Nghiên cứu phương pháp định lượng hợp chất phenolic trong lá đu đủ (Carica papaya)

Luận văn nghiên cứu, xây dựng phương pháp định lượng các hợp chất phenolic trong lá đu đủ (Carica papaya) bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao.

• Tác giả: Nguyễn Thị Dung
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Văn Tài
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Hóa phân tích
• Đề tài: Nghiên cứu phương pháp định lượng một số hợp chất phenolic trong lá đu đủ (Carica papaya)
• Loại tài liệu: Luận văn Thạc sĩ Khoa học
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về hợp chất Phenolic trong lá Đu đủ

Hợp chất phenolic là những chất hữu cơ quan trọng được tìm thấy phong phú trong lá đu đủ (Carica papaya). Các flavonoid và các dẫn chất phenol khác có vai trò thiết yếu trong hoạt động sinh học của cây. Lá đu đủ chứa nhiều thành phần hóa học quý giá như manghaslin, clitorin, rutin và nicotiflorin. Những hợp chất này sở hữu những tác dụng sinh học đáng kể, bao gồm khả năng chống oxy hóa và kháng viêm. Việc hiểu rõ thành phần phenolic compound trong lá đu đủ là cơ sở để phát triển các sản phẩm dược phẩm và thực phẩm chức năng hiệu quả.

1.1. Đặc điểm thực vật của cây Đu đủ

Cây đu đủ (Carica papaya) là một loài thực vật nhiệt đới có nguồn gốc từ Mỹ Trung và Mỹ Nam. Cây được trồng rộng rãi ở các vùng khí hậu ấm áp trên toàn thế giới. Lá đu đủ có hình dạng lớn, màu xanh lá cây đặc trưng với mạch lá rõ rệt. Các lá chứa chất phenolic cao, đặc biệt là flavonoid và các hợp chất polyphenol khác có giá trị y học.

1.2. Các tác dụng dược lý và sinh học

Lá đu đủ được sử dụng truyền thống trong y học cổ điển với nhiều tác dụng sinh học quan trọng. Các hợp chất phenolic trong lá đu đủ giúp chống oxy hóa mạnh mẽ, giảm tổn thương tế bào từ gốc tự do. Ngoài ra, flavonoid còn có khả năng kháng viêm, hỗ trợ hệ miễn dịch và cải thiện sức khỏe tổng thể. Những tính chất này làm cho lá đu đủ trở thành dược liệu quý giá.

II. Phương pháp định lượng Phenolic bằng HPLC

Phương pháp HPLC/PAD (High Performance Liquid Chromatography with Photodiode Array Detector) là kỹ thuật hiện đại được sử dụng để định lượng phenolic trong lá đu đủ. Phương pháp này cho phép phân tích đồng thời nhiều hợp chất phenolic như manghaslin, clitorin, rutin và nicotiflorin. HPLC cung cấp độ chính xác cao, độ lặp lại tốt và khả năng phân tách các thành phần phức tạp. Kỹ thuật này được xây dựng dựa trên quy trình xử lý mẫu tối ưu và hệ gradient pha động thích hợp. Đây là phương pháp tiêu chuẩn trong phân tích định lượng các thành phần hóa học từ dược liệu tự nhiên.

2.1. Nguyên tắc kỹ thuật HPLC

HPLC hoạt động dựa trên nguyên tắc tách các hợp chất phenolic dựa trên độ ái lực khác nhau với cột sắc ký. Photodiode Array Detector giúp phát hiện và định lượng chính xác flavonoid và các thành phần hóa học tại bước sóng phù hợp. Phương pháp này cung cấp độ nhạy cao và độ chọn lọc tốt cho từng thành phần riêng lẻ.

2.2. Điều kiện tối ưu phân tích

Để đạt hiệu quả cao, phương pháp HPLC cần điều kiện tối ưu bao gồm lựa chọn pha động, nhiệt độ cột và tốc độ lưu lượng phù hợp. Hệ gradient pha động sử dụng acid acetic có tác dụng cải thiện độ phân tách. Các điều kiện sắc ký được khảo sát chi tiết để đảm bảo phân tách hoàn toàn các hợp chất phenolic trong lá đu đủ với độ phân giải cao.

