Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN B. Tổng quan về vi khuẩn B. Đặc điểm sinh học B.
anthracis là trực khuẩn thuộc chi Bacillus, họ Bacillaceae. Chi Bacillus gồm các vi khuẩn Gram dương sinh bào tử, đa số không gây bệnh, một số gây nhiễm trùng nhiễm độc thức ăn (Bacillus cereus), một số có lợi cho con người (Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides). Đặc điểm hình thái, tính chất sinh lý, sinh hoá, tính chất nuôi cấy của các loài thuộc chi Bacillus rất giống nhau. anthracis có đặc điểm khác biệt với các loài trực khuẩn hiếu khí sinh bào tử khác, đó là có plasmid pXO1 mã hóa cho ngoại độc tố và plasmid pXO2 mã hoá protein vỏ.
anthracis hình thẳng, hai đầu vuông, kích thước từ 11,51,58 µm, thường xếp thành từng chuỗi dài (Hình 1. Ở ngoại cảnh hoặc trong môi trường nuôi cấy, vi khuẩn hình thành bào tử nằm giữa thân và không làm thay đổi hình dạng tế bào. Trên động vật bị bệnh hoặc môi trường nuôi cấy đặc biệt, vi khuẩn có vỏ, không di động (Lê Thu Hồng, 2011; Christine, 2015). anthracis trên tiêu bản nhuộm Gram từ bệnh phẩm máu (Nguồn: Christine, 2015) 5 B.
anthracis dễ sinh trưởng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, nhiệt độ thích hợp là 37C, pH 6,9 - 7,0. Trên môi trường thạch thường, vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc dạng R (Rough - dạng xù xì), đường kính 4 - 5 mm, màu trắng ngà, bờ không đều, rất dai, bám chặt vào bề mặt môi trường. Trên môi trường thạch máu cừu, vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc không làm tan máu, khuẩn lạc khi được phóng đại vài chục lần có hình thể như búi tóc xoăn hoặc bờm sư tử (Hình 1. Vi khuẩn mọc không làm đục trên môi trường lỏng, tạo cặn như bông lắng xuống đáy, lắc không tan.
Tính chất lên men đường của B. anthracis bao gồm: Lên men không sinh hơi với các đường glucose, manitol, saccarose, không lên men đường salicin, làm lỏng gelatin, đông huyết tương, không mọc trên môi trường thạch Mac Conkey (Geo, 2013). anthracis trên môi trường thạch máu cừu (Nguồn: Christine, 2015) Thể sinh dưỡng của B. anthracis có sức đề kháng không cao, bị diệt ở điều kiện nhiệt độ 60°C trong 30 phút, ở 100°C trong 5 phút và những chất khử trùng thông thường.
Thể bào tử có sức đề kháng rất cao, tồn tại trong điều kiện tự nhiên nhiều năm, có thể tới vài chục năm mà vẫn còn khả năng gây bệnh (Geo, 2013). Tuy nhiên, bào tử có thể bị phá hủy bởi hấp ướt ở điều kiện 121°C sau 20 phút (Fasanella, 2003). Độc lực của B. anthracis được tạo thành bởi 2 yếu tố chính đó là ngoại độc tố và protein vỏ.
Ngoại độc tố của B. anthracis hợp thành từ 3 yếu tố riêng biệt được mã hóa bởi plasmid pXO1. Yếu tố gây phù làm ức chế chức năng của bạch cầu đa nhân 6 trung tính, yếu tố bảo vệ giúp độc tố xâm nhập vào tế bào chủ và yếu tố gây chết làm tăng hoạt hóa đại thực bào, hoạt hóa quá trình đốt oxy, giải phóng cytokin, bất hoạt protein kinase (Lê Thu Hồng, 2011; Jang, 2011). Protein vỏ có bản chất là chuỗi trùng hợp axit poly-D-glutamic mà sự tổng hợp của nó liên quan đến sự xuất hiện của plasmid pXO2.
Plasmid này có thể truyền từ loài có khả năng hình thành vỏ sang loài không có khả năng này (Jang, 2011; Lê Thu Hồng, 2011; Christine, 2015). Những chủng không có khả năng hình thành vỏ cũng mất khả năng gây bệnh và thường được dùng để chế tạo vắc xin (Okinaka, 2014). Bản thân protein vỏ không gây độc nhưng có chức năng bảo vệ vi khuẩn do có khả năng chống lại phức hợp bổ thể và hiện tượng thực bào của bạch cầu. Vỏ của vi khuẩn có thể được hình thành ở động vật mắc bệnh hoặc trên môi trường nuôi cấy ở điều kiện khí trường CO2 5%, được phát hiện bằng các phương pháp như: Nhuộm mực tàu, kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang.
