Nghiên Cứu Phát Triển Kỹ Thuật Multiplex PCR Để Xác Định Nhanh Bacillus Anthracis và Yersinia Pestis

Luận án tiến sĩ nghiên cứu phát triển kỹ thuật Multiplex PCR xác định nhanh đồng thời Bacillus anthracis và Yersinia pestis, ứng dụng trong chẩn đoán bệnh truyền nhiễm.

• Tác giả: Đinh Thị Thu Hằng
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Thái Sơn
• Trường học: Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam, Viện Công Nghệ Sinh Học
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Nghiên cứu phát triển kỹ thuật multiplex PCR xác định nhanh đồng thời Bacillus anthracis và Yersinia pestis
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• 1. MỞ ĐẦU
• 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN
• 2.1.1. Tổng quan về vi khuẩn B.
• 2.1.2. Tổng quan về vi khuẩn Y. pestis và vũ khí sinh học
• 2.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH B.
• 2.2.1. Các phương pháp vi sinh truyền thống
• 2.2.2. Các phương pháp xác định sinh hóa
• 2.2.3. Các phương pháp xác định dựa trên ái lực
• 2.2.4. Các phương pháp xác định dựa trên axit nucleic
• 2.3. KIỂM ĐỊNH KIT mPCR CHẨN ĐOÁN
• 2.3.1. Kiểm định kit PCR chẩn đoán trên thế giới
• 2.3.2. Kiểm định kit mPCR chẩn đoán B. pestis ở Việt Nam
• 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
• 3.1.1. Các chủng vi khuẩn, plasmid
• 3.1.2. Sinh phẩm, hóa chất
• 3.1.3. Các máy, thiết bị nghiên cứu
• 3.1.4. Địa điểm nghiên cứu
• 3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.2.1. Thiết kế nghiên cứu
• 3.2.2. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu
• 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 4.1. NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ KỸ THUẬT mPCR XÁC ĐỊNH NHANH ĐỒNG THỜI
• 4.1.1. Nghiên cứu thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho mPCR
• 4.1.2. Nghiên cứu thiết kế kỹ thuật mPCR
• 4.1.3. Nghiên cứu tối ưu kỹ thuật mPCR xác định đồng thời B.
• 4.1.4. Nghiên cứu thiết kế chứng nội tại tái tổ hợp trong kỹ thuật mPCR
• 4.1.5. Chế tạo kit mPCR xác định đồng thời B.
• 4.2. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÁT HIỆN CỦA KỸ THUẬT mPCR TRÊN CÁC BỘ MẪU CHUẨN VÀ CÁC CHỦNG PHÂN LẬP
• 4.2.1. Đánh giá khả năng phát hiện của kỹ thuật mPCR trên các bộ mẫu chuẩn
• 4.2.2. Đánh giá khả năng phát hiện của kỹ thuật mPCR trên các chủng phân lập
• 4.2.3. Kiểm định bộ kit BaYp-mPCR chẩn đoán B.
• 5. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 5.1. THIẾT KẾ KỸ THUẬT mPCR XÁC ĐỊNH NHANH ĐỒNG THỜI B.
• 5.1.1. Thiết kế, tối ưu kỹ thuật mPCR xác định đồng thời B.
• 5.1.2. Chứng nội tại trong mPCR xác định đồng thời B.
• 5.2. KHẢ NĂNG PHÁT HIỆN CỦA KỸ THUẬT mPCR TRÊN CÁC BỘ MẪU CHUẨN VÀ CÁC CHỦNG PHÂN LẬP
• 5.2.1. Khả năng phát hiện của kỹ thuật mPCR trên các bộ mẫu chuẩn
• 5.2.2. Khả năng phát hiện của kỹ thuật mPCR trên các chủng phân lập
• 6. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• NHỮNG CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Phát triển kỹ thuật Multiplex PCR

Luận án tập trung vào phát triển kỹ thuật Multiplex PCR để xác định nhanh đồng thời hai loại vi khuẩn nguy hiểm là Bacillus Anthracis và Yersinia Pestis. Kỹ thuật này sử dụng PCR đa mồi để khuếch đại đồng thời các gen đặc trưng của cả hai vi khuẩn, bao gồm gen vrrA, pagA, capA của Bacillus Anthracis và gen ypo2088, pla, caf1 của Yersinia Pestis. Điều này giúp khắc phục hạn chế của các phương pháp truyền thống, vốn chỉ phát hiện một loại vi khuẩn tại một thời điểm. Kỹ thuật sinh học này không chỉ tăng độ nhạy và độ đặc hiệu mà còn rút ngắn thời gian chẩn đoán, phù hợp với yêu cầu cấp bách trong phòng chống dịch bệnh và khủng bố sinh học.

