Luận văn thạc sĩ xây dựng phương pháp phát hiện một số chủng human papilloma virus nguy cơ cao gây ung thư cổ tử cung ở việt nam bằng kỹ thuật realtime pcr

Luận văn thạc sĩ kỹ thuật phân tích xây dựng phương pháp phát hiện một số chủng human papilloma virus nguy cơ cao gây ung thư cổ tử, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề xuất

• Tác giả: Nguyễn Thanh Tâm
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Vân Trang
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Xây Dựng Phương Pháp Phát Hiện Một Số Chủng Human Papillomavirus Nguy Cơ Cao Gây Ung Thư Cổ Tử Cung Ở Việt Nam Bằng Kỹ Thuật Realtime PCR
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• BẢNG KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Giới thiệu về Human Papillomavirus
• 1.2. Đặc điểm hình thái của HPV
• 1.3. Đặc điểm sinh học phân tử
• 1.4. Phân loại HPV
• 1.5. HPV và ung thư cổ tử cung
• 1.5.1. Tình hình nhiễm HPV tại Việt Nam và trên thế giới
• 1.5.2. Đường lây truyền của HPV
• 1.5.3. Các bệnh lý thường gặp do HPV, cách phòng nhiễm và điều trị
• 1.5.4. Chu kỳ nhân lên và cơ chế gây bệnh của HPV
• 1.5.5. Các phương pháp phát hiện HPV
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Sinh phẩm và vật tư tiêu hao
• 2.3. Máy móc và thiết bị
• 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Xây dựng kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV 16, 18 và 33/52
• 2.4.2. Tạo chứng dương và xác định giới hạn phát hiện của kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV 16, 18 và 33/52
• 2.4.3. Thẩm định phương pháp phát hiện chủng HPV16, 18, và 33/52
• 2.5. Nội dung thực hiện
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Xây dựng kỹ thuật Realtime PCR phát hiện các chủng HPV 16, 18 và 33/52
• 3.1.1. Kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe
• 3.1.2. Kỹ thuật realtime PCR đa cặp primer và probe
• 3.2. Tạo chứng dƣơng và xác định giới hạn phát hiện của kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV 16, 18 và 33/52
• 3.2.1. Khuếch đại trình tự đích
• 3.2.2. Nhân dòng gen tạo chứng dương
• 3.2.3. Xác định giới hạn phát hiện của kỹ thuật Realtime PCR
• 3.3. Thẩm định phƣơng pháp phát hiện các chủng HPV16, 18 và 33/52
• 3.3.1. Xác định độ chính xác của kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV16, 18 và 33/52
• 3.3.2. Xác định độ chụm (hệ số tái lập và hệ số lặp lại) của kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV16, 18 và 33/52
• 3.3.2.1. Xác định hệ số lặp lại của phương pháp
• 3.3.2.2. Xác định hệ số tái lập của phương pháp
• 3.3.3. Xác định độ đặc hiệu của kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV16, 18 và 33/52
• 3.3.4. Xác định độ nhạy của kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV16, 18 và 33/52
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về phát hiện HPV nguy cơ cao gây ung thư cổ tử cung

Human Papillomavirus (HPV) là một trong những tác nhân chính gây ra ung thư cổ tử cung (UTCTC). Nghiên cứu cho thấy rằng HPV nguy cơ cao, đặc biệt là các chủng HPV 16 và 18, có liên quan chặt chẽ đến sự phát triển của UTCTC. Việc phát hiện sớm HPV có thể giúp giảm thiểu tỷ lệ mắc bệnh và tử vong do UTCTC. Các phương pháp phát hiện HPV hiện nay bao gồm xét nghiệm tế bào và kỹ thuật PCR, trong đó kỹ thuật Realtime PCR đang được áp dụng rộng rãi nhờ độ nhạy và độ chính xác cao.

1.1. Giới thiệu về HPV và mối liên hệ với ung thư cổ tử cung

HPV là một nhóm virus có kích thước nhỏ, không vỏ, gây ra nhiều bệnh lý khác nhau. Trong đó, HPV nguy cơ cao có khả năng gây ra UTCTC. Theo Tổ chức Y tế Thế giới, UTCTC là loại ung thư phổ biến thứ hai ở phụ nữ. Việc phát hiện HPV sớm giúp ngăn ngừa sự phát triển của ung thư.

