Luận văn thạc sĩ nghiên cứ phát hiện và định lượng một số đột biến gen ty thể phổ biến bằng real time pcr

Nghiên cứu phát hiện và định lượng đột biến gen ty thể phổ biến bằng phương pháp real time PCR, góp phần nâng cao hiểu biết về di truyền học.

• Tác giả: Phùng Bảo Khánh
• Người hướng dẫn: GS. Phan Tuấn Nghĩa
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên Cứu Phát Hiện Và Định Lượng Một Số Đột Biến Gen Ty Thể Phổ Biến Bằng Real-Time PCR
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Giới thiệu chung về ty thể
• 1.2. Cấu trúc và chức năng của ty thể
• 1.3. Hệ gen ty thể
• 1.4. Đột biến gen ty thể và các bệnh hoặc hội chứng liên quan
• 1.4.1. Đột biến gen ty thể
• 1.4.2. Một số bệnh và hội chứng do đột biến gen ty thể
• 1.5. Các phương pháp phát hiện đột biến gen ty thể
• 1.5.1. Giải trình tự gen
• 1.5.2. Real-time PCR
• 1.5.3. Các phương pháp khác
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Mẫu bệnh phẩm
• 2.2. Các hóa chất, nguyên liệu khác
• 2.3. Máy móc và trang thiết bị
• 2.4. Phương pháp
• 2.4.1. Biến nạp và nuôi cấy tế bào E. coli chứa plasmid mang đoạn gen có và không có đột biến gen ty thể
• 2.4.2. Tách chiết và định lượng DNA
• 2.4.3. Kỹ thuật đa hình phân cắt các đoạn giới hạn kết hợp với PCR (PCR-RFLP)
• 2.4.4. Điện di trên gel agarose và gel polyacylamide
• 2.4.5. Kỹ thuật real-time PCR sử dụng mẫu dò huỳnh quang dạng khóa cầu acid nucleic (LNA)
• 2.4.6. Phương pháp thống kê
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Tạo các mẫu đối chứng cho real-time PCR phát hiện và định lượng 6 đột biến gen ty thể phổ biến A3243G, G3380A, A8344G, T8993C, T8993G, G11778A
• 3.2. Định lượng và kiểm tra độ tinh sạch của plasmid bằng quang phổ kế và điện di trên gel agarose
• 3.3. Kiểm tra sự có mặt của các đoạn gen chèn trong plasmid tái tổ hợp bằng PCR-RFLP
• 3.4. Tạo hỗn hợp phản ứng master mix cho real-time PCR
• 3.4.1. Xác định thành phần thích hợp của master mix
• 3.4.2. Đánh giá độ đặc hiệu của master mix
• 3.4.3. Đánh giá độ nhạy của master mix
• 3.4.4. Xác định thời gian bảo quản của master mix
• 3.5. Điều tra và định lượng một số đột biến gen ty thể phổ biến bằng real-time PCR
• 3.6. Điều tra sự có mặt của đột biến A3243G, G3380A, A8344G, G11778A, T8993G, T8993C ở các bệnh nhân nghi bị bệnh ty thể
• 3.7. Phân tích đột biến A3243G ở các thành viên gia đình bệnh nhân MELAS
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về phát hiện đột biến gen ty thể bằng Real Time PCR

Phát hiện đột biến gen ty thể là một lĩnh vực nghiên cứu quan trọng trong sinh học phân tử. Đột biến gen ty thể có thể gây ra nhiều bệnh lý nghiêm trọng, ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Real-Time PCR là một phương pháp hiện đại, cho phép phát hiện và định lượng các đột biến này một cách nhanh chóng và chính xác. Phương pháp này sử dụng các mẫu dò huỳnh quang để theo dõi quá trình khuếch đại DNA trong thời gian thực, giúp xác định sự hiện diện của các đột biến gen ty thể.

1.1. Giới thiệu về gen ty thể và vai trò của chúng

Gen ty thể (mtDNA) là một phần quan trọng trong hệ gen của tế bào, có vai trò sản xuất năng lượng cho các hoạt động sống. mtDNA có cấu trúc vòng và chứa 37 gen, trong đó có 13 gen mã hóa cho protein và 24 gen mã hóa cho RNA. Đột biến trong mtDNA có thể dẫn đến các bệnh lý nghiêm trọng như hội chứng MELAS, LHON, và MERRF.

