Luận văn thạc sĩ về phát hiện đột biến gen beta globin tại Đại học Quốc gia Hà Nội

Luận văn thạc sĩ kỹ thuật phân tích phát hiện các đột biến trên gen beta globin bằng kỹ thuật arms pcr và lai điểm ngược reverse dot, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề xuất

• Tác giả: Lê Thị Thu Hà
• Người hướng dẫn: PGS. Võ Thị Thương Lan
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Phát hiện các đột biến gen beta globin bằng ARMS-PCR
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tình hình mắc bệnh trên thế giới và tại Việt Nam
• 1.2. Vị trí, cấu trúc gen β-globin mã hóa chuỗi β-globin
• 1.3. Các đột biến trên gen β-globin gây bệnh β-thalassemia
• 1.4. Đặc điểm kiểu hình của bệnh β-thalassemia
• 1.5. Các phương pháp chẩn đoán bệnh
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị
• 2.2. Trình tự các đầu dò oligo sử dụng trong nghiên cứu
• 2.3. Trình tự các mồi
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Tách ADN tổng số
• 2.4.2. Phương pháp PCR
• 2.4.3. Phương pháp ARMS-PCR
• 2.4.4. Phương pháp điện di
• 2.4.5. Quá trình lai điểm ngược
• 2.4.6. Phương pháp tách dòng
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ
• 3.1. Kết quả sàng lọc đột biến trên gen β-globin bằng kỹ thuật PCR đa mồi
• 3.2. Sàng lọc đột biến trên gen β-globin bằng kỹ thuật ARMS-PCR
• 3.2.1. Sàng lọc đột biến Cd 17 trên mẫu thalassemia bằng ARMS-PCR
• 3.2.2. Sàng lọc đột biến Cd 26 trên mẫu thalassemia bằng ARMS-PCR
• 3.2.3. Sàng lọc đột biến Cd 41/42 trên mẫu thalassemia bằng ARMS-PCR
• 3.3. So sánh kết quả sàng lọc đột biến trên các mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật PCR đa mồi với kết quả chẩn đoán sinh hóa
• 3.3.1. Đặc điểm Hb các đột biến trong nghiên cứu
• 3.3.2. Giá trị HbE ở các mẫu có đột biến Cd 26
• 3.3.3. So sánh kết quả chẩn đoán sinh hóa với kết quả phân tích PCR đa mồi
• 3.4. Kết quả sàng lọc đột biến ở nhóm người bình thường
• 3.5. Biến nạp, tách dòng và giải trình tự đoạn gen β-globin
• 3.5.1. Biến nạp, tách dòng
• 3.5.2. Giải trình tự đoạn gen β-globin có đột biến Cd 17
• 3.5.3. Giải trình tự đoạn gen β-globin có đột biến Cd 26
• 3.5.4. Giải trình tự đoạn gen β-globin có đột biến Cd 41/42
• 3.5.5. Giải trình tự đoạn gen β-globin không có đột biến
• 3.6. Lai điểm ngược (Reverse Dot Blot)
• 3.6.1. Đánh dấu trình tự đích cho quá trình lai điểm ngược
• 3.6.2. Tối ưu điều kiện lai điểm ngược
• 3.6.3. Kết quả lai một số mẫu bệnh phẩm
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về phát hiện đột biến gen beta globin bằng ARMS PCR

Phát hiện đột biến gen beta globin là một trong những lĩnh vực quan trọng trong nghiên cứu bệnh lý di truyền, đặc biệt là bệnh β-thalassemia. Kỹ thuật ARMS-PCR (Amplification Refractory Mutation System-PCR) đã trở thành một công cụ hữu ích trong việc phát hiện các đột biến này. Kỹ thuật này cho phép phát hiện đồng thời nhiều đột biến khác nhau, giúp nâng cao độ chính xác trong chẩn đoán bệnh.

1.1. Tình hình mắc bệnh β thalassemia trên thế giới và tại Việt Nam

Bệnh β-thalassemia là một trong những bệnh di truyền phổ biến nhất trên thế giới, đặc biệt ở các khu vực như Địa Trung Hải và Đông Nam Á. Tại Việt Nam, tỷ lệ mắc bệnh này rất cao, với khoảng 20.000 người mắc bệnh thể nặng và 10 triệu người mang gen bệnh. Việc phát hiện sớm và chính xác các đột biến gen beta globin là rất cần thiết để giảm thiểu tác động của bệnh này.

1.2. Cấu trúc và chức năng của gen beta globin

Gen beta globin nằm trên nhiễm sắc thể 11, có vai trò quan trọng trong việc tổng hợp chuỗi β-globin của hemoglobin. Các đột biến xảy ra trong gen này có thể dẫn đến các dạng bệnh lý khác nhau, từ nhẹ đến nặng. Việc hiểu rõ cấu trúc và chức năng của gen beta globin giúp các nhà nghiên cứu phát triển các phương pháp chẩn đoán hiệu quả hơn.

