Nghiên Cứu Phát Triển Kỹ Thuật Multiplex PCR Để Xác Định Nhanh Bacillus Anthracis và Yersinia Pestis

• Tác giả: Đinh Thị Thu Hằng
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Thái Sơn
• Trường học: Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam, Viện Công Nghệ Sinh Học
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Nghiên cứu phát triển kỹ thuật multiplex PCR xác định nhanh đồng thời Bacillus anthracis và Yersinia pestis
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• 1. MỞ ĐẦU
• 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN
• 2.1.1. Tổng quan về vi khuẩn B.
• 2.1.2. Tổng quan về vi khuẩn Y. pestis và vũ khí sinh học
• 2.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH B.
• 2.2.1. Các phương pháp vi sinh truyền thống
• 2.2.2. Các phương pháp xác định sinh hóa
• 2.2.3. Các phương pháp xác định dựa trên ái lực
• 2.2.4. Các phương pháp xác định dựa trên axit nucleic
• 2.3. KIỂM ĐỊNH KIT mPCR CHẨN ĐOÁN
• 2.3.1. Kiểm định kit PCR chẩn đoán trên thế giới
• 2.3.2. Kiểm định kit mPCR chẩn đoán B. pestis ở Việt Nam
• 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
• 3.1.1. Các chủng vi khuẩn, plasmid
• 3.1.2. Sinh phẩm, hóa chất
• 3.1.3. Các máy, thiết bị nghiên cứu
• 3.1.4. Địa điểm nghiên cứu
• 3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.2.1. Thiết kế nghiên cứu
• 3.2.2. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu
• 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 4.1. NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ KỸ THUẬT mPCR XÁC ĐỊNH NHANH ĐỒNG THỜI
• 4.1.1. Nghiên cứu thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho mPCR
• 4.1.2. Nghiên cứu thiết kế kỹ thuật mPCR
• 4.1.3. Nghiên cứu tối ưu kỹ thuật mPCR xác định đồng thời B.
• 4.1.4. Nghiên cứu thiết kế chứng nội tại tái tổ hợp trong kỹ thuật mPCR
• 4.1.5. Chế tạo kit mPCR xác định đồng thời B.
• 4.2. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÁT HIỆN CỦA KỸ THUẬT mPCR TRÊN CÁC BỘ MẪU CHUẨN VÀ CÁC CHỦNG PHÂN LẬP
• 4.2.1. Đánh giá khả năng phát hiện của kỹ thuật mPCR trên các bộ mẫu chuẩn
• 4.2.2. Đánh giá khả năng phát hiện của kỹ thuật mPCR trên các chủng phân lập
• 4.2.3. Kiểm định bộ kit BaYp-mPCR chẩn đoán B.
• 5. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 5.1. THIẾT KẾ KỸ THUẬT mPCR XÁC ĐỊNH NHANH ĐỒNG THỜI B.
• 5.1.1. Thiết kế, tối ưu kỹ thuật mPCR xác định đồng thời B.
• 5.1.2. Chứng nội tại trong mPCR xác định đồng thời B.
• 5.2. KHẢ NĂNG PHÁT HIỆN CỦA KỸ THUẬT mPCR TRÊN CÁC BỘ MẪU CHUẨN VÀ CÁC CHỦNG PHÂN LẬP
• 5.2.1. Khả năng phát hiện của kỹ thuật mPCR trên các bộ mẫu chuẩn
• 5.2.2. Khả năng phát hiện của kỹ thuật mPCR trên các chủng phân lập
• 6. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• NHỮNG CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

I. Phát triển kỹ thuật Multiplex PCR

Luận án tập trung vào phát triển kỹ thuật Multiplex PCR để xác định nhanh đồng thời hai loại vi khuẩn nguy hiểm là Bacillus Anthracis và Yersinia Pestis. Kỹ thuật này sử dụng PCR đa mồi để khuếch đại đồng thời các gen đặc trưng của cả hai vi khuẩn, bao gồm gen vrrA, pagA, capA của Bacillus Anthracis và gen ypo2088, pla, caf1 của Yersinia Pestis. Điều này giúp khắc phục hạn chế của các phương pháp truyền thống, vốn chỉ phát hiện một loại vi khuẩn tại một thời điểm. Kỹ thuật sinh học này không chỉ tăng độ nhạy và độ đặc hiệu mà còn rút ngắn thời gian chẩn đoán, phù hợp với yêu cầu cấp bách trong phòng chống dịch bệnh và khủng bố sinh học.