1.2. Tại sao cần phát hiện đột biến gen ty thể

Việc phát hiện đột biến gen ty thể là cần thiết để chẩn đoán sớm các bệnh lý liên quan. Đột biến gen ty thể có thể gây ra các triệu chứng lâm sàng phức tạp, do đó việc phát hiện kịp thời giúp cải thiện chất lượng cuộc sống và điều trị hiệu quả hơn.

II. Thách thức trong phát hiện đột biến gen ty thể

Mặc dù có nhiều phương pháp để phát hiện đột biến gen ty thể, nhưng vẫn tồn tại nhiều thách thức. Đầu tiên, độ nhạy và độ đặc hiệu của các phương pháp hiện tại chưa đạt yêu cầu cao. Thứ hai, sự đa dạng của các đột biến gen ty thể trong các quần thể khác nhau cũng gây khó khăn trong việc phát hiện. Cuối cùng, việc phân tích và định lượng các đột biến này đòi hỏi kỹ thuật cao và thiết bị hiện đại.

2.1. Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp hiện tại

Các phương pháp như PCR-RFLP có độ nhạy thấp hơn so với Real-Time PCR. Điều này có thể dẫn đến việc bỏ sót các đột biến quan trọng. Real-Time PCR, với khả năng phát hiện trong thời gian thực, đã khắc phục được nhược điểm này.

2.2. Sự đa dạng của đột biến gen ty thể

Đột biến gen ty thể có thể khác nhau giữa các cá thể và quần thể. Điều này làm cho việc phát hiện và định lượng trở nên phức tạp hơn. Cần có các nghiên cứu sâu hơn để hiểu rõ hơn về sự đa dạng này.

III. Phương pháp Real Time PCR trong phát hiện đột biến gen ty thể

Real-Time PCR là một trong những phương pháp tiên tiến nhất hiện nay để phát hiện đột biến gen ty thể. Phương pháp này cho phép theo dõi quá trình khuếch đại DNA trong thời gian thực, giúp xác định sự hiện diện của các đột biến một cách nhanh chóng và chính xác. Sử dụng các mẫu dò huỳnh quang, Real-Time PCR có thể định lượng chính xác tỷ lệ đột biến trong mẫu.

3.1. Nguyên lý hoạt động của Real Time PCR

Real-Time PCR hoạt động dựa trên nguyên lý khuếch đại DNA thông qua chu trình nhiệt. Mỗi chu trình khuếch đại sẽ làm tăng số lượng bản sao của DNA, và sự phát sáng từ các mẫu dò huỳnh quang sẽ được ghi lại để xác định số lượng bản sao.

3.2. Lợi ích của Real Time PCR so với các phương pháp khác

Real-Time PCR có nhiều lợi ích so với các phương pháp truyền thống như PCR-RFLP. Nó không chỉ nhanh chóng mà còn có độ nhạy và độ chính xác cao hơn, giúp phát hiện các đột biến gen ty thể một cách hiệu quả.

IV. Ứng dụng thực tiễn của Real Time PCR trong nghiên cứu đột biến gen ty thể

Real-Time PCR đã được áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu và chẩn đoán các bệnh lý liên quan đến đột biến gen ty thể. Nghiên cứu này không chỉ giúp phát hiện các đột biến mà còn định lượng tỷ lệ đột biến trong các mẫu bệnh phẩm. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc chẩn đoán và điều trị các bệnh lý di truyền.

4.1. Nghiên cứu các đột biến phổ biến trong gen ty thể

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng có nhiều đột biến phổ biến trong gen ty thể, như A3243G, G3380A, và G11778A. Real-Time PCR cho phép phát hiện và định lượng các đột biến này một cách chính xác.

4.2. Đánh giá hiệu quả điều trị dựa trên tỷ lệ đột biến

Việc định lượng tỷ lệ đột biến gen ty thể giúp đánh giá hiệu quả điều trị cho bệnh nhân. Điều này có thể giúp bác sĩ đưa ra các quyết định điều trị phù hợp hơn.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu đột biến gen ty thể

Nghiên cứu về đột biến gen ty thể bằng Real-Time PCR đã mở ra nhiều cơ hội mới trong chẩn đoán và điều trị các bệnh lý di truyền. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều tiến bộ trong y học, giúp cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân. Cần tiếp tục nghiên cứu để phát triển các phương pháp mới và cải thiện độ nhạy, độ chính xác của các kỹ thuật hiện tại.

5.1. Hướng nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực này

Cần có nhiều nghiên cứu hơn nữa để phát triển các phương pháp phát hiện đột biến gen ty thể hiệu quả hơn. Việc kết hợp các công nghệ mới như giải trình tự gen có thể giúp nâng cao độ chính xác trong phát hiện.