II. Vấn đề và thách thức trong phát hiện đột biến gen beta globin

Mặc dù kỹ thuật ARMS-PCR đã được áp dụng rộng rãi, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong việc phát hiện các đột biến gen beta globin. Một trong những vấn đề chính là sự đa dạng của các đột biến, điều này làm cho việc thiết kế mồi PCR trở nên phức tạp. Ngoài ra, việc phát hiện các đột biến hiếm gặp cũng là một thách thức lớn.

2.1. Đa dạng của các đột biến gen beta globin

Có khoảng 200 loại đột biến khác nhau trên gen beta globin, chủ yếu là các đột biến điểm. Sự đa dạng này không chỉ làm khó khăn trong việc phát hiện mà còn ảnh hưởng đến việc điều trị bệnh. Việc phát triển các phương pháp chẩn đoán có thể phát hiện được nhiều loại đột biến khác nhau là rất cần thiết.

2.2. Khó khăn trong thiết kế mồi PCR cho ARMS PCR

Thiết kế mồi PCR cho ARMS-PCR yêu cầu phải có độ chính xác cao để đảm bảo phát hiện đúng các đột biến. Việc này đòi hỏi các nhà nghiên cứu phải có kiến thức sâu rộng về gen beta globin và các đột biến liên quan. Sự phức tạp trong cấu trúc gen cũng làm cho việc thiết kế mồi trở nên khó khăn hơn.

III. Phương pháp ARMS PCR trong phát hiện đột biến gen beta globin

Kỹ thuật ARMS-PCR là một phương pháp mạnh mẽ trong việc phát hiện các đột biến gen beta globin. Phương pháp này cho phép phát hiện đồng thời nhiều đột biến khác nhau trong một phản ứng PCR duy nhất, giúp tiết kiệm thời gian và chi phí.

3.1. Nguyên tắc hoạt động của kỹ thuật ARMS PCR

ARMS-PCR dựa trên nguyên tắc sử dụng các mồi đặc hiệu cho từng đột biến. Khi có sự hiện diện của đột biến, phản ứng PCR sẽ diễn ra, tạo ra sản phẩm khuếch đại. Nguyên tắc này giúp phát hiện chính xác các đột biến mà không cần phải tách riêng từng mẫu.

3.2. Thiết kế mồi cho phản ứng ARMS PCR

Thiết kế mồi cho ARMS-PCR là một bước quan trọng để đảm bảo độ chính xác của phương pháp. Mồi cần phải được thiết kế sao cho có độ đặc hiệu cao với các vị trí đột biến, đồng thời không gây ra phản ứng chéo với các trình tự khác trong gen beta globin.

3.3. Ưu điểm và nhược điểm của kỹ thuật ARMS PCR

Kỹ thuật ARMS-PCR có nhiều ưu điểm như độ nhạy cao, khả năng phát hiện nhiều đột biến trong một lần xét nghiệm. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là yêu cầu thiết kế mồi phức tạp và có thể gặp khó khăn trong việc phát hiện các đột biến hiếm gặp.

IV. Ứng dụng thực tiễn của ARMS PCR trong chẩn đoán bệnh β thalassemia

ARMS-PCR đã được áp dụng thành công trong nhiều nghiên cứu để phát hiện các đột biến gen beta globin gây bệnh β-thalassemia. Kết quả từ các nghiên cứu này cho thấy phương pháp này có thể cải thiện đáng kể độ chính xác trong chẩn đoán bệnh.

4.1. Kết quả nghiên cứu ứng dụng ARMS PCR

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng ARMS-PCR có thể phát hiện được các đột biến phổ biến như Cd 17, Cd 26 và Cd 41/42 với độ chính xác cao. Việc áp dụng phương pháp này trong chẩn đoán giúp phát hiện sớm bệnh và có biện pháp điều trị kịp thời.

4.2. Tác động của ARMS PCR đến việc điều trị bệnh β thalassemia

Việc phát hiện sớm các đột biến gen beta globin thông qua ARMS-PCR giúp các bác sĩ có thể đưa ra các phương pháp điều trị phù hợp hơn. Điều này không chỉ cải thiện chất lượng cuộc sống của bệnh nhân mà còn giảm thiểu chi phí điều trị.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu phát hiện đột biến gen beta globin

Phát hiện đột biến gen beta globin bằng kỹ thuật ARMS-PCR đã chứng minh được hiệu quả trong việc chẩn đoán bệnh β-thalassemia. Tuy nhiên, vẫn cần tiếp tục nghiên cứu để cải thiện độ chính xác và khả năng phát hiện các đột biến hiếm gặp.

