỄ SÂM NGỌC LINH
• 3.2. KẾT QUẢ XÂY DỰNG CON ĐƯỜNG SINH TỔNG HỢP GINSENOSIDE GIẢ ĐỊNH Ở SÂM NGỌC LINH
• 3.2.1. Thống kê sơ bộ số lượng unigene gắn với mỗi gen
• 3.2.2. Thống kê dữ liệu các unigene cụ thể
• 3.3. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH BIỂU HIỆN CÁC GEN LIÊN QUAN ĐẾN CON ĐƯỜNG SINH TỔNG HỢP GINSENOSIDE Ở MẪU LÁ SÂM NGỌC LINH 1 VÀ 4 NĂM TUỔI
• 3.4. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH BIỂU HIỆN CÁC GEN LIÊN QUAN ĐẾN CON ĐƯỜNG SINH TỔNG HỢP GINSENOSIDE Ở MẪU THÂN RỄ SÂM NGỌC LINH 1 VÀ 4 NĂM TUỔI
• 3.5. KẾT QUẢ SO SÁNH MỨC BIỂU HIỆN CỦA CÁC GEN LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP GINSENOSIDE GIỮA MÔ LÁ VÀ THÂN RỄ SÂM NGỌC LINH Ở HAI ĐỘ TUỔI
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Biểu hiện gen và sinh tổng hợp ginsenoside

Nghiên cứu tập trung vào biểu hiện gen liên quan đến sinh tổng hợp ginsenoside ở sâm Ngọc Linh (Panax Vietnamensis). Các gen chính tham gia vào quá trình này được xác định thông qua phân tích dữ liệu hệ gen phiên mã. Kết quả cho thấy sự biểu hiện khác biệt của các gen này ở mô lá và thân rễ, đặc biệt ở cây 1 và 4 năm tuổi. Sinh học phân tử và công nghệ sinh học được áp dụng để hiểu rõ cơ chế điều hòa gen trong quá trình tổng hợp các hợp chất tự nhiên có giá trị dược liệu.

1.1. Phân tích gen liên quan

Phương pháp phân tích gen bao gồm tách chiết RNA, tổng hợp cDNA và sử dụng real-time PCR để đánh giá mức độ biểu hiện của các gen. Các gen như HMGR, FPS, SS, và SQE được xác định là có vai trò quan trọng trong con đường sinh tổng hợp ginsenoside. Kết quả cho thấy sự biểu hiện cao hơn ở thân rễ so với lá, đặc biệt ở cây 4 năm tuổi, phản ánh sự tích lũy ginsenoside theo tuổi cây.

1.2. Con đường sinh tổng hợp

Con đường sinh tổng hợp ginsenoside được chia thành hai giai đoạn chính: (1) chuyển hóa acetyl-CoA thành IPP và DMAPP thông qua con đường mevalonate, và (2) hình thành các ginsenoside thông qua các phản ứng vòng hóa và glycosyl hóa. Các enzyme như CYP450 và UGT đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra các hợp chất ginsenoside hoàn chỉnh.

II. Sâm Ngọc Linh và giá trị dược liệu

Sâm Ngọc Linh là loài dược liệu quý hiếm, chứa hàm lượng cao các hợp chất ginsenoside với nhiều tác dụng sinh học như chống oxy hóa, tăng cường miễn dịch và hỗ trợ thần kinh. Nghiên cứu này cung cấp cơ sở khoa học để đánh giá vai trò của yếu tố di truyền trong việc điều hòa quá trình tổng hợp các hợp chất này.

2.1. Thành phần hóa học

Sâm Ngọc Linh chứa hơn 52 loại saponin, trong đó majonoside-R2 là hợp chất chính chiếm khoảng 5.3% khối lượng dược liệu khô. Ngoài ra, cây còn chứa 18 loại amino acid và 20 nguyên tố vi lượng, đặc biệt là Arginin và các khoáng chất như K, Na, Mg, Fe.

2.2. Ứng dụng dược liệu

Các hợp chất ginsenoside trong sâm Ngọc Linh có tính chất dược lý đa dạng, bao gồm khả năng chống stress, chống trầm cảm và tăng cường sức khỏe. Nghiên cứu này góp phần vào việc bảo tồn và phát triển bền vững loài dược liệu quý hiếm này.