5.2. Tác động của nghiên cứu đến y học hiện đại

Nghiên cứu về đột biến gen ty thể không chỉ có ý nghĩa trong việc chẩn đoán bệnh mà còn có thể giúp phát triển các phương pháp điều trị mới, mở ra hy vọng cho nhiều bệnh nhân mắc bệnh di truyền.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Ty thể là bào quan thiết yếu trong hầu hết các tế bào nhân chuẩn, chịu trách nhiệm sản xuất năng lượng dưới dạng ATP cho các hoạt động sống của tế bào. Hệ gen ty thể (mtDNA) có cấu trúc vòng, dài 16.569 bp, chứa 37 gen mã hóa cho các protein, tRNA và rRNA quan trọng trong quá trình phosphoryl hóa oxy hóa. Đột biến gen ty thể là nguyên nhân chính gây ra nhiều bệnh lý thần kinh - cơ phức tạp, ảnh hưởng đa hệ thống như hội chứng MELAS, Leigh, LHON, MERRF, CPEO và Kearns-Sayre. Tỷ lệ mắc các bệnh do đột biến mtDNA ước tính khoảng 1:5.000 dân số, với biểu hiện lâm sàng đa dạng và không đồng nhất.

Nghiên cứu tập trung phát hiện và định lượng 6 đột biến gen ty thể phổ biến (A3243G, G3380A, A8344G, T8993C, T8993G, G11778A) bằng kỹ thuật real-time PCR sử dụng mẫu dò huỳnh quang dạng khóa cầu acid nucleic (LNA). Mục tiêu nhằm hoàn thiện phương pháp phát hiện đồng thời các đột biến này với độ nhạy cao, chính xác và nhanh chóng, góp phần nâng cao hiệu quả chẩn đoán và hỗ trợ điều trị bệnh ty thể tại Việt Nam. Nghiên cứu được thực hiện trên mẫu máu ngoại vi của 52 bệnh nhân nghi ngờ mắc bệnh ty thể tại Bệnh viện Nhi Trung ương, trong giai đoạn 2016-2017.

Việc phát triển kỹ thuật real-time PCR đa đột biến có ý nghĩa quan trọng trong việc rút ngắn thời gian phân tích, tăng độ chính xác định lượng tỷ lệ đột biến, từ đó hỗ trợ tư vấn di truyền và quản lý bệnh nhân hiệu quả hơn.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Cấu trúc và chức năng ty thể: Ty thể có hai lớp màng lipoprotein, màng trong chứa các phức hợp enzyme chuỗi hô hấp (I-V) chịu trách nhiệm sản xuất ATP qua quá trình phosphoryl hóa oxy hóa. mtDNA mã hóa các tiểu đơn vị quan trọng của các phức hợp này.

• Di truyền và đột biến mtDNA: mtDNA di truyền theo dòng mẹ, có tính đồng nhất (homoplasmy) hoặc không đồng nhất (heteroplasmy). Tỷ lệ đột biến trong mtDNA ảnh hưởng trực tiếp đến biểu hiện bệnh lý, với ngưỡng biểu hiện thường từ 60-90%.

• Các hội chứng bệnh do đột biến mtDNA: MELAS, Leigh, LHON, MERRF, CPEO, Kearns-Sayre là các hội chứng điển hình liên quan đến các đột biến điểm trong mtDNA, gây rối loạn chức năng hô hấp tế bào và biểu hiện lâm sàng đa dạng.

• Kỹ thuật real-time PCR với mẫu dò LNA: Phương pháp dựa trên sự khuếch đại DNA và phát hiện tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu, cho phép phát hiện và định lượng chính xác tỷ lệ đột biến gen ty thể với độ nhạy cao (có thể phát hiện tỷ lệ đột biến đến 0,01%).

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Mẫu máu ngoại vi của 52 bệnh nhân nghi ngờ mắc bệnh ty thể, thu thập tại Bệnh viện Nhi Trung ương theo tiêu chuẩn lâm sàng và xét nghiệm tăng acid lactic hoặc hình ảnh MRI bất thường.

• Chuẩn bị mẫu đối chứng: Tạo 11 plasmid pJET mang đoạn gen có và không có 6 đột biến mục tiêu (A3243G, G3380A, A8344G, T8993C, T8993G, G11778A) bằng phương pháp biến nạp vào E. coli, tinh sạch và định lượng bằng quang phổ kế.