1.2. Tình hình nhiễm HPV tại Việt Nam

Tại Việt Nam, tỷ lệ nhiễm HPV cao, đặc biệt ở các tỉnh thành lớn. Theo thống kê, có khoảng 5000 ca mắc mới UTCTC mỗi năm, trong đó phần lớn là do nhiễm HPV. Việc nâng cao nhận thức và thực hiện các biện pháp sàng lọc là rất cần thiết.

II. Vấn đề và thách thức trong phát hiện HPV nguy cơ cao

Mặc dù có nhiều phương pháp phát hiện HPV, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong việc áp dụng rộng rãi. Chi phí cho các bộ xét nghiệm còn cao, và không phải ai cũng có thể tiếp cận được. Hơn nữa, việc phát hiện HPV thường diễn ra ở giai đoạn muộn, khi bệnh đã tiến triển. Điều này đòi hỏi cần có các giải pháp hiệu quả hơn để phát hiện sớm.

2.1. Chi phí và khả năng tiếp cận xét nghiệm HPV

Chi phí cho các bộ xét nghiệm HPV hiện nay còn cao, khiến nhiều phụ nữ không thể tiếp cận. Điều này dẫn đến việc phát hiện bệnh ở giai đoạn muộn, làm giảm khả năng điều trị hiệu quả.

2.2. Nhận thức và giáo dục cộng đồng về HPV

Nhiều người vẫn chưa hiểu rõ về HPV và mối liên hệ của nó với UTCTC. Việc nâng cao nhận thức thông qua các chương trình giáo dục cộng đồng là rất quan trọng để khuyến khích phụ nữ tham gia sàng lọc.

III. Phương pháp phát hiện HPV nguy cơ cao hiệu quả

Kỹ thuật Realtime PCR đã được chứng minh là một trong những phương pháp hiệu quả nhất trong việc phát hiện HPV nguy cơ cao. Phương pháp này cho phép phát hiện nhanh chóng và chính xác các chủng HPV 16, 18 và 33/52. Việc áp dụng kỹ thuật này trong các cơ sở y tế sẽ giúp nâng cao khả năng phát hiện sớm.

3.1. Kỹ thuật Realtime PCR trong phát hiện HPV

Realtime PCR là một kỹ thuật hiện đại cho phép phát hiện và định lượng ADN virus trong mẫu bệnh phẩm. Kỹ thuật này có độ nhạy và độ chính xác cao, giúp phát hiện sớm các chủng HPV nguy cơ cao.

3.2. So sánh các phương pháp phát hiện HPV

Ngoài Realtime PCR, còn có các phương pháp khác như xét nghiệm tế bào và lai phân tử. Tuy nhiên, Realtime PCR vượt trội về độ nhạy và khả năng phát hiện nhiều chủng virus cùng lúc.

IV. Ứng dụng thực tiễn và kết quả nghiên cứu về HPV

Nghiên cứu cho thấy việc áp dụng kỹ thuật Realtime PCR trong phát hiện HPV đã mang lại nhiều kết quả tích cực. Các cơ sở y tế đã có thể phát hiện sớm các trường hợp nhiễm HPV, từ đó có biện pháp điều trị kịp thời. Điều này không chỉ giúp giảm tỷ lệ mắc UTCTC mà còn nâng cao chất lượng cuộc sống cho phụ nữ.

4.1. Kết quả nghiên cứu về hiệu quả của Realtime PCR

Nghiên cứu cho thấy kỹ thuật Realtime PCR có độ nhạy lên đến 95% trong việc phát hiện HPV nguy cơ cao. Điều này cho thấy tiềm năng lớn của phương pháp này trong việc sàng lọc và phát hiện sớm UTCTC.

4.2. Ứng dụng thực tiễn trong các cơ sở y tế

Nhiều bệnh viện và phòng khám đã áp dụng kỹ thuật Realtime PCR vào quy trình sàng lọc UTCTC. Điều này không chỉ giúp phát hiện sớm mà còn giảm thiểu chi phí điều trị cho bệnh nhân.

V. Kết luận và tương lai của phát hiện HPV nguy cơ cao

Việc phát hiện HPV nguy cơ cao là rất quan trọng trong việc ngăn ngừa UTCTC. Các phương pháp hiện đại như Realtime PCR đã chứng minh được hiệu quả của mình. Tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu và phát triển các phương pháp mới, đồng thời nâng cao nhận thức cộng đồng về HPV.