III. Phương pháp nghiên cứu và kết quả

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp sinh học phân tử như tách chiết RNA, tổng hợp cDNA và real-time PCR để phân tích biểu hiện gen. Kết quả cho thấy sự khác biệt đáng kể trong mức độ biểu hiện của các gen liên quan đến sinh tổng hợp ginsenoside giữa mô lá và thân rễ, cũng như giữa cây 1 và 4 năm tuổi.

3.1. Tách chiết và phân tích RNA

RNA tổng số được tách chiết từ mô lá và thân rễ, sau đó kiểm tra chất lượng và định lượng. Kết quả cho thấy RNA đạt độ tinh khiết cao (A260/A280 > 1.8), đảm bảo độ chính xác trong các bước phân tích tiếp theo.

3.2. Đánh giá biểu hiện gen

Sử dụng real-time PCR, nghiên cứu đánh giá mức độ biểu hiện của các gen như HMGR, FPS, SS, và SQE. Kết quả cho thấy sự biểu hiện cao hơn ở thân rễ so với lá, đặc biệt ở cây 4 năm tuổi, phù hợp với sự tích lũy ginsenoside theo tuổi cây.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) là một loài dược liệu quý hiếm, đặc hữu của Việt Nam, nổi bật với hàm lượng saponin khung dammaran cao nhất trong chi Panax, đạt khoảng 12-15%. Loài này chứa đến 52 loại saponin, 18 amino acid và 20 nguyên tố vi lượng, góp phần tạo nên nhiều công dụng sinh học như chống stress, chống oxy hóa, tăng cường miễn dịch và phục hồi sức khỏe. Tuy nhiên, từ những năm 1990, sâm Ngọc Linh đã bị khai thác quá mức, dẫn đến nguy cơ tuyệt chủng và được xếp vào nhóm “Cực kỳ nguy cấp” theo Danh lục Đỏ của IUCN. Trước thực trạng này, Việt Nam đã triển khai nhiều chính sách bảo tồn và phát triển bền vững loài cây quý này.

Nghiên cứu tập trung phân tích biểu hiện một số gen liên quan đến con đường sinh tổng hợp ginsenoside – nhóm hợp chất chính quyết định giá trị dược liệu của sâm Ngọc Linh. Mục tiêu chính là xác định các gen tham gia con đường sinh tổng hợp ginsenoside và đánh giá mức độ biểu hiện của các gen này ở mô lá và thân rễ của cây sâm 1 năm tuổi và 4 năm tuổi. Nghiên cứu được thực hiện tại các trung tâm phát triển sâm Ngọc Linh ở Quảng Nam, sử dụng dữ liệu hệ gen phiên mã thu thập từ các mẫu lá và thân rễ. Kết quả nghiên cứu không chỉ góp phần làm sáng tỏ cơ chế sinh tổng hợp ginsenoside ở sâm Ngọc Linh mà còn hỗ trợ công tác bảo tồn, chọn tạo giống và phát triển sản phẩm dược liệu chất lượng cao.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sinh học phân tử về con đường sinh tổng hợp ginsenoside trong chi Panax. Hai con đường chính được xem xét là con đường mevalonate (MVA) và con đường methylerythritol phosphate (MEP), trong đó con đường MVA được coi là chủ yếu trong tổng hợp ginsenoside ở sâm Ngọc Linh. Các khái niệm chính bao gồm:

• Ginsenoside: Hợp chất triterpene saponin có cấu trúc phức tạp, gồm hai nhóm chính là dammarane và oleanane ginsenoside.
• Enzyme chính trong con đường MVA: Acetyl-CoA acetyltransferase (AACT), Isopentenyl diphosphate isomerase (IDI), Squalene synthase (SS), Squalene epoxidase (SE).
• Biểu hiện gen: Đánh giá mức độ phiên mã của các gen liên quan đến sinh tổng hợp ginsenoside bằng kỹ thuật real-time PCR.
• Transcriptome: Dữ liệu hệ gen phiên mã được sử dụng để xác định và chú giải các unigene liên quan đến con đường sinh tổng hợp ginsenoside.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng 12 mẫu sâm Ngọc Linh, gồm 3 mẫu thân rễ và 3 mẫu lá ở hai độ tuổi 1 năm và 4 năm, thu thập tại Trại sâm gốc Tắk Ngo và Trạm Dược liệu Trà Linh, Quảng Nam. Mẫu được bảo quản lạnh ở -80ºC để đảm bảo chất lượng RNA.