5.1. Tương lai của kỹ thuật ARMS PCR trong nghiên cứu gen

Kỹ thuật ARMS-PCR có tiềm năng lớn trong việc phát hiện các đột biến gen khác ngoài beta globin. Việc mở rộng ứng dụng của phương pháp này có thể giúp phát hiện sớm nhiều bệnh di truyền khác.

5.2. Đề xuất nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực này

Cần có thêm nhiều nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình ARMS-PCR, từ thiết kế mồi đến điều kiện phản ứng. Việc này sẽ giúp nâng cao độ nhạy và độ chính xác của phương pháp, từ đó cải thiện khả năng chẩn đoán bệnh di truyền.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh β-thalassemia là một trong những bệnh di truyền phổ biến trên thế giới, đặc biệt tại khu vực Đông Nam Á, trong đó Việt Nam là một trong những quốc gia có tỷ lệ mắc bệnh cao. Ước tính khoảng 1,5% dân số thế giới mang gen bệnh β-thalassemia, với khoảng 50.000 đến 100.000 trẻ em tử vong mỗi năm do thể nặng của bệnh tại các quốc gia có thu nhập thấp và trung bình. Tại Việt Nam, có khoảng 20.000 người bị β-thalassemia thể nặng và mỗi năm có thêm khoảng 2.000 trẻ sinh ra mắc bệnh, với khoảng 10 triệu người mang gen bệnh. Bệnh gây ra thiếu máu nặng, tan máu, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe thể chất và tinh thần của người bệnh.

Mục tiêu nghiên cứu là phát hiện các đột biến phổ biến trên gen β-globin gây bệnh β-thalassemia ở người Việt Nam bằng hai kỹ thuật phân tử hiện đại: ARMS-PCR và lai điểm ngược (reverse dot blot). Nghiên cứu được thực hiện trên 288 mẫu bệnh phẩm thalassemia và 152 mẫu máu người bình thường, tại Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. Việc phát hiện chính xác các đột biến giúp nâng cao hiệu quả chẩn đoán, hỗ trợ tầm soát và phòng ngừa bệnh trong cộng đồng, góp phần giảm thiểu gánh nặng bệnh tật và chi phí điều trị.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình về di truyền phân tử của bệnh β-thalassemia, tập trung vào gen β-globin nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc thể 11. Gen này dài khoảng 1600 bp, gồm 3 exon và 2 intron, mã hóa chuỗi β-globin của hemoglobin. Các đột biến trên gen β-globin, chủ yếu là đột biến điểm và mất đoạn nhỏ, làm giảm hoặc mất khả năng tổng hợp chuỗi β-globin, dẫn đến các thể bệnh βo-thalassemia, β+-thalassemia và β++-thalassemia với mức độ nặng nhẹ khác nhau.

Ba nhóm đột biến chính ảnh hưởng đến quá trình phiên mã, cải biến mARN và dịch mã được nghiên cứu kỹ, bao gồm đột biến vùng promoter, vùng không dịch mã 5’ và 3’, các vị trí ghép nối giả, đột biến vô nghĩa, đột biến khung và đột biến tạo vị trí ghép nối giả. Các đột biến phổ biến tại Việt Nam gồm Cd 17 (A→T), Cd 26 (G→A), Cd 41/42 (-TCTT) và Cd 95 (+A).

Kỹ thuật ARMS-PCR dựa trên nguyên tắc khuếch đại đặc hiệu allele, sử dụng mồi đặc hiệu cho trình tự bình thường và đột biến, cho phép phát hiện nhanh, chính xác các đột biến điểm. Kỹ thuật lai điểm ngược (reverse dot blot) là phương pháp lai pha rắn, trong đó các đầu dò oligonucleotide được cố định trên màng nylon, lai với sản phẩm PCR đánh dấu biotin, cho phép phát hiện đồng thời nhiều đột biến trong một lần thực hiện với độ nhạy và đặc hiệu cao.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu gồm 288 mẫu bệnh phẩm thalassemia được cung cấp bởi Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương và 152 mẫu máu người bình thường từ Bệnh viện Bạch Mai. ADN được tách chiết từ mẫu máu bằng kit thương mại, nồng độ và chất lượng ADN được kiểm tra bằng phương pháp đo quang phổ và điện di trên gel agarose.

Phương pháp phân tích gồm:

• PCR đa mồi để sàng lọc đồng thời 4 đột biến phổ biến trên gen β-globin.
• ARMS-PCR để xác định kiểu gen đồng hợp hoặc dị hợp của các đột biến Cd 17, Cd 26, Cd 41/42.
• Lai điểm ngược được tối ưu hóa điều kiện lai và rửa để phát hiện đồng thời các đột biến trên màng nylon Biodyne C.
• Tách dòng và giải trình tự gen β-globin từ các mẫu có và không có đột biến để xác nhận kết quả.
• Phân tích dữ liệu bằng phương pháp thống kê mô tả, so sánh tỷ lệ đột biến giữa các nhóm mẫu.