III. Phương pháp QAMS cho định lượng đa thành phần

Phương pháp QAMS (Quantitative Analysis of Multi-components by Single Marker) là một kỹ thuật tiên tiến cho phép định lượng đa thành phần chỉ bằng một chất đánh dấu duy nhất. Phương pháp này tối ưu hóa quá trình phân tích bằng cách sử dụng hệ số hiệu chỉnh tương đối (RCF) để tính toán nồng độ của các hợp chất phenolic khác. QAMS giúp giảm chi phí do không cần chuẩn hóa tất cả các chất cần phân tích. Kỹ thuật này đặc biệt hữu ích trong phân tích flavonoid từ lá đu đủ khi số lượng chất chuẩn hạn chế. Phương pháp QAMS đã được chứng minh hiệu quả trong nhiều nghiên cứu phân tích dược liệu.

3.1. Nguyên tắc của phương pháp QAMS

QAMS dựa trên nguyên tắc rằng các hợp chất phenolic cấu trúc tương tự có hệ số hiệu chỉnh tương đối (RCF) ổn định và lặp lại được. Bằng cách sử dụng một chất đánh dấu có đáp ứng đo đạc ổn định, có thể tính toán chính xác nồng độ của các hợp chất khác mà không cần chuẩn riêng. Phương pháp này tiết kiệm chi phí và thời gian phân tích đáng kể.

3.2. Ứng dụng QAMS trong phân tích lá Đu đủ

Trong nghiên cứu phương pháp định lượng phenolic ở lá đu đủ, QAMS được áp dụng để định lượng manghaslin, clitorin, rutin từ một chất đánh dấu duy nhất là nicotiflorin. Phương pháp này cung cấp độ chính xác cao với độ lặp lại tốt, phù hợp cho phân tích định lượng hàng loạt mẫu dược liệu.

IV. Quy trình xử lý mẫu và kiểm định chất lượng

Quy trình xử lý mẫu là bước quan trọng quyết định chất lượng kết quả phân tích định lượng phenolic. Quá trình này bao gồm chiết xuất lá đu đủ, loại bỏ các chất cản trở, và chuẩn bị dung dịch phù hợp cho phân tích HPLC. Phương pháp QuEChERS được áp dụng để tối ưu hóa quá trình chiết xuất các hợp chất phenolic. Kiểm định chất lượng phương pháp bao gồm xác định giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ lặp lại và độ không đảm bảo đo. Các thông số này đảm bảo phương pháp đạt tiêu chuẩn quốc tế cho phân tích định lượng dược liệu.

4.1. Phương pháp chiết xuất QuEChERS

Phương pháp QuEChERS sử dụng hỗn hợp muối chiết và dung môi hữu cơ để hiệu quả chiết xuất phenolic từ lá đu đủ. Phương pháp này có ưu điểm là nhanh, hiệu quả cao, chi phí thấp và thân thiện với môi trường. Hỗn hợp chất phân bố giúp tách rời chất ô nhiễm khỏi các hợp chất phenolic mong muốn, cải thiện độ sạch của mẫu.

4.2. Các tiêu chí kiểm định chất lượng phương pháp

Kiểm định chất lượng phương pháp HPLC bao gồm xác định LOD/LOQ, độ lặp lại trong ngày và khác ngày, tính thích hợp hệ thống. Độ không đảm bảo đo được ước lượng theo hướng dẫn GUM. Tính thích hợp hệ thống kiểm tra độ phân tách các hợp chất phenolic và tính đối xứng pic để đảm bảo phương pháp phù hợp cho phân tích định lượng chính thức.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1. Tổng quan cây Đu đủ (Carica papaya) 1. Đặc điểm thực vật của Đu đủ (Carica papaya) Đu đủ (danh pháp khoa học: Carica papaya) là một cây thuộc họ Đu đủ, là một loại cây ăn quả trồng khá phổ biến ở các nước nhiệt đới cũng như Việt Nam và từ lâu được coi như là một vị thuốc. Tên gọi khác: Phiên qua thụ, Phiên mộc, Mác rẩu, Mác vá, Cà lào (Tày), Má hống (Thái) Tên tiếng Anh: Papaya (US), Papaw /Pawpaw (UK).