Quy trình nghiên cứu bao gồm:

• Tách chiết RNA tổng số từ mô lá và thân rễ theo phương pháp biến tính guanidinium thiocyanate, kiểm tra chất lượng bằng điện di gel agarose và máy quang phổ Biospectrometer. Nồng độ RNA thu được dao động từ khoảng 30 đến 100 ng/µl với độ tinh sạch A260/A280 từ 1,90 đến 2,15.
• Tổng hợp cDNA từ RNA bằng bộ kit SensiFAST cDNA Synthesis Kit.
• Xây dựng dữ liệu gen liên quan đến con đường sinh tổng hợp ginsenoside dựa trên phân tích dữ liệu hệ gen phiên mã, sử dụng các cơ sở dữ liệu GO, KEGG, UniProt, Pfam để chú giải chức năng.
• Thiết kế cặp mồi PCR đặc hiệu cho 4 gen chính (AACT, IDI, SS, SE) dựa trên dữ liệu transcriptome và GenBank.
• Nhân bản và xác định trình tự gen bằng phương pháp RT-PCR và giải trình tự Sanger trên hệ thống ABI 3500 Genetic Analyzer.
• Phân tích biểu hiện gen bằng kỹ thuật real-time PCR với SYBR Green, sử dụng gen EF-1 làm đối chứng nội, đánh giá mức độ biểu hiện theo phương pháp 2^-ΔΔCt, phân tích thống kê bằng kiểm định t-test với mức ý nghĩa p < 0,05.

Thời gian nghiên cứu kéo dài trong năm 2023, với các bước thu thập mẫu, tách chiết RNA, tổng hợp cDNA, nhân bản gen, giải trình tự và phân tích biểu hiện được thực hiện tuần tự.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Xây dựng con đường sinh tổng hợp ginsenoside giả định: Dựa trên dữ liệu transcriptome, đã xác định được số lượng unigene liên quan đến các gen trong con đường MVA, gồm 4 unigene cho AACT, 2 unigene cho IDI, 4 unigene cho SS và 6 unigene cho SE. Mô hình con đường sinh tổng hợp ginsenoside ở sâm Ngọc Linh tương đồng cao với các loài Panax khác.

2. Nhân bản và xác định trình tự gen: Bốn gen AACT, IDI, SS và SE đã được nhân bản thành công và xác định trình tự cDNA. Trình tự gen có độ tương đồng từ 96% đến 99% so với các trình tự tham chiếu của các loài Panax khác, khẳng định tính đặc hiệu và độ chính xác của dữ liệu.

3. Biểu hiện gen ở mô lá: Ở sâm 1 năm tuổi, gen IDI có mức biểu hiện cao nhất, tiếp theo là SS, SE và AACT thấp nhất. Ở sâm 4 năm tuổi, các gen SE, SS, IDI biểu hiện cao hơn, trong khi AACT biểu hiện thấp. Mức biểu hiện gen SS ở lá 4 tuổi tăng gấp khoảng 2 lần so với lá 1 tuổi, gen SE tăng đáng kể (p < 0,05).

4. Biểu hiện gen ở mô thân rễ: Ở sâm 1 năm tuổi, gen IDI biểu hiện cao nhất, SS trung bình, AACT và SE thấp. Ở sâm 4 năm tuổi, gen SE tăng biểu hiện gấp 6 lần, IDI tăng gấp 2 lần so với 1 năm tuổi (p < 0,05). Các gen AACT và SS tăng không đáng kể.

5. So sánh biểu hiện gen giữa mô lá và thân rễ: Ở cả hai độ tuổi, gen AACT và IDI có mức biểu hiện cao hơn ở thân rễ so với lá, trong khi gen SS và SE biểu hiện cao hơn ở lá. Ở sâm 1 năm tuổi, gen AACT biểu hiện ở thân rễ cao hơn lá khoảng 5 lần. Sự khác biệt này phản ánh sự phân bố và tổng hợp ginsenoside khác nhau giữa các mô.