Thời gian nghiên cứu kéo dài từ năm 2012 đến 2017, tại Phòng thí nghiệm Sinh Y và Phòng Sinh học Phân tử, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Tỷ lệ đột biến trên gen β-globin: Trong 288 mẫu bệnh phẩm, tỷ lệ phát hiện các đột biến Cd 17, Cd 26, Cd 41/42 và Cd 95 lần lượt chiếm khoảng 30%, 25%, 20% và 10%. Đột biến Cd 17 là phổ biến nhất, phù hợp với các báo cáo trước đây tại Việt Nam.

2. Hiệu quả kỹ thuật ARMS-PCR: Kỹ thuật ARMS-PCR cho kết quả chính xác trong việc xác định kiểu gen đồng hợp và dị hợp, với độ nhạy và độ đặc hiệu trên 95%. So sánh với kết quả PCR đa mồi, ARMS-PCR giúp xác định rõ trạng thái đột biến, giảm thiểu sai sót chẩn đoán.

3. Ứng dụng kỹ thuật lai điểm ngược: Kỹ thuật lai điểm ngược được tối ưu hóa thành công, cho phép phát hiện đồng thời 4 đột biến phổ biến trên gen β-globin với tín hiệu màu sắc rõ ràng, dễ quan sát. Kết quả lai điểm ngược tương đồng 98% với kết quả giải trình tự gen, chứng minh tính tin cậy của phương pháp.

4. So sánh với phương pháp chẩn đoán sinh hóa: Kết quả phân tích hemoglobin (HbA2, HbE) phù hợp với kết quả phân tích gen, trong đó HbE tăng rõ rệt ở các mẫu có đột biến Cd 26 (HbE), trung bình HbE đạt trên 25%. Điều này khẳng định vai trò của phân tích gen trong chẩn đoán chính xác thể bệnh.

Thảo luận kết quả

Nguyên nhân tỷ lệ đột biến Cd 17 cao có thể do đặc điểm di truyền dân tộc và vùng địa lý tại Việt Nam, tương tự các nghiên cứu trong khu vực Đông Nam Á. Kỹ thuật ARMS-PCR thể hiện ưu điểm vượt trội về độ chính xác và chi phí thấp so với các phương pháp giải trình tự toàn bộ gen, phù hợp cho ứng dụng trong các phòng xét nghiệm lâm sàng.

Kỹ thuật lai điểm ngược, mặc dù còn hạn chế về tối ưu điều kiện lai và rửa, nhưng đã chứng minh được khả năng phát hiện đồng thời nhiều đột biến, tiết kiệm thời gian và vật tư. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu quốc tế và mở ra hướng phát triển kỹ thuật chẩn đoán phân tử tại Việt Nam.

Biểu đồ so sánh tỷ lệ đột biến giữa các kỹ thuật PCR đa mồi, ARMS-PCR và lai điểm ngược có thể minh họa rõ sự tương đồng và ưu điểm của từng phương pháp. Bảng so sánh chỉ số Hb ở các nhóm đột biến cũng giúp làm rõ mối liên hệ giữa kiểu gen và kiểu hình bệnh.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Triển khai kỹ thuật ARMS-PCR rộng rãi: Khuyến nghị các cơ sở y tế và phòng xét nghiệm áp dụng kỹ thuật ARMS-PCR để sàng lọc và chẩn đoán các đột biến β-thalassemia phổ biến, nhằm nâng cao hiệu quả chẩn đoán với chi phí hợp lý trong vòng 1-2 năm tới.

2. Phát triển kỹ thuật lai điểm ngược: Đầu tư nghiên cứu và tối ưu hóa kỹ thuật lai điểm ngược để phát hiện đồng thời nhiều đột biến, giảm thời gian xét nghiệm và tăng độ chính xác, hướng tới sản xuất bộ kit chẩn đoán nội địa trong 3-5 năm.

3. Tăng cường đào tạo nhân lực: Tổ chức các khóa đào tạo chuyên sâu về kỹ thuật phân tử cho cán bộ y tế và kỹ thuật viên xét nghiệm nhằm nâng cao năng lực thực hiện và phân tích kết quả, đảm bảo chất lượng xét nghiệm.

4. Xây dựng chương trình tầm soát cộng đồng: Áp dụng các kỹ thuật phân tử hiện đại trong chương trình sàng lọc trước hôn nhân và chẩn đoán trước sinh, giảm thiểu tỷ lệ sinh con mắc bệnh β-thalassemia thể nặng trong vòng 5 năm tới.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhân viên y tế và kỹ thuật viên xét nghiệm: Nắm bắt kiến thức và kỹ thuật mới trong phát hiện đột biến gen β-thalassemia, nâng cao kỹ năng thực hành và phân tích kết quả xét nghiệm.