Tên tiếng Pháp: Papayer. Tên khoa học: Carica papaya L. Đu đủ được phân loại như sau [5]: Giới (regnum) Thực vật (Plantae) Thực vật có hoa (Angiospermae) Thực vật 2 lá mầm thực sự (Eudicots) Nhánh hoa hồng (Rosids) Bộ (ordo) Cải (Brassicales) Họ (familia) Đu đủ (Caricaceae/Papayaceae) Chi (genus) Carica Loài (species) Carica papaya L. Mô tả thực vật Đu đủ là cây nhỏ hoặc cây nhỡ, cao 2-4 m, thân thẳng, không phân nhánh, mang nhiều vết sẹo do cuống lá rụng để lại.

Lá Đu đủ to, mọc so le, tập trung ở ngọn, cuống rất dài, xẻ 5-7 thùy sâu, gốc hình tim, đầu nhọn, mỗi thùy lại chia tiếp thành những thùy nhỏ không đều, gân lá hình chân vịt, hai mặt nhẵn. Hoa Đu đủ có màu vàng lục nhạt, mọc ở kẽ lá; hoa đực và hoa cái cùng gốc hoặc khác gốc; cụm hoa đực dài, phân nhánh thành chùy xim, đài hợp có 5 răng ngắn, tràng 5 cánh hàn liền hình phễu, nhị xếp thành 2 vòng trên ống tràng, nhụy tiêu giảm; cụm hoa đực dài, phân nhánh thanh chùy xim, đài hợp có 5 răng ngắn, tràng 5 cánh hàn liền hình phễu, nhị xếp thành 2 3 vòng trên ống tràng, nhụy tiêu giảm; cụm hoa cái có 2-3 hoa, đài và tràng gồm những bộ phận hơi dính nhau ở gốc, không có nhị lép, bầu 1 ô, nhiều lá noãn. Quả Đu đủ mọng to, hình trứng ngược hoặc thuân dài, khi chín màu vàng đỏ; hạt nhiều màu đen [5, 59]. Cây mang quả và hình dạng lá Đu b.

Quả Đu đủ và hạt đủ c. Một số hình ảnh về cây Đu đủ (Carica papaya) 1. Nguồn gốc và phân bố Chi Đu đủ (Carica) có một loài duy nhất là Đu đủ (Carica papaya L. Loài này có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới của Châu Mỹ nhưng hiện nay nó là loài cây ăn quả nhiệt đới được trồng rộng rải ở Miền Nam Hoa Kỳ (Florida và US Virgin Island), Mexico, các nước Trung Mỹ, các nước Nam Mỹ, Châu Phi, Châu Á, Châu Đại Dương và tiểu bang Hawaii của Mỹ [12].

Ở Việt Nam có hai giống Đu đủ nội địa truyền thống là giống Đu đủ thịt đỏ và 4 giống Đu đủ thịt vàng. Hiện nay có nhiều giống mới được lai tạo và nhập nội chủ yếu là các giống Đu đủ lai F1 với năng suất, sản lượng và chất lượng quả cao với nhiều màu sắc của thị quả khác nhau như đỏ, vàng, tím… Cây Đu đủ (Carica papaya L.) được trồng hầu hết ở các tỉnh miền Bắc, miền Trung và miền Nam. Các tỉnh trồng nhiều Đu đủ như: Hà Nội, Hưng Yên, Hà Nam, Vĩnh Phúc, Tiền Giang, Cần Thơ, các tỉnh Tây Nguyên,…. Diện tích trồng Đu đủ của cả nước ước khoảng 10.000 ha với sản lượng khoảng 200 – 350 nghìn tấn quả [10].

Công dụng Trong Y học cổ truyền Việt Nam, cây Đu đủ có rất nhiều công dụng như lá Đu đủ tươi được dùng dạng đắp để chữa đau đầu, trị mụn nhọt, tiêu sưng tấy; sắc nước lá tươi dùng để chữa ung thư; ước sắc lá Đu đủ khô có tác dụng sát khuẩn, dùng rửa vết thương, lở loét; nhựa mủ từ lá và quả Đu đủ dùng bôi chữa chai chân, hột cơm, nốt tàn nhan, hắc lào mới phát, eczema, vảy nến …[1], [5]. Trong y học dân gian Ấn Độ, lá Đu đủ được dùng đắp trị đau thần kinh và giảm phát triển dạng phù voi. Y học cổ truyền Indonesia dùng dịch ép lá Đu đủ uống chữa sốt rét và những bệnh sốt khác; lá Đu đủ cũng có trong bài thuốc sắc uống chữa lao [19]. Ở Nigiêria, nước sắc lá Đu đủ trị sốt rét cho người và làm thuốc tẩy cho ngựa.