• Phân tích PCR-RFLP: Kiểm tra sự có mặt của đoạn gen chèn trong plasmid bằng PCR và cắt enzyme giới hạn, xác nhận bằng điện di gel agarose và polyacrylamide.

• Thiết lập real-time PCR: Sử dụng mẫu dò huỳnh quang Taqman LNA đặc hiệu cho từng đột biến, với tín hiệu HEX cho trình tự không đột biến và FAM cho trình tự đột biến. Tối ưu master mix, xây dựng đường chuẩn với các tỷ lệ đột biến khác nhau (từ 0,1% đến 100%).

• Phân tích dữ liệu: Đo tín hiệu huỳnh quang, tính chu kỳ ngưỡng (Ct), xác định số bản sao đột biến và không đột biến, tính tỷ lệ đột biến theo công thức:

$$ \text{Tỷ lệ đột biến} = \frac{\text{Số bản sao đột biến (FAM)}}{\text{Số bản sao đột biến (FAM)} + \text{Số bản sao không đột biến (HEX)}} \times 100% $$

• Phân tích thống kê: Mỗi mẫu đo lặp lại 3 lần, tính giá trị trung bình và độ lệch chuẩn bằng Excel.

• Timeline nghiên cứu: Thực hiện trong năm 2017, từ thu thập mẫu, chuẩn bị plasmid, tối ưu hóa phản ứng real-time PCR đến phân tích kết quả.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Tạo và xác nhận mẫu đối chứng plasmid: 11 plasmid mang đoạn gen có và không có đột biến được tinh sạch với nồng độ DNA từ 45 đến 128 ng/µl, tỷ số A260/A280 trong khoảng 1,8-2,0, đảm bảo độ tinh khiết cao. Điện di gel agarose cho thấy băng DNA rõ nét ~3 kb, phù hợp với vector pJET 1.2.

2. Xác nhận đoạn gen chèn trong plasmid: PCR khuếch đại các đoạn gen mục tiêu cho kết quả băng đúng kích thước lý thuyết (198-402 bp). Enzyme giới hạn cắt sản phẩm PCR tạo ra các đoạn cắt đặc trưng, điện di trên gel agarose và polyacrylamide cho kết quả phù hợp với dự đoán, chứng tỏ plasmid mang chính xác đoạn gen có và không có đột biến.

3. Thiết lập đường chuẩn real-time PCR: Đường chuẩn xây dựng với các tỷ lệ đột biến khác nhau cho thấy mối tương quan tuyến tính cao giữa chu kỳ ngưỡng (Ct) và logarit số bản sao ban đầu, với hệ số tương quan R² từ 0,987 đến 0,997 và hiệu suất PCR trong khoảng 82-105%. Điều này chứng tỏ phương pháp có độ nhạy và độ chính xác cao trong phát hiện và định lượng đột biến.

4. Đánh giá độ nhạy và đặc hiệu: Phương pháp real-time PCR có thể phát hiện tỷ lệ đột biến thấp đến 0,1%, vượt trội so với PCR-RFLP truyền thống có giới hạn phát hiện 5-10%. Master mix được tối ưu hóa cho phép phát hiện đồng thời 6 đột biến phổ biến trong cùng một phản ứng.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy kỹ thuật real-time PCR sử dụng mẫu dò LNA là phương pháp hiệu quả, nhạy và chính xác trong phát hiện và định lượng các đột biến gen ty thể phổ biến. Việc tạo mẫu đối chứng plasmid chuẩn xác và xây dựng đường chuẩn tuyến tính giúp đảm bảo độ tin cậy của kết quả định lượng.

So với các phương pháp truyền thống như PCR-RFLP, real-time PCR rút ngắn thời gian phân tích, giảm thao tác sau PCR và tăng khả năng phát hiện đột biến ở tỷ lệ rất thấp, phù hợp với đặc điểm không đồng nhất của mtDNA trong bệnh ty thể. Kết quả này tương đồng với các nghiên cứu quốc tế đã ứng dụng real-time PCR trong phân tích đột biến A3243G, T8993G/C, G11778A và A8344G.

Việc phát hiện đồng thời 6 đột biến trong một phản ứng giúp tiết kiệm chi phí, thời gian và tăng hiệu quả sàng lọc bệnh nhân nghi ngờ mắc bệnh ty thể. Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ đường chuẩn thể hiện mối tương quan tuyến tính giữa Ct và số bản sao, bảng tổng hợp hiệu suất PCR và hệ số tương quan, cũng như biểu đồ so sánh tỷ lệ đột biến phát hiện được giữa các phương pháp.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Áp dụng kỹ thuật real-time PCR đa đột biến trong chẩn đoán lâm sàng: Khuyến nghị các cơ sở y tế và phòng xét nghiệm sử dụng phương pháp này để phát hiện nhanh và chính xác các đột biến gen ty thể phổ biến, nâng cao hiệu quả chẩn đoán bệnh ty thể.