1.1. Thiết kế và tối ưu hóa kỹ thuật

Quá trình thiết kế kỹ thuật Multiplex PCR bao gồm việc lựa chọn và tối ưu hóa các cặp mồi đặc hiệu cho từng gen đích. Các yếu tố như nhiệt độ gắn mồi, nồng độ MgCl2, và dNTPs được điều chỉnh để đảm bảo hiệu quả khuếch đại tối ưu. Kết quả cho thấy, kỹ thuật này có thể phát hiện đồng thời cả hai vi khuẩn với độ nhạy cao, ngay cả ở nồng độ DNA thấp. Điều này chứng minh tính khả thi và hiệu quả của phương pháp phân tử trong chẩn đoán bệnh truyền nhiễm.

1.2. Chứng nội tại trong Multiplex PCR

Để đảm bảo độ chính xác của kết quả, luận án đã thiết kế một chứng nội tại (Internal Control - IC) được khuếch đại cùng lúc với các gen đích. Chứng nội tại này giúp xác minh quá trình tách chiết DNA và khuếch đại PCR diễn ra thành công, tránh hiện tượng âm tính giả. Đây là một bước tiến quan trọng trong việc nâng cao độ tin cậy của kỹ thuật PCR trong chẩn đoán bệnh.

II. Ứng dụng thực tiễn của kỹ thuật

Luận án không chỉ dừng lại ở việc phát triển kỹ thuật mà còn đánh giá khả năng ứng dụng thực tiễn của Multiplex PCR trong chẩn đoán bệnh. Kỹ thuật này được thử nghiệm trên các bộ mẫu chuẩn và các chủng vi khuẩn phân lập từ thực địa. Kết quả cho thấy, kỹ thuật PCR đa mồi có thể phát hiện chính xác cả Bacillus Anthracis và Yersinia Pestis với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, đáp ứng yêu cầu chẩn đoán nhanh trong các tình huống khẩn cấp.

2.1. Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu

Luận án đã tiến hành đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của Multiplex PCR trên các bộ mẫu chuẩn. Kết quả cho thấy, kỹ thuật này có thể phát hiện Bacillus Anthracis và Yersinia Pestis ở nồng độ DNA thấp, với giới hạn phát hiện lần lượt là 10^2 và 10^3 bản sao DNA. Điều này chứng minh khả năng ứng dụng rộng rãi của kỹ thuật sinh học trong chẩn đoán bệnh truyền nhiễm.

2.2. Kiểm định bộ kit chẩn đoán

Luận án cũng phát triển một bộ kit chẩn đoán dựa trên Multiplex PCR, bao gồm các thành phần như mồi, enzyme, và hướng dẫn sử dụng. Bộ kit này được kiểm định trên các chủng vi khuẩn phân lập từ thực địa, cho kết quả chính xác và ổn định. Đây là một bước tiến quan trọng trong việc ứng dụng công nghệ sinh học vào thực tiễn chẩn đoán và phòng chống dịch bệnh.

III. Ý nghĩa và đóng góp của luận án

Luận án đã đóng góp quan trọng vào việc phát triển kỹ thuật Multiplex PCR để xác định nhanh Bacillus Anthracis và Yersinia Pestis, hai vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm. Kỹ thuật này không chỉ nâng cao hiệu quả chẩn đoán mà còn giảm thiểu thời gian và chi phí so với các phương pháp truyền thống. Đây là một bước tiến quan trọng trong lĩnh vực chẩn đoán bệnh truyền nhiễm và phòng chống khủng bố sinh học, đặc biệt trong bối cảnh dịch bệnh và các mối đe dọa sinh học ngày càng gia tăng.

3.1. Đóng góp khoa học

Luận án là công trình đầu tiên tại Việt Nam thành công trong việc phát triển kỹ thuật Multiplex PCR để xác định đồng thời hai vi khuẩn nguy hiểm. Kỹ thuật này đã được tối ưu hóa và kiểm định chặt chẽ, mang lại kết quả chính xác và đáng tin cậy. Đây là một đóng góp quan trọng cho ngành vi sinh vật học và công nghệ sinh học tại Việt Nam.

3.2. Ứng dụng thực tiễn

Kỹ thuật Multiplex PCR được phát triển trong luận án có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm chẩn đoán, đặc biệt trong các tình huống khẩn cấp như dịch bệnh hoặc khủng bố sinh học. Bộ kit chẩn đoán được phát triển từ kỹ thuật này cũng có thể được sản xuất và phân phối rộng rãi, góp phần nâng cao năng lực chẩn đoán và phòng chống dịch bệnh tại Việt Nam.