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy con đường sinh tổng hợp ginsenoside ở sâm Ngọc Linh chủ yếu dựa trên con đường MVA, tương tự các loài Panax khác. Mức độ biểu hiện gen tăng theo tuổi cây, đặc biệt gen SE và IDI, phù hợp với các nghiên cứu trước đây trên P. notoginseng và P. ginseng, cho thấy sự phát triển của cây thúc đẩy tổng hợp ginsenoside.

Sự khác biệt biểu hiện gen giữa mô lá và thân rễ phản ánh chức năng sinh học khác nhau của các mô trong tổng hợp và tích lũy ginsenoside. Mức biểu hiện cao của gen AACT và IDI ở thân rễ cho thấy thân rễ là nơi tổng hợp chính các tiền chất, trong khi gen SS và SE biểu hiện cao ở lá có thể liên quan đến các bước chuyển hóa tiếp theo.

Dữ liệu biểu hiện gen được trình bày qua biểu đồ cột so sánh mức độ biểu hiện tương đối, với các thanh biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, giúp minh họa rõ ràng sự khác biệt giữa các mẫu và độ tuổi. Kết quả này góp phần làm rõ cơ chế phân tử của quá trình sinh tổng hợp ginsenoside, hỗ trợ phát triển các kỹ thuật chọn tạo giống và tăng cường hàm lượng hoạt chất trong sâm Ngọc Linh.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Mở rộng nghiên cứu toàn diện về hệ gen và transcriptome: Tiếp tục xây dựng cơ sở dữ liệu gen toàn diện của sâm Ngọc Linh, bao gồm các gen chức năng liên quan đến sinh tổng hợp ginsenoside và các tính trạng quan trọng khác, nhằm phục vụ công tác bảo tồn và chọn tạo giống. Thời gian thực hiện trong 3-5 năm, do Viện Nghiên cứu hệ gen chủ trì.

2. Phát triển kỹ thuật đánh giá biểu hiện gen và phân tích thành phần ginsenoside: Áp dụng kỹ thuật real-time PCR kết hợp với phân tích hóa học định lượng ginsenoside để đánh giá mối liên hệ giữa biểu hiện gen và hàm lượng hoạt chất, nhằm tối ưu hóa quy trình nhân giống và canh tác. Thời gian 2-3 năm, phối hợp giữa viện nghiên cứu và các trung tâm dược liệu.

3. Xây dựng quy trình nhân giống chọn lọc dựa trên chỉ thị phân tử: Sử dụng các gen liên quan đến sinh tổng hợp ginsenoside làm chỉ thị phân tử để chọn lọc các dòng sâm có hàm lượng ginsenoside cao, nâng cao chất lượng sản phẩm. Thời gian 3 năm, do các trung tâm giống cây trồng thực hiện.

4. Tăng cường công tác bảo tồn và phát triển bền vững nguồn gen sâm Ngọc Linh: Áp dụng các biện pháp bảo tồn tại chỗ và nhân giống nhân tạo, kết hợp nghiên cứu đa dạng di truyền để duy trì nguồn gen quý hiếm, tránh nguy cơ tuyệt chủng. Thời gian liên tục, phối hợp giữa các cơ quan quản lý và viện nghiên cứu.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu sinh học phân tử và dược liệu: Có thể sử dụng dữ liệu gen và biểu hiện gen để phát triển các nghiên cứu sâu hơn về cơ chế sinh tổng hợp hoạt chất và ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo giống.

2. Chuyên gia phát triển sản phẩm dược liệu: Tham khảo để hiểu rõ cơ sở sinh học của hoạt chất ginsenoside, từ đó tối ưu hóa quy trình chiết xuất, chế biến và nâng cao chất lượng sản phẩm.

3. Cơ quan quản lý và bảo tồn nguồn gen: Sử dụng kết quả nghiên cứu để xây dựng chính sách bảo tồn, quản lý khai thác hợp lý và phát triển bền vững nguồn gen sâm Ngọc Linh.

4. Doanh nghiệp trồng trọt và sản xuất sâm: Áp dụng các chỉ thị phân tử và kiến thức về biểu hiện gen để chọn giống, cải thiện kỹ thuật canh tác, nâng cao năng suất và chất lượng sâm.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao nghiên cứu tập trung vào 4 gen AACT, IDI, SS và SE?
   Bởi đây là các gen chủ chốt trong con đường mevalonate, đóng vai trò quan trọng trong tổng hợp tiền chất và các bước đầu của quá trình sinh tổng hợp ginsenoside, ảnh hưởng trực tiếp đến hàm lượng hoạt chất.

