CHƯƠNG 1: TONG QUAN TÀI LIEU 1. Mô hình trong đánh giá độc tinh, dược tinh của hóa chat 1. Các mô hình đánh giá an toàn hóa chất và nguyên tắc 3R Đề đánh giá ảnh hưởng sinh học của một hóa chất, các nhà khoa học thường bắt đầu từ khảo sát tính an toàn thông qua các thí nghiệm độc học (toxicology test). Mô hình thí nghiệm phổ biến nhất cho các thí nghiệm độc học thời kỳ đầu là các mô hình in vivo trên động vật sống, đặc biệt là trên chuột nhắt trắng (Mus musculus).
Vi dụ như OECD 401 là hướng dẫn thử nghiệm độc tính đường miệng được OECD xây dựng từ 1980 với đối tượng thử nghiệm là chuột. Nó đã được thay thế bởi hướng dẫn OECD số 423 từ 1996, sửa đổi năm 2001 nham giảm thiểu số lượng cá thé cần thiết dé xác định giá tri LD50 của hóa chất [57]. OECD cũng cung cấp một số thiết kế thử nghiệm khác dé xác định độc tính hóa chất cũng trên đối tượng chuột như OECD 425, dé phù hop với da dạng các nhóm chat thí nghiệm. Các thử nghiệm độc tính có xu hướng phát triển rời xa khỏi các thí nghiệm trên động vật và hướng tới sử dụng các phương pháp thay thế (alternative methods), động lực của sự phát triển này là nguyên tắc 3R.
Những ảnh hường mà nguyên tắc 3Rs đã tạo ra sau hơn 70 năm tồn tại và phát triển có thé quan sát thay trong các tài liệu hướng dẫn thử nghiệm của các tổ chức quản ly hóa chất: Hướng dẫn thử nghiệm độc tính của OECD và EU 2023 giới thiệu 29 thí nghiệm khác nhau đề đánh giá ảnh hưởng lên sức khỏe và môi trường [2]. Trong đó, không có thử nghiệm nào tiến hành trực tiếp trên động vật có xương sông và đều ưu tiên sử dụng các phương pháp thay thế, ví dụ: thử nghiệm trên võng mạc bò (mô hình ex vivo) OECD 437 dé kiêm tra anh hưởng lên mắt; thử nghiệm trên biểu bì người nhân tạo (in vitro) — OECD 439 dé kiểm tra khả năng gây kích ứng da; mô hình in vitro Micronucleus tế bào động vật có vú — OECD 487 dé đánh giá khả năng gây độc lên hệ gen (genotoxic) và mô hình đánh giá độc tính trên phôi cá ngựa văn — OECD 236 dé khảo sát độc học môi trường. Xu hướng chung là thay thế mô hình động vật truyện thong băng các mô hình in vitro, ex vivo hoặc in vivo trên động 3 vật bậc thấp hơn; giảm thiểu các thử nghiệm không cần thiết trên động vật và giảm tối đa số lượng động vật cần thí nghiệm trong các thử nghiệm trên động vật; cải tiền các phương pháp đang sử dung dé giúp giảm căng thang cho động vật trong toàn bộ quá trình trước, trong và sau khi thực hiện thử nghiệm. Chuẩn hóa kết quả các thử nghiệm dé hình thành các cơ sở dữ liệu về độc tinh chat, từ đó có thé giảm thực hiện các thí nghiệm trùng lặp và là cơ sở sử dụng thêm các phương pháp tin sinh học dé dự đoán ảnh hưởng của các hóa chất mới có đặc điểm cấu trúc tương tự.
Ứng dụng quy tắc 3Rs trong luận văn được thê hiện qua hai mô hình thí nghiệm sử dụng gồm: mô hình in vivo phôi cá ngựa văn và mô hình ex vivo tế bào lách chuột đều là các mô hình đánh giá thay thế, trong đó kết quả khảo sát trên phôi cá được dùng làm nền tang dé tìm hiểu sâu hơn về khả năng anh hưởng của dịch chiết tự nhiên lên quá trình viêm. Một số thông tin giới thiệu về 2 mô hình này được trình bày trong phần tiếp theo. Mô hình phôi cá ngựa văn Thử nghiệm độc tính của hóa chất lên mô hình phôi và ấu thể cá ngựa văn đã được thực hiện trên 30 năm và đã đạt được rất nhiều kết quả đáng kê, khẳng định tính khoa học và hiệu quả của mô hình. Các thử nghiệm đầu tiên trên mô hình ấu thể cá ngựa văn được thực hiện bởi Geogre Streisinger và các cộng sự của ông từ những năm 1980 tại phòng thí nghiệm sinh học phân tử tai đại hoc Oregon, Hoa Kỳ.