Ở Peru, nước hãm lá uống gây hạ huyết áp, làm dễ tiêu. Ở Haiti, đắp lá nấu chín trị thấp khớp, chấn thương, bong gân [10, 66]. Tác dụng sinh học và dược lý của lá Đu đủ Tác dụng chống sự suy giảm tiểu cầu Gần đây, nhiều nghiên cứu in vitro, in vivo và trên lâm sàng cho thấy lá Đu đủ có tác dụng tăng tiêu cầu, dùng cho bệnh nhân bị sốt xuất huyết [8, 57, 60]. Flavonoid từ lá Đu đủ thể hiện liên kết với enzyme protease 2B và 3 (NS2B-NS3), một enzyme quan trọng đối với sự nhân lên của virus Dengue, do đó có thể có tiềm năng trong điều trị sốt xuất huyết [60].

Quercitin có tác dụng ngăn chặn sự kết tập tiểu cầu do ADP gây ra. In vitro, acid myristic thể hện khả năng ức chế sự kết tụ thrombin ở tiểu 5 cầu thỏ [48]. Keampferol cũng đã được chứng minh có tác dụng ức chế kết tập tiểu cầu và ngăn ngừa hình thành huyết khối thông qua ức chế hoạt động enzym hóa của thrombin và Fxa tương ứng 68 ± 1. In vivo, kaempferol ngăn ngừa quá trình hình thành huyết khối ở cả mô hình huyết khối cấp tính do collagen/ epinephrine và thrombin và mô hình huyết khối động mạch cảnh do FeCl3 gây ra [35].

Một số sản phẩm từ lá Đu đủ Một số nghiên cứu cho thấy nước ép lá Đu đủ đông khô giàu các hợp chất phenolic như manghaslin, clitorin, rutin, nicotiflorin và carpaine đã làm tăng tổng số bạch cầu và bạch cầu trung tính ở chuột bị nhiễm lập DENV-2 (DMOF015), làm giảm mức GM-CSF, GRO-alpha, IL-1 beta, IL-6, MCP-1 và MIP-1 beta trong huyết tương của chuột bị nhiễm virus và có tác dụng sản xuất các cytokine gây viêm trong quá trình nhiễm virus sốt xuất huyết ở chuột AG129, đã làm tăng nồng độ CCL2/MCP-1 trong huyết tương [42, 43]. Trên thực tế, nhiều nước trên thế giới như Ấn Độ, Philippine, Indonesia, 6 Pakistan … cũng như ở Việt Nam đã cấp phép cho các sản phẩm chứa cao chiết lá Đu đủ dùng cho người bệnh sốt xuất huyết. Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm Lá Đu đủ có tính kháng khuẩn tốt, Elisa Friska Romasi và cộng sự ngâm chiết lá Đu đủ với 3 loại dung môi ethanol, ethyl acetate và n-hexan. Kết quả cho thấy, cao chiết bằng ethyl acetat ức chế cả 4 chủng Bacillus stearothermophilus, Listeria monocytogenes, Pseudomonas sp.

và Escherichia coli [49]. Nghiên cứu của Baskaran và cộng sự (2012) đã cho thấy dịch chiết ethanol, methanol, ethyl acetat, aceton, chloroform, ete dầu, hexan và dịch chiết nước đều có tác dụng chống lại vi khuẩn và nấm [22]. Chống ung thư Các cao chiết giàu flavonoid và phenolic từ lá Đu đủ thể hiện tác dụng ức chế sự phát triển của các dòng ung thư biểu mô tế bào vảy ở miệng người SCC25 [21, 63]. Cao chiết giàu flavonoid từ lá Đu đủ có tác dụng ức chế sự phát triển của dòng tế bào Hep-G2 với IC50 56,63 ± 1,25 µg/ml [56].

Dịch chiết nước lá Đu đủ được đánh giá tác dụng kháng khối u và điều hòa miễn dịch. Kết quả cho thấy dịch chiết nước lá Đu đủ có tác dụng ức chế đáng kể với các dòng tế bào ung thư, tăng cường biểu hiện của 23 gen điều hòa miễn dịch. Dịch nước ép lá Đu đủ (0,03-0,003 mg/ml) ức chế mạnh các tế bào ung thư tuyến tiền liệt. Phân đoạn phân cực trung bình ức chế sự di chuyển và bám dính của các tế bào di căn PC- 3 [29, 49].