2. Mức độ biểu hiện gen có liên quan thế nào đến hàm lượng ginsenoside?
   Mức độ biểu hiện gen cao thường tương ứng với hoạt động enzyme mạnh, thúc đẩy tổng hợp ginsenoside nhiều hơn. Ví dụ, gen SE biểu hiện tăng gấp 6 lần ở thân rễ sâm 4 năm tuổi, phù hợp với sự tích lũy ginsenoside cao hơn.

3. Tại sao có sự khác biệt biểu hiện gen giữa mô lá và thân rễ?
   Mỗi mô có chức năng sinh học khác nhau; thân rễ là nơi tích lũy chính ginsenoside, trong khi lá có thể tham gia các bước chuyển hóa hoặc điều hòa sinh tổng hợp, dẫn đến sự khác biệt biểu hiện gen.

4. Phương pháp real-time PCR có ưu điểm gì trong nghiên cứu này?
   Real-time PCR có độ nhạy cao, đặc hiệu và khả năng định lượng chính xác mức độ biểu hiện gen, giúp đánh giá sự khác biệt biểu hiện giữa các mẫu và điều kiện khác nhau một cách tin cậy.

5. Nghiên cứu này có thể ứng dụng như thế nào trong chọn tạo giống sâm?
   Các gen liên quan đến sinh tổng hợp ginsenoside có thể làm chỉ thị phân tử để chọn lọc các dòng sâm có biểu hiện gen cao, từ đó phát triển giống có hàm lượng hoạt chất tốt hơn, nâng cao giá trị kinh tế và dược liệu.

Kết luận

• Đã xác định và xây dựng mô hình con đường sinh tổng hợp ginsenoside giả định ở sâm Ngọc Linh dựa trên dữ liệu hệ gen phiên mã.
• Bốn gen chủ chốt AACT, IDI, SS và SE đã được nhân bản, xác định trình tự và đánh giá biểu hiện ở mô lá và thân rễ của sâm 1 năm và 4 năm tuổi.
• Mức độ biểu hiện gen khác biệt rõ rệt giữa các mô và độ tuổi, với gen SE và IDI tăng biểu hiện đáng kể ở cây 4 năm tuổi.
• Kết quả cung cấp cơ sở khoa học quan trọng cho nghiên cứu cơ chế phân tử và ứng dụng công nghệ sinh học trong bảo tồn, chọn tạo giống sâm Ngọc Linh.
• Đề xuất mở rộng nghiên cứu toàn diện về hệ gen và phát triển kỹ thuật chọn giống dựa trên chỉ thị phân tử nhằm nâng cao chất lượng và giá trị dược liệu.

Khuyến khích các viện nghiên cứu và doanh nghiệp phối hợp triển khai các đề tài mở rộng, ứng dụng kết quả nghiên cứu vào thực tiễn sản xuất và bảo tồn nguồn gen quý hiếm này.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Sâm Ngọc Linh là loài dƣợc liệu quý thuộc chi Nhân sâm (Panax L.) có hàm lƣợng saponin khung dammaran cao nhất (khoảng 12-15%) và hàm lƣợng triterpene nhiều nhất so với các loài khác thuộc chi Panax trên thế giới. Sâm Ngọc Linh có đến 52 loại saponin, 18 amino acid, 20 chất khoáng vi lƣợng, 0,1% tinh dầu. Sâm Ngọc Linh có nhiều công dụng đặc biệt nhƣ chống stress, chống trầm cảm, giảm lo âu, chống oxy hóa, kích thích hệ miễn dịch, tăng khả năng hồi phục máu, tăng khả năng vận động, chống suy nhƣợc cơ thể [1-2]. Từ năm 1985 đến nay, đã có nhiều công trình nghiên cứu công bố về hóa học, hoạt tính sinh học và cấu trúc hóa học của các hợp chất tiêu biểu phân lập từ sâm Ngọc Linh [3-7].