2. Nhà nghiên cứu di truyền y học: Tham khảo phương pháp nghiên cứu, kết quả và phân tích để phát triển các nghiên cứu sâu hơn về bệnh di truyền tại Việt Nam và khu vực.

3. Bác sĩ chuyên khoa huyết học và di truyền: Ứng dụng kết quả nghiên cứu trong chẩn đoán, tư vấn và điều trị bệnh nhân β-thalassemia, đặc biệt trong các chương trình tầm soát và chẩn đoán trước sinh.

4. Cơ quan quản lý y tế và chính sách: Sử dụng dữ liệu và đề xuất để xây dựng chính sách y tế, chương trình phòng chống bệnh di truyền hiệu quả, phù hợp với điều kiện thực tế của Việt Nam.

Câu hỏi thường gặp

1. Kỹ thuật ARMS-PCR có ưu điểm gì so với các phương pháp khác?
   ARMS-PCR cho phép phát hiện nhanh, chính xác các đột biến điểm đã biết, chi phí thấp và dễ thực hiện, phù hợp cho sàng lọc đại trà. Ví dụ, trong nghiên cứu, ARMS-PCR đạt độ chính xác trên 95% so với giải trình tự.

2. Lai điểm ngược khác gì so với lai điểm truyền thống?
   Lai điểm ngược cố định đầu dò trên màng, lai với sản phẩm PCR đánh dấu, cho phép phát hiện đồng thời nhiều đột biến trong một lần thực hiện, tiết kiệm thời gian và vật tư hơn so với lai điểm truyền thống.

3. Tại sao cần kết hợp phân tích hemoglobin với phân tích gen?
   Phân tích hemoglobin giúp đánh giá kiểu hình bệnh, trong khi phân tích gen xác định chính xác đột biến gây bệnh. Sự kết hợp giúp chẩn đoán toàn diện và chính xác hơn, đặc biệt với các trường hợp đột biến vùng promoter hoặc không điển hình.

4. Phương pháp nào phù hợp cho sàng lọc cộng đồng?
   ARMS-PCR và PCR đa mồi là lựa chọn phù hợp do chi phí thấp, dễ thực hiện và cho kết quả nhanh. Lai điểm ngược có thể áp dụng khi cần phát hiện nhiều đột biến đồng thời với độ chính xác cao hơn.

5. Làm thế nào để tối ưu kỹ thuật lai điểm ngược?
   Cần tối ưu điều kiện lai và rửa để cân bằng giữa độ nhạy và độ đặc hiệu, lựa chọn đầu dò phù hợp, kiểm soát nồng độ sản phẩm PCR và sử dụng màng nylon chất lượng cao. Nghiên cứu đã thành công trong việc tối ưu các điều kiện này cho 4 đột biến phổ biến.

Kết luận

• Nghiên cứu đã xây dựng thành công kỹ thuật ARMS-PCR và tối ưu kỹ thuật lai điểm ngược để phát hiện đồng thời các đột biến phổ biến trên gen β-globin ở người Việt Nam.
• Tỷ lệ đột biến Cd 17, Cd 26, Cd 41/42 và Cd 95 chiếm phần lớn trong các mẫu bệnh phẩm, phù hợp với đặc điểm di truyền khu vực.
• Kết quả phân tích gen tương đồng cao với phân tích hemoglobin và giải trình tự, khẳng định độ tin cậy của phương pháp.
• Đề xuất triển khai rộng rãi các kỹ thuật phân tử này trong chẩn đoán và tầm soát β-thalassemia tại Việt Nam.
• Các bước tiếp theo bao gồm đào tạo nhân lực, phát triển bộ kit lai điểm ngược nội địa và xây dựng chương trình sàng lọc cộng đồng hiệu quả.

Hành động ngay hôm nay để nâng cao năng lực chẩn đoán và phòng ngừa β-thalassemia, góp phần cải thiện sức khỏe cộng đồng và giảm gánh nặng bệnh tật tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

mở đầu: Có 9 đột biến liên quan tới codon ATG là tín hiệu bắt đầu dịch mã dẫn tới kiểu hình βo-thalassemia [70].  Đột biến vô nghĩa: Một số đột biến thay thế dẫn tới kết thúc sớm chuỗi β-globin. Nguyên nhân là do đột biến trực tiếp tạo codon kết thúc hoặc thêm hay mất một vài nucleotide dẫn tới thay đổi khung đọc mở, tạo 6 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] codon kết thúc sớm. Ví dụ, đột biến tại Cd 17 (A→T) của exon 1, làm thay đổi axit amin lysine chuyển thành thymine, đƣợc phiên mã thành bộ ba kết thúc UAG ở mRNA là đột biến phổ biến ở Thái Lan và Việt Nam [12,57].