Nội dung chính

This request was blocked by Gemini's filters. They can occasionally trigger by mistake on safe coding, security, or biology-related queries. Please try rephrasing your prompt. You can send feedback or read more about our policies here.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN B. Tổng quan về vi khuẩn B. Đặc điểm sinh học B.

anthracis là trực khuẩn thuộc chi Bacillus, họ Bacillaceae. Chi Bacillus gồm các vi khuẩn Gram dương sinh bào tử, đa số không gây bệnh, một số gây nhiễm trùng nhiễm độc thức ăn (Bacillus cereus), một số có lợi cho con người (Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides). Đặc điểm hình thái, tính chất sinh lý, sinh hoá, tính chất nuôi cấy của các loài thuộc chi Bacillus rất giống nhau. anthracis có đặc điểm khác biệt với các loài trực khuẩn hiếu khí sinh bào tử khác, đó là có plasmid pXO1 mã hóa cho ngoại độc tố và plasmid pXO2 mã hoá protein vỏ.

anthracis hình thẳng, hai đầu vuông, kích thước từ 11,51,58 µm, thường xếp thành từng chuỗi dài (Hình 1. Ở ngoại cảnh hoặc trong môi trường nuôi cấy, vi khuẩn hình thành bào tử nằm giữa thân và không làm thay đổi hình dạng tế bào. Trên động vật bị bệnh hoặc môi trường nuôi cấy đặc biệt, vi khuẩn có vỏ, không di động (Lê Thu Hồng, 2011; Christine, 2015). anthracis trên tiêu bản nhuộm Gram từ bệnh phẩm máu (Nguồn: Christine, 2015) 5 B.

anthracis dễ sinh trưởng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, nhiệt độ thích hợp là 37C, pH 6,9 - 7,0. Trên môi trường thạch thường, vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc dạng R (Rough - dạng xù xì), đường kính 4 - 5 mm, màu trắng ngà, bờ không đều, rất dai, bám chặt vào bề mặt môi trường. Trên môi trường thạch máu cừu, vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc không làm tan máu, khuẩn lạc khi được phóng đại vài chục lần có hình thể như búi tóc xoăn hoặc bờm sư tử (Hình 1. Vi khuẩn mọc không làm đục trên môi trường lỏng, tạo cặn như bông lắng xuống đáy, lắc không tan.

Tính chất lên men đường của B. anthracis bao gồm: Lên men không sinh hơi với các đường glucose, manitol, saccarose, không lên men đường salicin, làm lỏng gelatin, đông huyết tương, không mọc trên môi trường thạch Mac Conkey (Geo, 2013). anthracis trên môi trường thạch máu cừu (Nguồn: Christine, 2015) Thể sinh dưỡng của B. anthracis có sức đề kháng không cao, bị diệt ở điều kiện nhiệt độ 60°C trong 30 phút, ở 100°C trong 5 phút và những chất khử trùng thông thường.

Thể bào tử có sức đề kháng rất cao, tồn tại trong điều kiện tự nhiên nhiều năm, có thể tới vài chục năm mà vẫn còn khả năng gây bệnh (Geo, 2013). Tuy nhiên, bào tử có thể bị phá hủy bởi hấp ướt ở điều kiện 121°C sau 20 phút (Fasanella, 2003). Độc lực của B. anthracis được tạo thành bởi 2 yếu tố chính đó là ngoại độc tố và protein vỏ.

Ngoại độc tố của B. anthracis hợp thành từ 3 yếu tố riêng biệt được mã hóa bởi plasmid pXO1. Yếu tố gây phù làm ức chế chức năng của bạch cầu đa nhân 6 trung tính, yếu tố bảo vệ giúp độc tố xâm nhập vào tế bào chủ và yếu tố gây chết làm tăng hoạt hóa đại thực bào, hoạt hóa quá trình đốt oxy, giải phóng cytokin, bất hoạt protein kinase (Lê Thu Hồng, 2011; Jang, 2011). Protein vỏ có bản chất là chuỗi trùng hợp axit poly-D-glutamic mà sự tổng hợp của nó liên quan đến sự xuất hiện của plasmid pXO2.

Plasmid này có thể truyền từ loài có khả năng hình thành vỏ sang loài không có khả năng này (Jang, 2011; Lê Thu Hồng, 2011; Christine, 2015). Những chủng không có khả năng hình thành vỏ cũng mất khả năng gây bệnh và thường được dùng để chế tạo vắc xin (Okinaka, 2014). Bản thân protein vỏ không gây độc nhưng có chức năng bảo vệ vi khuẩn do có khả năng chống lại phức hợp bổ thể và hiện tượng thực bào của bạch cầu.