Những kết quả nghiên cứu này kh ng định giá trị rất quý của sâm Ngọc Linh so với các loại nhân sâm khác trên thị trƣờng. Từ những năm 1990, sâm Ngọc Linh trong tự nhiên hầu nhƣ đã bị khai thác cạn kiệt và có nguy cơ tuyệt chủng, trở thành một loài thực vật có tên trong sách đỏ Việt Nam [5]. Theo tiêu chuẩn phân hạng trong Danh lục Đỏ của IUCN (1994 và 2001), sâm Ngọc Linh ở trong tình trạng “Cực kỳ nguy cấp”. Trƣớc tình hình đó, Việt Nam đã có những chủ trƣơng, chính sách đúng đắn nhằm khôi phục, bảo tồn và phát triển cây sâm Ngọc Linh.

Nhiều công trình nghiên cứu nhằm điều tra, phân loại, xác định vùng phân bố, nghiên cứu thành phần hóa học và dƣợc tính, đánh giá đa dạng di truyền, tìm kiếm mã vạch DNA, xây dựng mối quan hệ phát sinh chủng loại, bảo tồn, nhân giống, sản xuất giá thể, kỹ thuật canh tác, gieo trồng, bảo vệ thực vật, chế biến, bảo quản sâm Ngọc Linh đã và đang đƣợc thực hiện. So với các loài khác trong chi Nhân sâm, các nghiên cứu ở mức độ phân tử và in silico liên quan đến hệ gen phiên mã cũng nhƣ các gen liên quan đến sinh tổng hợp ginsenoside vẫn còn rất ít. Trong nghiên cứu này dữ liệu hệ gen phiên mã của sâm Ngọc Linh đƣợc phân tích và trên cơ sở các thông tin thu đƣợc, phƣơng pháp real time PCR đƣợc sử dụng để đánh giá mức độ biểu hiện của các gen quan tâm có liên quan đến quá trình sinh tổng hợp ginsenoside ở lá và thân rễ của cây sâm Ngọc Linh. Kết quả góp phần cung cấp cơ sở khoa học đánh giá vai trò của yếu tố di truyền đến sự sinh tổng hợp ginsenoside ở cây sâm Ngọc Linh.

Nghiên cứu “Phân tích biểu hiện một số gen liên quan đến con đƣờng sinh Vietnam Academy of Science and Technology 2 tổng hợp ginsenoside ở sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ’’ đã đƣợc thực hiện với mục tiêu và những nội dung cụ thể nhƣ sau: 1. MỤC TIÊU: Đề tài đặt mục tiêu xác định đƣợc các gen chính tham gia vào con đƣờng sinh tổng hợp ginsenoside ở sâm Ngọc Linh và đánh giá đƣợc mức độ biểu hiện của một số gen này ở mô lá, thân rễ của sâm Ngọc Linh 1 và 4 năm tuổi. NỘI DUNG: a) Xác định các gen liên quan đến con đƣờng sinh tổng hợp ginsenoside ở sâm Ngọc Linh thông qua phân tích dữ liệu hệ gen phiên mã thu đƣợc từ giải trình tự gen thế hệ mới; b) Xây dựng con đƣờng sinh tổng hợp ginsenoside giả định ở sâm Ngọc Linh; c) Nhân bản và xác định trình tự một số gen liên quan đến con đƣờng sinh tổng hợp ginsenoside ở sâm Ngọc Linh sử dụng phƣơng pháp Sanger; d) Phân tích biểu hiện các gen liên quan đến con đƣờng sinh tổng hợp ginsenoside ở mẫu lá sâm Ngọc Linh 1 và 4 năm tuổi; e) Phân tích biểu hiện các gen liên quan đến con đƣờng sinh tổng hợp ginsenoside ở mẫu thân rễ sâm Ngọc Linh 1 và 4 năm tuổi; f) So sánh mức biểu hiện của các gen liên quan đến tổng hợp ginsenoside giữa mô lá và thân rễ sâm Ngọc Linh ở hai độ tuổi. Vietnam Academy of Science and Technology 3 CHƢƠNG 1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CHI NHÂN SÂM VÀ SÂM NGỌC LINH 1.1 Chi Nhân sâm Chi Nhâm sâm (Panax L.) là loài cây lâu năm có củ, phát triển rất chậm thuộc họ Ngũ gia bì (Araliaceae), bộ Apiales (Hoa tán), chủ yếu mọc ở Bắc bán cầu trong khu vực Đông Á (phần lớn ở Triều Tiên - Cao Ly), Trung Quốc, Đông Siberi và Bắc Mỹ, đặc trƣng là xứ lạnh. Trong đó ở Bắc Mỹ chỉ có 1 loài, còn lại tập trung ở Đông Á (kể cả Himalaya). Tất cả các loài đều có giá trị làm thuốc, một số có giá trị kinh tế rất cao, mang lại nguồn thu hàng trăm triệu USD nhƣ sâm Triều Tiên (Panax ginseng), sâm Mỹ (Panax quinquefolius), sâm Nhật (Panax japonicus) và Tam thất (Panax notoginseng) [9]. Gần đây, 12 loài với 2 thứ thuộc chi này đã đƣợc mô tả [10-11].