1.1. Thiết kế và tối ưu hóa kỹ thuật

Quá trình thiết kế kỹ thuật Multiplex PCR bao gồm việc lựa chọn và tối ưu hóa các cặp mồi đặc hiệu cho từng gen đích. Các yếu tố như nhiệt độ gắn mồi, nồng độ MgCl2, và dNTPs được điều chỉnh để đảm bảo hiệu quả khuếch đại tối ưu. Kết quả cho thấy, kỹ thuật này có thể phát hiện đồng thời cả hai vi khuẩn với độ nhạy cao, ngay cả ở nồng độ DNA thấp. Điều này chứng minh tính khả thi và hiệu quả của phương pháp phân tử trong chẩn đoán bệnh truyền nhiễm.

1.2. Chứng nội tại trong Multiplex PCR

Để đảm bảo độ chính xác của kết quả, luận án đã thiết kế một chứng nội tại (Internal Control - IC) được khuếch đại cùng lúc với các gen đích. Chứng nội tại này giúp xác minh quá trình tách chiết DNA và khuếch đại PCR diễn ra thành công, tránh hiện tượng âm tính giả. Đây là một bước tiến quan trọng trong việc nâng cao độ tin cậy của kỹ thuật PCR trong chẩn đoán bệnh.

II. Ứng dụng thực tiễn của kỹ thuật

Luận án không chỉ dừng lại ở việc phát triển kỹ thuật mà còn đánh giá khả năng ứng dụng thực tiễn của Multiplex PCR trong chẩn đoán bệnh. Kỹ thuật này được thử nghiệm trên các bộ mẫu chuẩn và các chủng vi khuẩn phân lập từ thực địa. Kết quả cho thấy, kỹ thuật PCR đa mồi có thể phát hiện chính xác cả Bacillus Anthracis và Yersinia Pestis với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, đáp ứng yêu cầu chẩn đoán nhanh trong các tình huống khẩn cấp.

2.1. Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu

Luận án đã tiến hành đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của Multiplex PCR trên các bộ mẫu chuẩn. Kết quả cho thấy, kỹ thuật này có thể phát hiện Bacillus Anthracis và Yersinia Pestis ở nồng độ DNA thấp, với giới hạn phát hiện lần lượt là 10^2 và 10^3 bản sao DNA. Điều này chứng minh khả năng ứng dụng rộng rãi của kỹ thuật sinh học trong chẩn đoán bệnh truyền nhiễm.

2.2. Kiểm định bộ kit chẩn đoán

Luận án cũng phát triển một bộ kit chẩn đoán dựa trên Multiplex PCR, bao gồm các thành phần như mồi, enzyme, và hướng dẫn sử dụng. Bộ kit này được kiểm định trên các chủng vi khuẩn phân lập từ thực địa, cho kết quả chính xác và ổn định. Đây là một bước tiến quan trọng trong việc ứng dụng công nghệ sinh học vào thực tiễn chẩn đoán và phòng chống dịch bệnh.

III. Ý nghĩa và đóng góp của luận án

Luận án đã đóng góp quan trọng vào việc phát triển kỹ thuật Multiplex PCR để xác định nhanh Bacillus Anthracis và Yersinia Pestis, hai vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm. Kỹ thuật này không chỉ nâng cao hiệu quả chẩn đoán mà còn giảm thiểu thời gian và chi phí so với các phương pháp truyền thống. Đây là một bước tiến quan trọng trong lĩnh vực chẩn đoán bệnh truyền nhiễm và phòng chống khủng bố sinh học, đặc biệt trong bối cảnh dịch bệnh và các mối đe dọa sinh học ngày càng gia tăng.

3.1. Đóng góp khoa học

Luận án là công trình đầu tiên tại Việt Nam thành công trong việc phát triển kỹ thuật Multiplex PCR để xác định đồng thời hai vi khuẩn nguy hiểm. Kỹ thuật này đã được tối ưu hóa và kiểm định chặt chẽ, mang lại kết quả chính xác và đáng tin cậy. Đây là một đóng góp quan trọng cho ngành vi sinh vật học và công nghệ sinh học tại Việt Nam.

3.2. Ứng dụng thực tiễn

Kỹ thuật Multiplex PCR được phát triển trong luận án có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm chẩn đoán, đặc biệt trong các tình huống khẩn cấp như dịch bệnh hoặc khủng bố sinh học. Bộ kit chẩn đoán được phát triển từ kỹ thuật này cũng có thể được sản xuất và phân phối rộng rãi, góp phần nâng cao năng lực chẩn đoán và phòng chống dịch bệnh tại Việt Nam.