2. Đào tạo nhân lực và trang bị thiết bị hiện đại: Tổ chức các khóa đào tạo chuyên sâu về kỹ thuật real-time PCR và quản lý dữ liệu cho cán bộ y tế, đồng thời đầu tư trang thiết bị PCR hiện đại để đảm bảo chất lượng xét nghiệm.

3. Phát triển hệ thống lưu trữ và phân tích dữ liệu di truyền: Xây dựng cơ sở dữ liệu về đột biến gen ty thể tại Việt Nam, hỗ trợ nghiên cứu dịch tễ học và tư vấn di truyền cho bệnh nhân và gia đình.

4. Mở rộng nghiên cứu và ứng dụng kỹ thuật: Khuyến khích nghiên cứu mở rộng phát hiện các đột biến khác và ứng dụng real-time PCR trong theo dõi điều trị, đánh giá tiến triển bệnh ty thể.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Bác sĩ chuyên khoa thần kinh và cơ xương: Nắm bắt kỹ thuật phát hiện đột biến gen ty thể để hỗ trợ chẩn đoán chính xác các bệnh lý thần kinh - cơ phức tạp.

2. Nhân viên phòng xét nghiệm di truyền: Áp dụng phương pháp real-time PCR đa đột biến để nâng cao hiệu quả xét nghiệm và định lượng tỷ lệ đột biến.

3. Nhà nghiên cứu di truyền học và sinh học phân tử: Tham khảo quy trình thiết lập mẫu đối chứng, tối ưu hóa phản ứng PCR và phân tích dữ liệu định lượng.

4. Chuyên gia tư vấn di truyền: Sử dụng kết quả định lượng đột biến để tư vấn chính xác về nguy cơ di truyền và quản lý bệnh nhân.

Câu hỏi thường gặp

1. Real-time PCR có ưu điểm gì so với PCR-RFLP trong phát hiện đột biến mtDNA?
   Real-time PCR có độ nhạy cao hơn, có thể phát hiện tỷ lệ đột biến thấp đến 0,1%, trong khi PCR-RFLP chỉ phát hiện được từ 5-10%. Ngoài ra, real-time PCR cho phép định lượng chính xác tỷ lệ đột biến và rút ngắn thời gian phân tích do không cần thao tác sau PCR.

2. Tại sao cần tạo mẫu đối chứng plasmid trong nghiên cứu này?
   Mẫu đối chứng plasmid chuẩn giúp xác định chính xác trình tự gen có và không có đột biến, làm cơ sở xây dựng đường chuẩn định lượng, đảm bảo độ tin cậy và tính chính xác của kết quả real-time PCR.

3. Tỷ lệ đột biến mtDNA ảnh hưởng thế nào đến biểu hiện bệnh?
   Tỷ lệ đột biến phải vượt ngưỡng khoảng 60-90% mới gây ra biểu hiện bệnh lý do ảnh hưởng đến chức năng hô hấp tế bào. Tỷ lệ này khác nhau tùy loại đột biến và mô cơ quan, giải thích sự không đồng nhất về biểu hiện lâm sàng.

4. Phương pháp real-time PCR có thể phát hiện đồng thời bao nhiêu đột biến?
   Nghiên cứu này đã thiết lập phương pháp phát hiện và định lượng đồng thời 6 đột biến gen ty thể phổ biến trong cùng một phản ứng, giúp tiết kiệm thời gian và chi phí xét nghiệm.

5. Làm thế nào để đảm bảo độ chính xác khi định lượng tỷ lệ đột biến?
   Sử dụng mẫu chuẩn với tỷ lệ đột biến đã biết để xây dựng đường chuẩn, thực hiện lặp lại mẫu nhiều lần, tối ưu hóa master mix và điều kiện phản ứng, đồng thời sử dụng mẫu dò LNA đặc hiệu giúp tăng tính đặc hiệu và độ nhạy của phản ứng.