Các loài chính bao gồm: P., P vietnamensis Ha et Grushv. Một số loài đƣợc gọi tên theo tên quốc gia, chỉ nguồn gốc xuất xứ của sâm nhƣ P. vietnamensis lần lƣợt đƣợc gọi là sâm Nhật, sâm Trung Quốc, sâm Mỹ và sâm Việt Nam [11]. Nhiều loài Panax chứa các hợp chất tự nhiên triterpene saponin hay còn gọi là các ginsenoside có cấu tạo phân tử khá phức tạp, độc đáo, có hoạt tính tốt và có tác dụng tăng cƣờng thể lực, chống oxy hóa, ung thƣ, đái tháo đƣờng, bảo vệ hệ thần kinh [1-2].

Nhiều công trình trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam đã lựa chọn các loài thuộc chi Panax làm đối tƣợng nghiên cứu về thành phần hóa học và dƣợc tính, đánh giá đa dạng di truyền, xây dựng mối quan hệ phát sinh chủng loại, nhân giống, gieo trồng. Từ năm 1959, khi Petkov lần đầu công bố về dƣợc tính của chiết xuất từ P. ginseng, đến nay đã có trên 6.000 công trình về các phƣơng thức sử dụng, thành phần hóa học, các đặc tính sinh học và dƣợc học của sâm [11]. Do vùng phân bố hạn chế và giá trị kinh tế cùng nhu cầu tiêu dùng rất cao nên nhiều loài thuộc chi Panax đã bị khai thác quá mức và trở nên rất Vietnam Academy of Science and Technology 4 hiếm trong tự nhiên [12,13].

Nhiều quốc gia đã triển khai các chƣơng trình bảo tồn, khai thác và sử dụng bền vững các nguồn gen đặc biệt quý hiếm này, nhƣ sâm Triều Tiên/ Hàn Quốc, sâm Trung Quốc và sâm Mỹ đƣợc trồng thƣơng mại và phổ biến nhất [11]. Gần đây, sâm Việt Nam cũng đƣợc ƣu tiên phát triển thành sản phẩm quốc gia.2 Sâm Ngọc Linh Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) thuộc chi Nhân sâm (Panax L.) là một trong những loài cây dƣợc liệu quý hiếm và đặc hữu của Việt Nam, đƣợc sử dụng nhƣ thảo dƣợc giúp phục hồi và tăng cƣờng sức khỏe. Ở Việt Nam, các nghiên cứu về phân loại và xác định thành phần loài của chi Panax cho thấy chi này gồm 3 loài mọc tự nhiên có giá trị làm thuốc bao gồm P. stipuleanatus Tsai et Feng (Tam thất hoang), P.

vietnamensis Ha et Grushv. Sâm Ngọc Linh còn có các tên gọi khác là sâm Việt Nam, sâm khu Năm (K5), sâm trúc (sâm đốt trúc, trúc tiết sâm), củ Ngải rọm con hay cây Thuốc giấu. Sâm Ngọc Linh đƣợc phát hiện vào năm 1973 và đến năm 1985 mới đƣợc công bố là hoàn toàn mới đối với khoa học [3]. Sâm Ngọc Linh mọc dày thành đám dƣới tán rừng dọc theo các suối ẩm trên đất nhiều mùn, mọc tập trung chủ yếu ở chân núi Ngọc Linh, thuộc các huyện Trà My, Trà Lĩnh, Trà Giang, tỉnh Quảng Nam.