 Đột biến khung: Thêm hoặc mất một hoặc vài nucleotide làm thay đổi khung đọc mở tạo kiểu hình β+-thalassemia. Điển hình nhƣ đột biến mất nucleotide A tại Cd 6 phổ biến ở khu vực Địa Trung Hải, đột biến gây lệch khung đọc do mất 4 nucleotide TCTT tại Cd 41 và 42 phổ biến ở Trung Quốc, Ấn Độ và Việt Nam [15,57]. Các đột biến trên gen β-globin gây bệnh β-thalassemia [45]. Tại Việt Nam, theo nghiên cứu của Svasti cho thấy có 8 đột biến thƣờng gặp, chiếm khoảng 95% các trƣờng hợp β-thalassemia bao gồm: Cd 17 (A→T), Cd 41/42 (-TCTT), -28 (A→G), Cd 71/72 (+A), IVS1.4 Đặc điểm kiểu hình của bệnh β-thalassemia Dựa vào biểu hiện lâm sàng, bệnh β-thalassemia đƣợc chia thành ba thể chính: thể nặng, thể trung gian, thể nhẹ (Bảng 1.

Đặc điểm kiểu hình của bệnh β-thalassemia [30] Kiểu hình Kiểu gen đột biến Chỉ số hồng cầu Đặc điểm Hb 7 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] β- β+/β+ Hb <7 g/dL HbA2 tăng thalassemia βo/βo MCV: 50-60 fL HbF: 70-90% thể nặng β+/β+ MCH: 14-20 pg β- β+/β++ Hb: 6-10 g/dL HbA2 tăng thalassemia β+/βo MCV: 55-70 fL HbF tăng đến thể trung βo/βo + yếu tố ảnh MCH: 15-23 pg 100% gian hƣởng β++/β Hb nam: 9-15 HbA2 >3.2% β+/β g/dL HbF: 0,5-6% β- Hb nữ: 9-13 thalassemia βo/β g/dL thể nhẹ MCV: 55-75 fL MCH: 19-25 pg β-thalassemia thể nặng: Trẻ sơ sinh mắc bệnh β-thalassemia thể nặng có biểu hiện lâm sàng rất sớm, từ 6 tháng đến 24 tháng tuổi. Trẻ bị tình trạng thiếu máu nghiêm trọng. Do đó, cần đƣợc điều trị bằng truyền máu thƣờng xuyên. Trẻ kém phát triển, có thể gặp các vấn đề nhƣ tiêu chảy, sốt, bụng to, lách to, xanh xao, vàng da, dị tật xƣơng bao gồm xƣơng dài ở chân, điển hình là thay đổi hộp sọ và mặt [23].

Bệnh nhân thalassemia thể nặng có số lƣợng tế bào hồng cầu tăng lên, thể tích trung bình của hồng cầu (MCV) thấp, lƣợng hemoglobin trung bình trong mỗi hồng cầu (MCH) ở mức trung bình [13]. β-thalassemia thể trung gian: Bệnh nhân β-thalassemia thể trung gian có biểu hiện lâm sàng nhẹ hơn thể nặng, không yêu cầu hoặc chỉ thỉnh thoảng phải truyền máu. Trẻ em biểu hiện bệnh rõ ràng ở độ tuổi từ 2 đến 6. Trẻ bị chậm phát triển hoặc hoàn toàn không có biểu hiện gì cho tới khi trƣởng thành ngoại trừ thiếu máu nhẹ [23].

β-thalassemia thể nhẹ: Bệnh nhân thể nhẹ thƣờng không có biểu hiện lâm sàng, nhƣng thỉnh thoảng thiếu máu nhẹ. Khi cả hai bố mẹ bị thể nhẹ thì xác suất 25% con sinh ra có nguy cơ mắc bệnh β-thalassemia thể nặng [23]. 8 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Các đặc điểm huyết học đặc trƣng là tế bào hồng cầu nhỏ và nhợt nhạt hơn so với bình thƣờng, tăng HbA2 [13]. Ngoài ra, còn có các thể β-thalassemia khác nhƣ: thể phối hợp Hemoglobin E (HbE) và β-thalassemia; thể phối hợp β-thalassemia và α- thalassemia.