Streisinger đã nhân bản thành công cá ngựa vằn lưỡng bội và giới thiệu mô hình này đến rất nhiều cơ sở nghiên cứu khác trên thế giới [45]. Hiện nay, cá ngựa van và mô hình thử nghiệm phôi cá đã được cộng đồng khoa học sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu và ngày càng phô biến trong các xuất bản trên các tạp chí khoa học. Tìm kiếm từ khóa “zebrafish” trên thư viện điện tử Pubmed cho thay có hơn 50.000 kết quả, trong đó số xuất bản mỗi năm từ 2020 đến 2022 đạt trên 4. Nếu giới hạn từ khóa cho ấu thể và phôi cá ngựa văn “zebrafish embryo” và “larvae” thu được trên 2.700 kết quả, trong đó hơn 2.300 kết quả là các xuất bản mới từ 2010 và khoảng 300 bài được xuất bản mỗi năm từ 2020 đến nay.
Phôi cá ngựa văn đã được ứng dụng trong nghiên cứu độc tính của rât nhiêu hóa chất khác nhau do rất nhiều ưu điểm. Trong bài nghiên cứu tông hợp về ứng dụng mô hình cá ngựa van trong đánh giá an toàn khi sàng lọc thuốc. Izuru Miyawaki đã đưa ra 13 ưu thế của mô hình này [52]: 1. Đây là mô hình động vật có xương sống có hau hết co quan tương đồng với con nguoi.
Tương đồng hon 70% với bộ gen với con người, trong đó tương đồng tới 84% các gen gây bệnh đã biết ở người. Hệ phiên mã đã được phân tích hoàn chỉnh, đồng thời có một cơ sở dữ liệu các trình tự đánh dấu biéu hiện (Expressed Sequence Tag). Dễ dàng thực hiện các kỹ thuật chỉnh sửa hệ gen. FMyaSwn Vòng đời ngắn, dé tạo các mô hình bệnh.
Phôi và ấu thé có kích thước nhỏ, vừa trong đĩa 384 giếng chứa 50 pL nước. Dé chăm sóc và giao phối, yêu cầu cơ sở vật chat đơn giản với chi phí chăm sóc thấp. Cá trưởng thành đẻ mắn (khoảng 200 trứng/tuần) cho phép chuẩn bị số lượng mẫu thí nghiệm lớn. Cá có thé hap thụ chat thử qua miệng, mang và da, do vậy chỉ cần hòa tan chất thử nghiệm trong nước nuôi cá.
Trường hợp chất thử nghiệm không tan trong nước, là hợp chất phân tử lớn hoặc protein, có thể tiêm trực tiếp vào noãn hoàng, xoang tĩnh mạch hoặc mạch máu. Với cá trưởng thành còn có thể đưa thuốc theo đường miệng hoặc tiêm bụng. Phôi thu tinh ngoài, dễ thao tác. Tốc độ phát triển phôi rất nhanh, cho phép thực hiện các nghiên cứu độc học phát triển trong một thời gian ngăn (các cơ quan được hình thành gần như hoàn chỉnh sau 24 giờ sau thụ tinh, ấu thể thoát khỏi vỏ phôi sau 3 — 4 ngày).