Kết luận

• Đã thiết lập thành công phương pháp real-time PCR sử dụng mẫu dò LNA để phát hiện và định lượng đồng thời 6 đột biến gen ty thể phổ biến với độ nhạy cao và độ chính xác tốt.
• Mẫu đối chứng plasmid được tạo và xác nhận chính xác, làm nền tảng cho việc xây dựng đường chuẩn định lượng.
• Phương pháp cho phép phát hiện tỷ lệ đột biến thấp đến 0,1%, vượt trội so với các kỹ thuật truyền thống như PCR-RFLP.
• Kết quả nghiên cứu góp phần nâng cao năng lực chẩn đoán và tư vấn di truyền bệnh ty thể tại Việt Nam.
• Đề xuất áp dụng rộng rãi kỹ thuật này trong các phòng xét nghiệm lâm sàng và nghiên cứu, đồng thời mở rộng nghiên cứu các đột biến khác trong tương lai.

Hành động tiếp theo: Triển khai đào tạo kỹ thuật real-time PCR đa đột biến cho các phòng xét nghiệm, xây dựng cơ sở dữ liệu đột biến mtDNA quốc gia và phát triển các nghiên cứu ứng dụng trong theo dõi điều trị bệnh ty thể.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Ty thể là bào quan có mă ̣t trong h ầu hết các tế bào nhân chu ẩn với chức năng chính là sản xuất năng lƣợng dƣới dạng ATP cho các hoạt động của tế bào. Hệ gen ty thể có cấu trúc sợi đôi, DNA mạch vòng với kích thƣớc 16.569 bp, gồm 37 gen mã hóa cho 13 protein, 22 RNA vận chuyển (tRNA) và 2 RNA ribosome (rRNA). Gần nhƣ tất cả các tế bào đều dựa vào nguồn năng lƣợng ổn định do ty thể cung cấp, do đó những sai hỏng trong DNA của ty thể có thể gây ra sự rối loạn đa hệ thống, ảnh hƣởng đến nhiều loại tế bào, mô và tổ chức khác nhau chủ yếu tập trung ở cơ, thần kinh và chức năng chuyển hóa của cơ thể. Giống nhƣ tất cả DNA ngoài nhân, mtDNA đƣợc di truyền theo mẹ, tƣ́c là mẹ truyền hệ gen ty thể cho các ngƣời con và chỉ có những ngƣời con gái mới truyền hệ gen đó cho thế hệ tiếp theo.

Đột biến mtDNA đƣợc truyền từ mẹ sang con nhƣng tỷ lệ số bản sao mang đột biến ở mẹ và con khác nhau, các cá thể mang đột biến trong một phả hệ gia đình cũng có sự thay đổi về tần suất đột biến vì vậy mức độ biểu hiện bệnh ở mẹ và các ngƣời con khác nhau có th ể rất khác nhau. Bệnh do đột biến gen ty thể có tác động lâm sàng phức tạp. Do đó rất khó để phát hiện thông qua việc chẩn đoán lâm sàng. Hiện nay phân tích DNA là phƣơng pháp hiện đại nhất cho phép hiện nhanh chóng và chính xác các đột biến điểm gây bệnh.

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về đột biến gen ty thể, cho đến nay trên 250 đột biến điểm đã đƣợc phát hiện liên quan đến các bênh hay hội chức khác nhau. Ở Việt Nam, nghiên cứu về đột biến gen ty thể chỉ mới đƣợc quan tâm khoảng 10 năm gần đây, qua đó khoảng 20 loại đột biến khác nhau đã đƣợc nghiên cứu và điều tra trên các bệnh nhân nhi nghi bị bệnh ty thể. PCR-RFLP và real-time là phƣơng pháp đƣợc sử dụng phổ biến để sàng lọc các đột biến gen ty thể. PCR- RFLP có ƣu điểm giá thành rẻ, dễ sử dụng, tuy nhiên nó có nhƣợc điểm độ nhạy không cao đồng thời không định lƣợng chính xác đƣợc tỷ lệ đột biến.

Trong khi đó, real-time PCR là kỹ thuật phát hiện các đột biến gen ty thể có độ nhạy cao đồng thời có thể định lƣợng chính xác tỷ lệ đột biến gen gây bệnh thông qua việc sử dụng 1 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] các mẫu dò khác nhau. Ngoài ra, phƣơng pháp không cần thao tác sau PCR dẫn tới việc rút ngắn thời gian phân tích mẫu. Do đó trong nghiên cứu này, trên cơ sở kết quả nghiên của GS. Phan Tuấn Nghĩa và tập thể đã có trƣớc đó, chúng tôi t ập trung hoàn thiện cách thức phát hiện và định lƣợng cùng một lúc 6 đột biến điểm có tần suất xuất hiện cao trong các hội chứng bệnh ty thể điển hình bao gồm: A3243G, G3380A (thuô ̣c hô ̣i chƣ́ng MELAS), G11778A (thuô ̣c hô ̣i chƣ́ng LHON ), A8344G (thuô ̣c hô ̣i chƣ́ng MERRF), T8993G/C (thuô ̣c hô ̣i chƣ́ng Leigh) bằng real-time PCR nhằm góp phần vào việc chẩn đoán và hỗ trợ điều trị bệnh ty thể.