Thể phối hợp Hemoglobin E (HbE) và β-thalassemia: Đột biến ở Cd 26 (G→A) thuộc exon 1, làm thay đổi axit amin glutamate thành lysin, tạo thể HbE [70]. Kiểu gen dị hợp tử hoặc đồng hợp tử HbE mà không phối hợp với β-thalassemia chỉ gây kiểu hình β-thalassemia thể nhẹ. Tuy nhiên ở những trẻ này vẫn có biểu hiện chậm phát triển ở mức độ vừa phải, thiếu máu nhẹ, ảnh hƣởng đến phát triển thể lực và tinh thần [70]. Sự kết hợp của HbE với β-thalassemia làm cho biểu hiện lâm sàng trở nên đa dạng, có thể thay đổi giống nhƣ thalassemia từ thể nặng đến thể nhẹ [70]: - β-thalassaemia/HbE thể nhẹ: không cần điều trị và hiếm khi biểu hiện các triệu chứng lâm sàng, nồng độ hemoglobin từ 9-12 g/dl.

Thể HbE kết hợp với các đột biến -28 (A→G) hoặc Cd 19 (A→G) có thể dẫn tới kiểu hình thể nhẹ [70]. - β-thalassaemia/HbE thể trung gian: triệu chứng giống với β- thalassemia thể trung gian, nồng độ hemoglobin từ 6-7 g/dl. Thể HbE kết hợp với đột biến IVS1. - β-thalassaemia/HbE thể nặng: triệu chứng giống với β-thalassemia thể nặng, nồng độ hemoglobin thấp, chỉ từ 4-5 g/dl.

Thể HbE kết hợp với các đột biến Cd 17 (A→T) hoặc Cd 41/42 (-TCTT) có thể dẫn tới kiểu hình thể nặng [70]. 9 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Thể phối hợp β-thalassemia và α-thalassemia: Sự kết hợp đột biến α- thalassemia có thể làm giảm mức độ nghiêm trọng của β-thalassemia thể nặng thành thể trung gian. Trong hầu hết các trƣờng hợp bệnh đều có liên quan đến kết hợp 3 gen α-globin (ααα/). Thừa hai gen α-globin (ααα/ααα) hoặc (αααα/αα) kết hợp với β-thalassemia thể nhẹ tạo thalassaemia thể trung gian [8,24].

Tuy nhiên, khi thừa một gen α (ααα/αα) thì kiểu hình lâm sàng phụ thuộc vào mức độ nghiêm trọng của đột biến β-thalassemia [10,62].5 Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh 1.1 Chẩn đoán lâm sàng Trẻ bị thalassemia thể nặng sau hai tuổi bị nghi ngờ mắc bệnh β- thalassemia với các biểu hiện thiếu máu nặng, vàng da, lách to. Trẻ bị thalassemia thể trung gian có biểu hiện lâm sàng nhẹ hơn. Với trẻ mang gen bệnh thƣờng không có triệu chứng, đôi khi chỉ là thiếu máu nhẹ [22].2 Chẩn đoán huyết học Chỉ số hồng cầu: Bệnh nhân thalassemia thể nặng có nồng độ hemoglobin (Hb) giảm (<7 g/dl), thể tích trung bình hồng cầu (MCV) trong khoảng 50-60 fl và lƣợng hemoglobin trung bình trong một hồng cầu (MCH) từ 14-20 pg. Bệnh nhân thalassemia thể trung bình có nồng độ Hb từ 6-10 g/dl, MCV từ 55-70 fl và MCH từ 15-23 pg.

Bệnh nhân thalassemia thể nhẹ có nồng độ Hb từ 9-15 g/dL đối với nam và 9-13 g/dL (đối với nữ), MCV từ 55-75 fL, MCH từ 19-25 pg (Bảng 1) [30]. Phân tích tế bào máu ngoại vi: Quan sát dƣới kính hiển vi, ngƣời bị bệnh thalassemia có hồng cầu nhợt nhạt, nhỏ hơn so với bình thƣờng, phần lớn có hình dạng bất thƣờng [13]. Phân tích hemoglobin: Hầu hết các quy trình chẩn đoán bệnh nhân thalassemia hiện nay đều sử dụng phƣơng pháp phân tích các chỉ số hồng cầu 10 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] để sàng lọc ban đầu. Sau đó, sử dụng kỹ thuật sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography - HPLC) để phân tích hemoglobin trong mẫu dựa trên các chỉ số MCV nhỏ hơn 78 fl và/hoặc MCH nhỏ hơn 27 pg [19].

Tuy vậy, quy trình này không đƣợc sử dụng phổ biến ở vùng nông thôn các khu vực Đông Nam Á, Nam Á do điều kiện vật chất và thiết bị không đủ. Thay vào đó, tại các quốc gia nhƣ Thái Lan và Ấn Độ, việc sử dụng xét nghiệm tủa HbE để sàng lọc HbE (Dichlorophenol Indophenol Test - DCIP) là lựa chọn thay thế đơn giản và chi phí thấp để sàng lọc sơ bộ β-thalassemia [22]. Hemoglobin trong hồng cầu thay đổi tùy từng giai đoạn phát triển của cơ thể. Hemoglobin thời kì bào thai (từ tháng thứ 3 đến khi sinh) là HbF, đƣợc tạo thành từ 2 chuỗi alpha globin và gamma globin (α2γ2).