5.1. Tầm quan trọng của việc phát hiện sớm HPV

Phát hiện sớm HPV giúp giảm thiểu tỷ lệ mắc UTCTC. Việc nâng cao nhận thức và áp dụng các phương pháp phát hiện hiệu quả là rất cần thiết.

5.2. Hướng đi tương lai trong nghiên cứu HPV

Cần tiếp tục nghiên cứu để phát triển các phương pháp phát hiện HPV hiệu quả hơn, đồng thời cải thiện khả năng tiếp cận cho tất cả phụ nữ, đặc biệt là ở các vùng nông thôn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Human papillomavirus (HPV) là tác nhân thường gặp nhất trong các nhiễm trùng lây truyền qua đường tình dục và là nguyên nhân quan trọng dẫn tới ung thư cổ tử cung (UTCTC), loại ung thư xếp thứ tư trong các loại ung thư mà nữ giới thường mắc phải và xếp thứ hai với nữ giới độ tuổi 15-44[41]. HPV không chỉ có mối liên quan mật thiết với UTCTC mà còn có vai trò quan trọng trong các nguyên nhân dẫn đến ung thư hậu môn, âm đạo, dương vật, ung thư phổi và một số ung thư vùng hầu họng. Đồng thời, HPV còn là nguyên nhân của nhiều bệnh lý lâm sàng trên da và niêm mạc như hạt cơm, sùi mào gà sinh dục-hậu môn, u nhú thanh quản trẻ sơ sinhv.v…[32] Hàng năm trên thế giới ước tính có khoảng 529.000 ca mắc mới UTCTC, tử vong khoảng 275.000 trường hợp, trong đó 85% tổng số các trường hợp bệnh gặp ở những nước đang phát triển[21]. Mỗi năm, Châu Á có thêm khoảng 312.000 bệnh nhân UTCTC, chiếm 59% trường hợp mắc mới trên toàn thế giới – đặc biệt ở khu vực Nam Á và Đông Nam Á, nơi có tỷ lệ nhiễm HPV cao nhất trong châu lục[21, 34].Cùng với sự lây nhiễm HPV trong cộng đồng, UTCTC thực sự trở thành gánh nặng bệnh tật toàn cầu, gây ảnh hưởng nặng nề đến sức khỏe và tâm lý của nữ giới.

Tại Việt Nam, theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới năm 2012, UTCTC hiện đang là loại ung thư chiếm tỷ lệ cao ở nữ giới, xếp thứ 2 trong số các loại ung thư mà nữ giới độ tuổi 15-44 hay mắc phải, với hơn 5000 ca nhiễm mới (tỷ lệ: 8.000 phụ nữ) và tử vong hơn 2000 trường hợp mỗi năm[40]. Điều đặc biệt quan tâm là phần lớn các trường hợp UTCTC thường được phát hiện ở giai đoạn muộn, trong khi quá trình diễn biến từ nhiễm virus đến ung thư thường trải qua thời gian dài. Quá trình tiến triển từ mức dộ loạn sản nhẹ, loạn sản vừa, loạn sản nặng đến ung thư tại chỗ (giai đoạn tổn thương có thể phục hồi) đến giai đoạn ung thư xâm nhập có thể kéo dài từ 10 – 25 năm[22].Đây chính là cơ hội cho việc phát hiện nhiễm HPV, sàng lọc người có nguy cơ mắc ung thư cổ tử cung nhằm giúp quá trình điều trị hiệu quả các tổn thương tiền ung thư và ung thư giai đoạn sớm.Hiện nay ở Việt Nam, xét nghiệm tế bào mô bệnh học (Pap smear) đã được đưa vào thành thường quy trong chương trình sàng lọc UTCTC, các xét nghiệm HPV cũng đã phổ biến tuy nhiên chi phí còn cao đối với các kit chẩn đoán đã thương mại hóavà yêu cầu đảm bảo chất lượng xét nghiệm với các xét nghiệm trong nước[8]. Với tầm quan trọng và ý nghĩa của việc xác định genotype HPV, cũng như 1 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thanh Tâm – K22 xuất phát từ thực tiễn nêu trên, đề tài “Xây dựng phƣơng pháp phát hiện một số chủng Human Papillomavirus có nguy cơ cao gây ung thƣ cổ tử cung ở Việt Nam bằng kỹ thuật Realtime PCR” được thực hiện với mục tiêu sau: 1.