Đây cũng là những phương pháp để phân biệt B. thuringiensis bởi chúng đều không có khả năng tổng hợp vỏ. Với những chủng B. anthracis không có plasmid pXO2, thành tế bào xuất hiện lớp S-layer (Surface layer), gồm 2 loại protein là EA1 (Extractable Antigen 1- Kháng nguyên có thể tách chiết) và Sap (Surface array protein- Protein bề mặt), được mã hóa bởi các gen trên nhiễm sắc thể.
Đây là một dạng siêu cấu trúc xuất hiện phổ biến ở một số đơn bào nguyên thủy và các vi khuẩn khác. Lớp S-layer được cho là có vai trò quan trọng trong mối liên hệ giữa vi khuẩn và môi trường bên ngoài, đảm bảo hình dạng vi khuẩn và là nơi gắn kết của các phage. Ngoài ra, S-layer còn có vai trò giúp vi khuẩn chống lại tác động của bổ thể và thay đổi khả năng tiếp cận của đại thực bào vật chủ (Fouet, 1999). Đặc điểm hệ gen Hệ gen của B.
anthracis gồm 1 nhiễm sắc thể dạng vòng và 2 plasmid độc lực là pXO1, pXO2. Hệ gen với hàm lượng nucleotide AT cao, GC chỉ chiếm khoảng 35%. Điều này cho thấy DNA của B. anthracis có nhiệt độ nóng chảy thấp hơn các loài khác.
Các plasmid tương đối lớn và mã hóa cho nhiều gen khác nhau, 7 nhưng quan trọng nhất là các gen mã hóa cho ngoại độc tố và protein vỏ. Plasmid pXO1 chứa các gen độc tố quan trọng là pagA, lef và cyaA. Plasmid pXO2 mang các gen tổng hợp protein vỏ và cần thiết cho tính độc đầy đủ của B. Nhiễm sắc thể Một trong những chủng được nghiên cứu đầy đủ nhất là B.
anthracis Ames, bởi chính dòng Ames được sử dụng trong cuộc tấn công khủng bố bằng bào tử than ở Mỹ năm 2001. Nhiễm sắc thể của B. anthracis Ames có kích thước 5.508 gen mã hóa protein liên quan đến khả năng tồn tại, trao đổi chất của B. anthracis cũng như các gen quy định đặc tính sinh học (Klee, 2010).
Trong đó, có 33 gen RNA ribosome (23S, 16S và 5S) sắp xếp trên 11 operon và cùng với 95 gen RNA vận chuyển. Nhiễm sắc thể chiếm khoảng 95% hệ gen, còn lại là 2 plasmid độc lực (pXO1 = 181.677 bp, 3 bản sao/ tế bào; pXO2 = 94.829 bp, 2 bản sao/ tế bào) (Straub, 2013). anthracis Ames này chỉ khác biệt một vài nucleotide so với chủng tổ tiên B. anthracis Ames Ancestor, có kích thước nhiễm sắc thể 5.677 bp và pXO2 94.
Đồng thời, khi so sánh một chủng khác là B. anthracis Ames Ancestor cho thấy chúng có độ tương đồng 99,68% về nucleotide (trong đó, nhiễm sắc thể 99,69%; pXO1 99,57%; pXO2 99,58%) và 99,87% về axit amin (Read, 2003; Chun, 2012). Trên nhiễm sắc thể của B. anthracis, các gen đặc trưng thường dùng cho chẩn đoán như gyrA, vrrA, Ba813, SG-850 và rpoB.
Trong các gen đặc trưng trên, gen vrrA (variable repeat region A) mã hóa cho protein glutamine, khối lượng phân tử khoảng 30 kDa (Keim, 1999), vrrA có ở hầu hết các chủng B. anthracis và ít khi bị biến đổi hoặc mất đi trong tự nhiên cũng như nuôi cấy (Jackson, 1997; Perdue, 2003). Vì vậy, vrrA chính là gen phù hợp để xác định B. Việc tổng hợp nên protein của các khung đọc mở có liên quan tới các trình tự chèn.