Hai thứ khác của P. vietnamensis đƣợc phát hiện gần đây là P. vietnamensis Ha et Grushvitzky var.Trieu (sâm Lang Bian) đƣợc phát hiện ở vùng núi Langbian, Lâm Đồng. Ngoài ra, Panax sp.

(sau đây gọi là Panax sp. Puxailaileng) phân bố ở vùng núi Puxailaileng thuộc tỉnh Nghệ An đƣợc xác định là một thứ của sâm Ngọc Linh và cần các nghiên cứu sâu hơn [14]. Gần đây, phân tích cây phát sinh chủng loại dựa trên vùng ITS-rDNA và matK, Pham et al. (2020) đã xác định sâm Puxailaileng là P.

Tƣơng tự nhƣ nhiều loài thuộc chi Panax, sâm Ngọc Linh trở nên cực kỳ quý hiếm trong tự nhiên đƣợc đƣa vào Danh lục đỏ của IUCN (2003) và Sách đỏ Việt Nam (2007) do phạm vi phân bố hạn chế và việc khai thác quá mức.1 Các loài tự nhiên thuộc chi Panax ở Việt Nam mô tả một số đặc điểm hình thái của các loài/ thứ thuộc chi Panax ở Việt Nam (bao Vietnam Academy of Science and Technology 5 gồm sâm Ngọc Linh, sâm Lai Châu, sâm Nghệ An, sâm Vũ diệp, Tam thất hoang) sử dụng trong định loại hình thái [4-5, 7, 14]. 1 Các loài tự nhiên thuộc chi Panax ở Việt Nam A: Hình dạng cây Panax vietnamensis Ha et Grushv. 5 năm tuổi; B: Thân rễ P. Vietnam Academy of Science and Technology 6 vietnamensis 7 năm tuổi; C: Đặc thù hoa P.

vietnamensis; D: Đặc thù quả P. vietnamensis [16]; E: Hình ảnh cây mọc tự nhiên của Panax vietnamensis var. fuscidicus [17]; F: Hình ảnh lá, hoa và cây mọc tự nhiên của Panax sp. Puxailaileng [14]; G: Hình vẽ Panax bipinnatifidus Seem.

theo mẫu VDL 3265: 1. Cành mang hoa; 2. Thân rễ (củ) [5]; H: Hình vẽ Panax stipuleanatus Tsai et Feng theo mẫu VDL 3270: 1. Cành mang hoa; 2.

Sâm Ngọc Linh chứa các hợp chất ginsenoside với nhiều giá trị dƣợc liệu quan trọng. Các ginsenoside có bản chất là triterpene saponin với cấu trúc bao gồm 1 khung squalene 30 carbon đƣợc gắn với các gốc đƣờng ở nhiều vị trí khác nhau trên khung. Tên của các triterpene saponin đƣợc đặt theo chi thực vật mà chúng đƣợc phát hiện lần đầu tiên (astragaloside, cucurbitacin, ginsenoside…) hoặc Rx với x là vị trí tƣơng đối hợp chất trong thí nghiệm sắc ký lớp mỏng (Ro, Ra1, Rb1, Rg1…). Hiện nay, hơn 30 loại ginsenoside đã đƣợc tách chiết từ chi Panax và đã đƣợc phân làm 2 nhóm chính là dammarane ginsenoside và oleanane ginsenoside.

Phần lớn các ginsenoside thuộc nhóm dammarane ginsenoside, bao gồm Rb1, Rc, Rd, Re, và Rg1… trong khi nhóm oleanane ginsenoside chỉ có 1 đại diện duy nhất là Ro. Các con đƣờng sinh tổng hợp ginsenoside đƣợc chia thành hai phần: (1) acetyl-CoA trải qua tác dụng của mevalonate (MVA) để tạo thành 3-isoprene pyrophosphate (IPP) và dimethylallyl pyrophosphate (DMAPP), sau đó IPP và DMAPP đƣợc xúc tác bởi các enzym khác nhau để tạo thành 2,3- oxidosqualene; và (2) các loại ginsenoside đƣợc hình thành nhờ các phản ứng vòng hóa, hydroxyl hóa và glycosyl hóa hợp chất 2,3-oxidosqualene.