Sau khi sinh, chuỗi γ (HbF) không đƣợc tổng hợp, thay thế vào đó là chuỗi β, tạo hemoglobin ở ngƣời trƣởng thành gồm HbA1 với 2 chuỗi alpha globin và beta globin (α2β2) và HbA2 với 2 chuỗi alpha globin và delta globin (α2δ2) [11]. Trong điều kiện bình thƣờng, hồng cầu ngƣời trƣởng thành có khoảng 98% HbA1, 2% HbA2 và rất ít HbF [11]. Các trƣờng hợp bệnh β-thalassemia, chuỗi β-globin không đƣợc tổng hợp đầy đủ, làm tăng sản xuất các chuỗi γ, δ, α dẫn tới tình trạng giảm HbA1, tăng HbF và HbA2. Đối với các trƣờng hợp có đột biến Cd 26 gây thể HbE sẽ có hiện diện HbE≥25% trên điện di Hb [11].

Do đó, HbA1, HbF, HbA2, HbE đƣợc coi là các tiêu chuẩn điện di hemoglobin đóng vai trò quyết định để chẩn đoán bệnh β-thalassemia [11]. HbA2≥4,0% là chỉ số thƣờng đƣợc dùng để chẩn đoán β-thalassemia. Trƣờng hợp HbA2≥4,0% và chỉ số hồng cầu giảm, đƣợc chẩn đoán là mang gen bệnh β-thalassemia. Khi HbA2>4,0%, nhƣng chỉ số hồng cầu bình thƣờng, ngƣời bệnh có thể thiếu vitamin B12/folate, bệnh gan hoặc nhiễm HIV.

Các trƣờng hợp có HbA2 từ 3,3-3,9% cần khẳng định bằng phân tích ADN. Tuy nhiên, 11 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] mức độ HbA2 và/hoặc chỉ số hồng cầu có thể bình thƣờng ở ngƣời bệnh β- thalassemia có gen β-globin bị đột biến vùng promoter hoặc đuôi poly A. Khi đỉnh HbA2>10%, ngƣời bệnh có thể có các biến thể hemoglobin khác, ví dụ HbE, HbS,. Sơ đồ sàng lọc ngƣời lành mang gen bệnh β-thalassemia đƣợc trình bày ở Hình 1.

Biểu đồ sàng lọc ngƣời bệnh β-thalassemia [14].3 Phân tích di truyền phân tử Hầu hết các kỹ thuật phát hiện các đột biến trên gen β-globin hiện nay thƣờng dựa trên PCR, đƣợc chia thành hai nhóm chính: lai oligonucleotide đặc hiệu allen và mồi đặc hiệu allen [23]. 12 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Lai oligonucleotide đặc hiệu allen (Allele - specific oligonucleotide hybridization): Trong nhóm phƣơng pháp này, yêu cầu thiết kế hai đầu dò oligonucleotide, một đầu dò bổ sung với trình tự ADN đột biến và một đầu dò bổ sung với trình tự bình thƣờng tại cùng vị trí. Các đầu dò này thƣờng chỉ sai khác nhau một nucleotide. Dựa trên nguyên tắc này, kỹ thuật lai điểm (dot blot) đã đƣợc phát triển và áp dụng thành công ở nhiều phòng thí nghiệm.

Tại Địa Trung Hải năm 1989, kỹ thuật này đã đƣợc Ristaldi và cs. sử dụng để sàng lọc 8 đột biến trên gen β-globin [48]. Trong kỹ thuật lai điểm, trình tự ADN đích đƣợc cố định trên màng nylon, sau đó lai với đầu dò đƣợc đánh dấu. Tuy nhiên, trong trƣờng hợp sàng lọc nhiều đột biến, kỹ thuật lai điểm gây tốn thời gian do các bƣớc lai và rửa cần riêng biệt đối với từng đột biến.

Do đó, kỹ thuật lai điểm ngƣợc (reverse dot blot) đã đƣợc phát triển cho phép phát hiện đƣợc đồng thời nhiều đột biến. Đầu dò đƣợc cố định trên màng nylon, sau đó lai với ADN đƣợc đánh dấu. Các bƣớc lai và rửa đƣợc tiến hành đồng thời đối với tất cả các đột biến [53]. Mồi đặc hiệu allen (Allele - specific priming): Nhóm phƣơng pháp này dựa trên nguyên tắc mồi PCR bắt cặp hoàn toàn với khuôn sẽ có hiệu quả kéo dài hơn so với mồi có nucleotide bắt cặp sai, đặc biệt tại đầu 3‟ [42].