Xây dựng phương pháp phát hiện chủng HPV 16, 18 và 33/52 bằng kỹ thuật multiplex Realtime PCR. Thẩm định phương pháp phát hiện các chủng HPV 16, 18, 33/52 bằng kỹ thuật multiplex realtime PCR trên mẫu dịch quét cổ tử cung. Đề tài nàyđược chúng tôi thực hiện tại phòng Miễn dịch Vắc xin,ViệnVệ sinh Dịch tễ Trung ương. 2 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thanh Tâm – K22 CHƢƠNG1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về Human Papillomavirus Papillomaviruslàcác thành viên trong họ Papillomaviridae, được tìm thấy trong rất nhiều loài động vật có vú trong đó có con người. Các loài vật chủ khác nhau sẽ nhiễm các loại Papillomavirus đặc thù cho loài đó.CácPapillomavirusgây bệnh cho người gọi là Human papillomavirus(HPV).1Đặc điểm hình thái của HPV HPV là nhóm virus có kích thước nhỏ, không vỏ.Hạt virus có đường kính 52- 55nm, vỏ gồm 72 đơn vị capsomer.Mỗi đơn vị capsid gồm một pentamer của protein cấu trúc L1 kết hợp với một protein L2 (protein này là thành phần kháng nguyên được sử dụng trong phản ứng miễn dịch đặc hiệu).Hạt vi rút của HPV[14] Cả hai protein cấu trúc đều do virus tự mã hóa: Protein capsid chính (L1) có kích thước khoảng 55 kDa và chiếm khoảng 80% tổng số protein của virus. Protein capsid phụ (L2) có kích thước khoảng 70 kDa[14].2Đặc điểm sinh học phân tử 1.1 Cấu trúc hệ gen HPV là virus có vật liệu di truyền là ADN, mạch đôi không hoàn chỉnh, tồn tại dạng siêu xoắn hình vòng (circular ds-ADN).ADN của virus liên kết với histone tạo thành cấu trúc phức hợp giống Chromatin (Chromatin-like conplex) nằm trong lớp vỏ capsid protein. 3 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thanh Tâm – K22 Hình 1.Cấu trúc bộgen của Papillomavirus và HPV 16[14] Cấu trúc hệ gen của nhóm Pappillomavirus nói chung tương tự nhau ở các loài vật chủ, tất cả các khung đọc mở ORF (Open Reading Frame) của virus đều trên một chuỗi ADN, điều này có nghĩa là quá trình phiên mã chỉ xảy ra trên một mạch duy nhất.

Hệ gen của HPV có 8 khung đọc mở ORF, có thể chia thành 3 vùng chức năng[26]: 1. Vùng mã hóa sớm (Early region) gồm 6 gen mã hóa, ký hiệu là E1, E2, E4, E5, E6, E7 và các khung đọc mở ORF tương ứng. Sản phẩm của vùng gen này là các protein chức năng giúp cho quá trình nhân lên ADN của virus, gây hiện tượng tăng sinh tế bào và gây biến đổi tế bào, hình thành tế bào bất tử. Vùng mã hóa muộn (Late region) gồm 2 gen mã hóa protein cấu trúc lớp vỏ capsid L1 và L2.

Vùng kiểm soát dài LRC (Long Control Region) hay còn gọi là vùng điều hòa URR (Upstream Regulatory Region) chứa ADN không mã hóa, có chức năng điều hòa quá trình sao chép ADN và quá trình phiên mã. Đây là vùng biến động nhất, chiếm khoảng 10% chiều dài của bộ gen, tương đương 800 đến 1000bp tùy từng genotype khác nhau. Trình tự vùng này gồm: - Trình tự tăng cường là nơi gắn của các yếu tố phiên mã như AP-1, NF1, TEF1, TEF2, YY1. - Promoter bao gồm cấu trúc TATA và vùng khởi đầu phiên mã tổng hợp RNA (P97 ở HPV16 và P105 ở HPV18).

- Điểm khởi đầu sao chép ORI và một số chuỗi gen câm (Silencing gene). 4 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thanh Tâm – K22 1.2Chức năng và sản phẩm của các gen HPV  Chức năng gen E1 HPV là virus sử dụng hoàn toàn các thành phần tế bào chủ để sao chép ADN. Gen E1 là một trong hai vùng gen bảo tồn nhất của HPV (cùng với L1) mã hóa protein chức năng có vai trò cần thiết cho quá trình sao chép ADN và plasmid. Protein E1 gắn vào vị trí khởi đầu của quá trình tái bản (ORI), thực hiện quá trình tháo xoắn ADN (Helicase) và giúp chuổi gen của virus duỗi ra trong quá trình sao chép.