Nghiên cứu đƣợc thực hiện với nội dung nhƣ sau 1. Tạo các mẫu đối chứng cho real-time PCR phát hiện và định lƣợng 6 đột biến gen ty thể phổ biến A3243G, G3380A, A8344G, T8993C, T8993G, G11778A. Tạo hỗn hợp phản ứng master mix cho real-time PCR 3. Xác định thành phần thích hợp cho master mix 4.

Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, xác định thời gian bảo quản master mix 5. Điều tra sự có mặt của 6 đột biến A3243G, G3380A, A8344G, G11778A, T8993G, T8993C ở các bệnh nhân nghi bị bệnh ty thể sử dụng master mix đƣợc tạo ra. Phân tích các thành viên trong gia đình bệnh nhân dƣơng tính với một hoặc nhiều đột biến trong 6 đột biến quan tâm. 2 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] CHƢƠNG 1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu chung về ty thể 1. Cấu trúc và chức năng của ty thể Ty thể là bào quan có ở hầu hết các tế bào nhân thật, hình dạng đặc trƣng của ty thể là thon dài với đƣờng kính 0,5-2 µm và chiều dài 7-10 µm. Phụ thuộc vào trạng thái tế bào hay loại tế bào mà ty thể có hình dạng và kích thƣớc khác nhau (Hình 1.

Ty thể có khả năng thay đổi kích thƣớc, hình dạng, có thể liên kết với nhau tạo ra những cấu trúc dài hơn hoặc phân ra thành những cấu trúc ngắn hơn. Ngoài ra, ty thể có khả năng di chuyển để phản ứng với những thay đổi sinh lý trong tế bào [15]. Hình dạng bình thƣờng (trái) và dạng biến đổi (phải) của ty thể [15]. Ty thể có cấu trúc gồm hai lớp màng lipoprotein, màng ngoài và màng trong, tƣơng tự nhƣ màng sinh chất.

Hai lớp màng này bao lấy chất nền ở phía trong, khoang giữa hai màng đƣợc gọi là xoang gian màng. Màng trong ty thể ăn sâu vào chất nền tạo thành các cấu trúc mào răng lƣợc (Hình 1. 3 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail. Cấu trúc ty thể [16].

Màng ngoài ty thể có độ dày 6 nm, trong đó protein chiếm khoảng 60% và lipid chiếm khoảng 40%. Màng có nhiều protein lỗ cho phép các chất, các ion di chuyển tự do từ ngoài nguyên sinh chất vào xoang gian màng và ngƣợc lại. Màng ngoài ty thể còn chứa nhiều enzyme quan trọng nhƣ các transferase, kinase, cytochrome-reductase, acyl CoA synthetase. Màng trong của ty thể cũng là màng lipoprotein, protein chiếm 80%, lipid chiếm 20%, và một lƣợng nhỏ cholesterol.

Màng trong ăn sâu vào chất nền tạo nên các cấu trúc mào răng lƣợc. Cấu trúc “mào” làm tăng diện tích bề mặt của màng trong so với màng ngoài và điều này liên quan đến chức năng của nó là tăng cƣờng vận chuyển điện tử và tổng hợp ATP. Màng trong chứa nhiều protein vận chuyển chủ động ATP, ADP, acid béo và các protein kênh vận chuyển các ion Na+, K+, Ca2+ và H+. Màng trong là nơi bám của 5 phức hợp thuộc chuỗi hô hấp bao gồm chuỗi vận chuyển điện tử: phức hợp I (NADH ubiquinone reductase), phức hệ II (Succinate dehydrogenase), phức hệ III (Ubiquinol-cytochrome c reductase), phức hệ IV (Cytochrome c oxidase), phức hệ 5 (ATP synthase còn gọi là F1F0-ATPase) và adenine nucleotide translocase (ANT) (Hình 1.