Tác dụng giảm đau Dịch chiết n-hexan, ethyl acetat, ethanol được đánh giá tác dụng giảm đau trên mô hình chuột bị gây đau do acid acetic. Cả ba dịch chiết đều có tác dụng giảm đau đáng kể ở cả ba mức liều 0,175; 0,35 và 0,70 mg/kg khi so sánh với aspirin [20, 66]. Tác dụng kháng ký sinh trùng và giun sán Dịch chiết lá Đu đủ có hoạt tính kháng ký sinh trùng cao, độc tế bào thấp. Các alkaloid được thử tác dụng in vitro với 4 loại ký sinh trùng Trypanosoma brucei rhodesiense, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani và Plasmodium falciparu và 7 trên mô hình chuột thực nghiệm bị nhiễm Plasmodium berghei.

Kết quả cho thấy các alkaloid, đặc biệt carpain có hoạt tính kháng ký sinh trùng cao [20, 66]. Cao chiết lá Đu đủ cho thấy tác dụng diệt Meloidogyne incognito và Rotylenchulus reniformis (Mahemood và cộng sự, 1979) [20]. Tác dụng chống đái tháo đường Dịch chiết chloroform gồm steroid và quinin được đánh giá trên chuột bị tiểu đường gây ra bởi streptozotocin và chuột thường. Sau 20 ngày điều trị, có sự giảm đáng kể glucose, trans-aminase và triglycerid trong huyết thanh.

Lá Đu đủ có tiềm năng trong điều trị đái tháo đường [49]. Tác dụng lên hệ tim mạch và hệ thần kinh trung ương Các alkaloid chính như carpain trong lá Đu đủ được chứng minh có tác dụng lên hệ tim mạch trên chuột Wistar. Tăng dần liều carpain làm giảm dần huyết áp tâm thu, tâm trương và huyết áp trên động mạch. Atropin sulfat (1 mg/kg) hoặc propranolol hydrochlorid (8 mg/kg) không làm thay đổi tác dụng của carpain.

Carpain liều 2 mg/kg làm giảm áp lực lên tim, khả năng đột quỵ, ảnh hưởng đến cơ tim [36]. Tác dụng chống viêm Tác dụng kháng viêm của cao chiết ethanol lá Đu đủ làm giảm tổng khối lượng khối viêm từ 0,58 ± 0,07 g xuống còn 0,22 ± 0,03 g, đồng thời làm giảm đáng kể lượng dịch nhầy của khối viêm [68]. Năm 2013, nghiên cứu cao chiết lá Đu đủ bằng nước cho thấy với liều lượng sử dụng 100 và 200 mg/kg trọng lượng cơ thể đã làm giảm nhẹ các khối viêm. Đồng thời có tác dụng giảm đau rõ rệt [18].

Tác dụng bảo vệ thận Dịch chiết lá Đu đủ có tác dụng cải thiện các chỉ số SGPT, SGOT, urea, creatinin và malondialdehyd ở chuột bị nhiễm độc Pb (II) gây ra hoại tử nghiêm trọng tế bào thận và sưng tế bào hình ống [66]. Tác dụng chống oxy hóa Các flavonoid từ lá Đu đủ thể hiện tác dụng chống oxy hoá mạnh thông qua khả năng thu gom gốc peroxynitrit ((IC50 ≤ 4.15 μmol/L), mạnh hơn chất đối chứng 8 dương L-penicillamine (6. Hoạt tính chống oxy hóa của các flavonoid từ cao chiết lá Đu đủ được cho là góp phần làm ổn định màng tế bào, tạo điều kiện thuận lợi cho việc đảo ngược sự phá hủy tiểu cầu ngoại vi, ngăn ngừa tan máu và chảy máu do sốt xuất huyết [57]. Như vậy có thể thấy rằng, manghaslin, clitorin, rutin và nicotiflorin là bốn hoạt chất flavonoid là những hợp chất có hoạt tính sinh học nổi bật của lá Đu đủ, có nhiều tác dụng tốt đối với sức khỏe con người đặc biệt là tác dụng chống suy giảm tiểu cầu cho bệnh nhân sốt xuất huyết.