Phôi và au thé gần như trong suốt, cho phép theo dõi quá trình phát triển hình thái mà không cân mô. Hướng dẫn số 236 của OECD cho thử nghiệm độc tính trên phôi cá có thể được ứng dụng với phôi cá ngựa văn, đây là một trong những hướng dẫn thử nghiệm độc tính môi trường nước được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu, được EURL ECVAM khuyên khích sử dụng từ tháng 7/2014 cho các hóa chất công nghiệp, chat bảo vệ thực vật, phụ gia thực phẩm. Mô hình phôi cá ngựa văn là một mô hình độc học phát triển, trong khoảng 120 giờ, cá phát triển từ 1 phôi bào đến cơ thé toàn diện (Whole body). Điều này tạo điều kiện cho các nghiên cứu sâu hơn về độc học phát triển, các cơ quan nhận được nhiều quan tâm bao gồm: Tim, hệ mạch, gan và thần kinh.
Tim: quá trình phát triển tim của cá ngựa van và con người có nhiều điểm tương đồng, cả 2 đều bắt đầu từ tế bảo tiền thân tim phát triển thành 1 ống tim. Ở khoảng 30 giờ sau khi thụ tinh, ống tim bắt đầu hình thành các ngăn tim. Từ 72 — 96 giờ sau thụ tinh, tim cá tiếp tục hoàn thiện và đỉnh tâm thất được hình thành trong khoảng thời gian này, hệ gen của cá và người có chung nghiều gen thiết yếu [40]. Một số mô hình bệnh tim đã được phát triển trên mô hình phôi cá như chứng QT kéo dai ở dòng đột biến allele kcnh2 [7].
Trong một nghiên cứu năm 2022, chất điều hòa sinh trưởng thực vật 6 — BA được đánh giá tính an toàn sử dụng mô hình phôi cá ngựa văn. Kết quả cho thay 6 - BA gây ảnh hưởng đến quá trình hình thành tim ở cá, gây tăng tế bào chết theo chu trình ở tim cá với cơ chế thông qua thay đổi biểu hiện các gen cần thiết cho quá trình phát triển tim như my/7, vmhc, myh6, và quá trình hình thành xoang nhĩ thất như bmp4, tbx2b, và notch1b [79]. Trong một nghiên cứu khác, thuốc diệt cỏ pendimethalin được đánh giá ảnh hưởng lên phôi cá ngựa van. Các cá thé tiếp xúc với thuốc có xuất hiện các dị dang hình thái như phù mang tim, phù mang noãn hoàng, cong cột sống và bat thường trong hình thành khoang tim.
Nhóm nghiên cứu cũng tìm thấy thay đổi trong các chỉ dấu liên quan đến phát triển tim và tế bào chết theo chu trình vbhc, nppa, tbx5a, nkx2.5, gata4, thx2b and FoxOI, bax, bcl-2, p53, casp-9, casp-3, đặc biệt, kích hoạt con đường Wnt bằng BML-284 (10 nm) có khả năng làm giảm mức độ phù màng tim của ấu thé cá tiếp xúc với thuốc diệt cỏ [51]. Gan: Trong nghiên cứu của Jian-hui He và cộng sự, phôi cá được phơi nhiễm với 6 loại thuốc gây độc trên gan đã biết ở người: acetaminophen, aspirin, tetracycline, sodium valporate, cyclophosphamide và erythromycin dé đánh giá hiệu quả của mô hình. Au thé cá 3 ngày tudi được cho tiếp xúc với thuốc trong 2 ngày ở các nồng độ không có khả năng gây tử vong hoặc gây chết rất thấp (<. Kết quả cho thấy âu thé xuất hiện các kiểu hình gan khác biệt rõ rệt so với đối chứng, gan không còn trong suốt mà trở nên tối màu [24].
Một nghiên cứu mới hơn công bố năm 2020 đã đánh giá khả năng gây độc gan của 19 đơn chat tinh khiết được chiết từ Polygoni Multiflori Thunb lên phôi cá. Hiện tượng gan chuyền tối màu được khang định là bang chứng tốt dé nhận diện các thuốc gây ton thương gan do có tương đồng cao với kết qua phân tích hoạt tính enzyme gan ALT và AST. Nhóm nghiên cứu đã xác định được 6/19 đơn chất có độc tính trên gan rất rõ rệt và đưa đến kết luận thành phần emodin, emodin-8-O-B-D-glucopyranoside, chryophanol và đianthrone là tác nhân dẫn đến độc tính trên gan của Polygoni Multilori [46].