4 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail. Cấu trúc màng trong ty thể [13]. I, II, III, IV, V phức hệ trong chuỗi vận chuyển điện tử Xoang gian màng (khoang hẹp giữa màng ngoài và màng trong ty thể) là nơi trung chuyển các chất giữa hai màng. Xoang gian màng chứa nhiều ion H+ từ chất nền đi ra do hoạt động của chuỗi vận chuyển điện tử.

Chất nền (matrix) của ty thể chứa các enzyme của chu trình Krebs, các enzyme của quá trình oxy hóa acid béo, acid amin và vật chất di truyền riêng của ty thể. Nhƣ vậy, ở tế bào động vật, thực vật và ngƣời ngoài hệ gen nhân, còn có hệ gen tế bào chất nằm trong ty thể. Ty thể thực hiện các chức năng sinh hóa cần thiết cho nội cân bằng tế bào cũng nhƣ nhân tố quan trọng quyết định sự sống còn của tế bào. Ở sinh vật nhân chuẩn, ty thể sản xuất ra năng lƣợng dƣới dạng ATP thông qua quá trình oxi hóa các chất hữu cơ bao gồm carbohydrate, chất béo và protein đƣợc lấy từ thức ăn, trong đó chủ yếu là carbohydrate thông qua hai bƣớc chính: 1) oxy hóa NADH hoặc FADH2 đƣợc sinh ra trong quá trình đƣờng phân, chu trình Krebs hoặc β- oxy hóa các axit béo và 2) phosphoryl hóa oxy hóa tạo ra ATP.

Tất cả các quá trình này đƣợc kiểm soát bởi các hệ nhân tố phiên mã trong ty thể [9]. Chuỗi vận chuyển điện tử bao gồm 5 đơn vị phức hợp enzyme: I, II, III, IV và V nằm trên màng trong của ty thể, hai phân tử vận chuyển điện tử giữa các phức hệ là coenzyme ubiquinone (CoQ) và Cyt c. Các Coenzyme, NADH và FADH2 5 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] trong chu trình Krebs là nguồn cung cấp electron. Các electron đƣợc chuyển sang các thành phần của chuỗi vận chuyển ở phức hệ I (NADH ubiquinone reductase) hoặc phức hệ II (Succinate dehydrogenase), Phức hệ I và II xúc tác cho sự nhận điện tử của CoQ từ NADH và succinate.

Phức hệ III (Ubiquinol-cytochrome c reductase) xúc tác cho quá trình chuyển điện tử từ CoQ đến Cyt c. Cuối cùng phức hệ IV (Cytochrome c oxidase) xúc tác sự vận chuyển điện tử từ Cyt c tới chất nhận cuối cùng là oxy phân tử [3]. Ở mỗi bƣớc, điện tử đi qua các phức hệ, năng lƣợng đƣợc giải phóng ra kèm theo việc bơm các proton (H+) từ chất nền qua màng trong ra xoang gian màng và làm xuất hiện điện thế màng và gradient proton. Nhờ thế, hệ thống ATP synthase hoạt động và tổng hợp ATP từ ADP và phosphate vô cơ (Pi) (Hình 1.

Ty thể và quá trình trao đổi năng lƣợng trong tế bào [19]. Ty thể hoạt động liên tục để chuyển hóa oxy và tạo ra gốc tự do chứa oxy phản ứng (ROS). Tuy nhiên, dù là ngẫu nhiên hay vì một nguyên nhân nào đó, quá trình vận chuyển điện tử vẫn còn sai sót, dẫn tới việc sản xuất các gốc tự do chứa 6 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] oxy nhƣ anion superoxide (•O2-) là một trong các gốc tự do chính. Các anion superoxide tiếp tục tƣơng tác với nhiều hợp chất khác và tạo ra các gốc tự do thứ cấp.

Trƣớc đó, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng tƣơng tác của gốc tự do hydroxyl (•OH) với phân tử DNA gây tổn hại đến các bazơ nitơ purine, pyrimidine và khung xƣơng đƣờng của DNA [34]. Ngoài ra, việc tạo ra quá nhiều gốc tự do sẽ phá hủy các protein/các enzyme, màng, và DNA của ty thể, làm cho sự hình thành ATP và các chức năng thiết yếu khác trong ty thể bị gián đoạn. Bên cạnh anion superoxide và các gốc hydroxyl, chuỗi vận chuyển điện tử cũng tạo ra các phân tử hoạt động khác nhƣ nitơ oxit (NO) và các loại nitơ phản ứng (RNS). Hầu hết các protein của tế bào và glutathione đều bị ảnh hƣởng bởi sự nitrat hóa do RNS gây ra.