Các trình tự chèn này có thể gắn tự do vào bất kì vị trí nào trên hệ gen vi khuẩn. Hoạt động gắn và tách khỏi hệ gen không phụ thuộc vào thông tin di truyền 8 trên nhiễm sắc thể. Khi gắn vào vị trí mới, chúng làm cho đoạn gen gắn vào bị mất chức năng. Đặc điểm hệ gen của chủng B.
anthracis Ames Đặc điểm Nhiễm sắc thể pXO1 pXO2 Kích thước (bp) 5.829 Số lượng gen 5.508 217 113 Tỷ lệ replicon mã hóa (%) 84,3 77,1 76,2 Kích thước gen trung bình 800 645 639 (nucleotide) Tỷ lệ G+C (%) 35,4 32,5 33,0 Số rRNA operon 11 0 0 tRNAs 95 0 0 sRNAs 3 2 0 Số gen phage 62 0 0 Số gen transposon 18 15 6 Số khung đọc bị phá vỡ 37 5 7 Số gen chức năng 2.762 65 38 Số gen hypothetical bảo tồn 1.212 22 19 Số gen chưa biết chức năng 657 8 5 Số gen hypothetical 877 122 51 (Nguồn: Read, 2003) Plasmid Toàn bộ độc lực của B. anthracis nằm trên 2 plasmid là pXO1 và pXO2. Plasmid pXO1 có khối lượng 110 MDa, kích thước khoảng 182 kb, gồm 217 gen, tỷ lệ GC là 32,5%. Trên plasmid pXO1 có 143 khung đọc mở, trong đó gần 70% ORF mã hóa cho protein không rõ chức năng, 11 ORF được dự đoán là mã hóa cho protein cấu trúc.
Hầu hết chức năng của plasmid này được quy định bởi một “đảo gây bệnh” PAI (Pathogenicity Island), nằm ở vị trí từ 117.013 trên plasmid, kích thước 44,8 kb, tỷ lệ nucleotide GC là 30% và được giới hạn bởi 2 đoạn chèn IS1627 ở mỗi đầu. Đây là vùng chứa tất cả các gen mã hóa cho protein 9 độc tố của pXO1 như gen pagA, cya, lef, gen điều hòa atxA và gen mã hóa toiposomerase (topA) (Okinaka, 1999; Pannucci, 2002). Trong đó, gen pagA kích thước 2.295 bp, mã hóa kháng nguyên bảo vệ PA (Protective Antigen) có vai trò rất quan trọng, bởi PA là trung tâm cho hoạt động của các yếu tố gây chết, gây phù của B. Kháng nguyên bảo vệ là môi trường trung gian bắt buộc để chuyển các yếu tố gây chết, gây phù vào trong tế bào vật chủ (Ramisse, 1996; Price, 1999).
Chính vì vậy, sử dụng gen pagA trong chẩn đoán B. anthracis có thể giúp xác định các chủng B. anthracis có khả năng gây độc. Điều này phù hợp với nhiều nghiên cứu của các tác giả gần đây (Safari Foroshani, 2013; Ogawa, 2015; Banada, 2017).
Gen cya kích thước 2.403 bp, mã hóa cho yếu tố gây phù nề EF (Edema Factor). Trong đó, tiểu phần khối lượng phân tử 30 KDa của EF liên kết với PA có ái lực cao giúp EF xâm nhập vào trong nội bào. Tiểu phần còn lại khối lượng phân tử 58 kDa là một adenylyl cyclase phụ thuộc calmodulin (CaM) và hoạt động của nó được điều hòa bởi nồng độ cation Ca2+ sinh lý. Tiểu phần này có thể được chia thành hai đơn vị chức năng, phần khối lượng 43 kDa có vai trò phân hủy adenosine triphosphate (ATP) thành cyclic adenosine monophosphate (cAMP) và phần khối lượng 17 kDa còn lại không có hoạt tính xúc tác nhưng tạo điều kiện để CaM kích hoạt EF (Guo, 2004).
Gen lef kích thước 2.430 bp, mã hóa cho yếu tố gây chết LF (Lethal Factor), gồm một đoạn peptide tín hiệu 33 axit amin và phân tử protein trưởng thành kích thước 776 axit amin, không chứa cystein (khối lượng 90,2 kDa), mà được mã hóa bởi một trình tự nucleotide giàu AT (hàm lượng nucleotide AT khoảng 70%).