Hoạt động tháo xoắn ADN của E1 không cần ATP. Khi xâm nhập vào trong tế bào, E1 và E2 đóng vai trò quan trọng trong điều chỉnh quá trình sao chép của virus. Protein E2 còn có khả năng gắn với chuỗi ADN đặc hiệu (ở vị trí E2-E2BSs) và protein E1. Tuy nhiên cả hai chức năng của protein E2 đều do gen E1 điều chỉnh.

 Chức năng gen E2 Ngoài chức năng trong sao chép ADN của virus, protein mã hoá bởi gen E2 còn đóng vai trò chủ đạo trong quá trình phiên mã cũng như trong quá trình điều hòa giải mã và duy trì ADN virus ở ngoài NST. Chức năng điều hòa giải mã của E2 được thực hiện do sự gắn kết với E2BSs trong chuỗi gen của virus có ái lực với E2 và những vị trí liên quan này xác định hiệu quả của E2 trong quá trình giải mã Trong hệ gen của nhóm HPV nguy cơ cao (HR-HPV), gen E2 mã hoá cho protein có khả năng ức chế quá trình sao chéo bằng các yếu tố thúc đẩy biểu hiện các gen ở vùng mã hóa sớm của virus, do đó khi nhóm HR-HPV cài gen vào trong NST vật chủ sẽ làm tăng khả năng biểu hiện của gen gây ung thư E6, E7.  Chức năng của protein E1^E4 (quá trình splicing giữa gen E1 và E4) Giống như các protein khác của HPV, protein điều hòa E1^E4 là sản phẩm được tạo ra từ mRNA kết nối chuỗi mã hóa 5 axit amin đầu tiên của E1 và ORF của E4 khi mở vòngdịch chuyển gen E1 và E4. Protein này có chức năng giúp cho quá trình trưởng thành và phóng thích vi rút ra khỏi tế bào mà không làm tan tế bào chủ.

ProteinE1^E4 chứa 3 dạng chính tác động vào chu kỳ sống của vi rút gồm: (1) Dạng gen chứa nhiều leucine ở đầu tận cùng N liên quan đến keratin và cần thiết cho nhân lên của ADN; (2) Vùng chứa nhiều proline ở đoạn trung tâm, chứa vị trí threonine cần thiết cho khoảng nghỉ của chu kỳ tế bào tại giai đoạn G2/M và giải 5 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thanh Tâm – K22 mã của phức hợp cyclinB/cdk1 ở bào tương; (3) Đầu tận cùng C chứa domain đơn dạng kiểu niêm mạc và điều hòa khả năng gen E1^E4 tạo ra sự polimerize, gắn với DEAD-box RNA helicase và tạo ra sự phá vỡ hệ thống sợi keratin[23].  Chức năng của protein mã hoá bởi gen E5 Gen E5 mã hóa cho sản phẩm là protein E5, một protein chuỗi đôi kỵ nước, kích thước nhỏ nằm ở phần màng Golgi và lưới nội chất của tế bào, cần thiết cho quá trình xâm nhập và tồn tại của virus trong tế bào chủ. Protein E5 là yếu tố tác động ngay trong giai đoạn đầu của quá trình xâm nhiễm vào trong tế bào, tạo ra phức hợp với các thụ thể của yếu tố kích thích tăng trưởng và biệt hóa tế bào đồng thời giúp cho virus lẩn trốn đáp ứng miễn dịch của tế bào chủ Mặt khác, protein E5 còn có vai trò trong việc ngặn chặn sự chết theo chu trình (apotosis) của tế bào khi có sự sai hỏng do chính virus gây ra. Khả năng của E5 gây nên sự biến đổi của tế bào do gen E5 có khả năng hoạt hóa receptor của yếu tố phát triển và ức chế ATPase không bào.

 Chức năng gen E6 Gen E6 mã hóa cho protein E6, gồm khoảng 150 acid amin hình thành cấu trúc Cys-X-X-Cys gắn với Zn điều hòa, mã hóa cho khung đọc mở ORF đầu tiên trong chuỗi gen HPV và là một trong những protein gây ung thư chính của HPV.