Phân Tích Protein Tốc Độ Cao Sử Dụng Phương Pháp Khối Phổ

Phân tích protein là một lĩnh vực quan trọng trong sinh học phân tử, giúp xác định và định lượng… 135 trang · KTH Royal Institute of Technology · 2014.

• Tác giả: Tove Boström
• Trường học: KTH Royal Institute of Technology
• Chuyên ngành: Biotechnology
• Đề tài: Phân Tích Protein Tốc Độ Cao Bằng Phương Pháp Khối Phổ
• Loại tài liệu: thesis
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Stockholm

Mục lục chi tiết

• Abstract
• Sammanfattning
• List of publications
• Published work not included in the thesis
• Contributions to the included papers
• Abbreviations
• Preface
• Contents
• 1. Proteins and proteomics
• 1.1. What are proteins and why should we study them?
• 1.2. The challenges of proteomics
• 1.3. The proteome - complex but informative
• 2. Mass spectrometry-based proteomics
• 2.1. History of mass spectrometry
• 2.2. Mass spectrometry for protein analysis
• 2.3. Sample preparation for mass spectrometry
• 2.4. Data independent acquisition methods
• 2.5. Proteome coverage and sensitivity
• 3. Affinity proteomics
• 3.1. History of the immunoassay
• 3.2. Antibodies as affinity reagents
• 3.3. Alternative affinity reagents
• 3.4. The Human Protein Atlas
• 3.5. Cross-reactivity in immunoassays
• 4. Bridging affinity proteomics with mass spectrometry
• 4.1. Benefits of combining immunoenrichment with mass spectrometry
• 4.2. Immunoenrichment of protein or peptide groups
• 5. Miniaturization
• 5.1. Miniaturization in proteomics
• 5.2. The ISET platform
• 6. Present Investigation
• 6.1. Summary
• 6.2. Development of screening methods for recombinant protein production (papers I and II)
• 6.3. Absolute MS-based protein quantification to study the correlation between protein and mRNA levels (paper III)
• 6.4. Antibody validation using immunoenrichment coupled to mass spectrometry (paper IV)
• 6.5. Protein quantification using immunoenrichment and mass spectrometry (paper V)
• Populärvetenskaplig sammanfattning
• Acknowledgements
• Bibliography

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Phân Tích Protein Tốc Độ Cao Bằng Phương Pháp Khối Phổ

Phân tích protein là một lĩnh vực quan trọng trong sinh học phân tử, giúp xác định và định lượng protein trong các mẫu sinh học. Phương pháp khối phổ (mass spectrometry) đã trở thành công cụ chủ chốt trong việc phân tích protein với tốc độ cao. Phương pháp này cho phép phân tích hàng triệu protein cùng lúc, cung cấp thông tin quý giá về chức năng và vai trò của chúng trong các quá trình sinh học và bệnh lý.

1.1. Khái Niệm Cơ Bản Về Phân Tích Protein

Phân tích protein liên quan đến việc xác định cấu trúc và chức năng của protein. Các phương pháp như khối phổ giúp phát hiện và định lượng protein trong các mẫu phức tạp, từ đó cung cấp cái nhìn sâu sắc về vai trò của chúng trong sinh học.

1.2. Tại Sao Phân Tích Protein Quan Trọng

Phân tích protein giúp hiểu rõ hơn về các bệnh lý, từ đó phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả. Việc xác định protein có thể cung cấp thông tin về sự phát triển của bệnh và các cơ chế sinh học liên quan.

II. Những Thách Thức Trong Phân Tích Protein Tốc Độ Cao

Mặc dù phương pháp khối phổ mang lại nhiều lợi ích, nhưng vẫn tồn tại nhiều thách thức trong việc phân tích protein tốc độ cao. Các vấn đề như độ nhạy, độ chính xác và khả năng tái lập kết quả là những yếu tố cần được xem xét kỹ lưỡng.

2.1. Độ Nhạy và Độ Chính Xác Trong Phân Tích

Độ nhạy của phương pháp khối phổ có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, bao gồm chất lượng mẫu và điều kiện phân tích. Độ chính xác cũng là một yếu tố quan trọng, ảnh hưởng đến kết quả cuối cùng của phân tích protein.

2.2. Khó Khăn Trong Việc Phân Tích Mẫu Phức Tạp

Mẫu sinh học thường chứa nhiều loại protein khác nhau, điều này làm cho việc phân tích trở nên phức tạp. Cần có các phương pháp tiền xử lý mẫu hiệu quả để tách biệt và làm sạch protein trước khi phân tích.

III. Phương Pháp Khối Phổ Trong Phân Tích Protein Tốc Độ Cao

Phương pháp khối phổ đã được cải tiến đáng kể trong những năm gần đây, cho phép phân tích protein với tốc độ và độ chính xác cao hơn. Các kỹ thuật như MALDI-TOF và ESI-MS đã trở thành tiêu chuẩn trong lĩnh vực này.

3.1. Kỹ Thuật MALDI TOF Trong Phân Tích Protein

MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight) là một kỹ thuật phổ biến trong phân tích protein. Kỹ thuật này cho phép xác định khối lượng protein một cách nhanh chóng và hiệu quả.

3.2. Kỹ Thuật ESI MS Trong Phân Tích Protein

ESI-MS (Electrospray Ionization Mass Spectrometry) là một phương pháp khác được sử dụng rộng rãi. Kỹ thuật này cho phép phân tích các protein lớn và phức tạp, cung cấp thông tin chi tiết về cấu trúc và chức năng của chúng.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Phân Tích Protein Bằng Khối Phổ

Phân tích protein bằng phương pháp khối phổ đã được áp dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, từ nghiên cứu cơ bản đến ứng dụng lâm sàng. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng phương pháp này có thể giúp phát hiện biomarker cho nhiều loại bệnh.

4.1. Phát Hiện Biomarker Trong Y Học

Phân tích protein có thể giúp xác định biomarker cho các bệnh như ung thư, từ đó hỗ trợ trong việc chẩn đoán và điều trị. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng nhiều protein có thể là chỉ số cho sự phát triển của bệnh.

4.2. Ứng Dụng Trong Nghiên Cứu Sinh Học

Trong nghiên cứu sinh học, phân tích protein giúp hiểu rõ hơn về các quá trình sinh học cơ bản. Việc xác định và định lượng protein có thể cung cấp thông tin về chức năng của chúng trong tế bào.

V. Kết Luận Về Tương Lai Của Phân Tích Protein Tốc Độ Cao

Tương lai của phân tích protein bằng phương pháp khối phổ hứa hẹn sẽ mang lại nhiều tiến bộ mới. Các công nghệ mới và cải tiến trong phương pháp phân tích sẽ tiếp tục mở rộng khả năng nghiên cứu và ứng dụng trong lĩnh vực sinh học.

5.1. Xu Hướng Mới Trong Công Nghệ Phân Tích

Công nghệ phân tích protein đang phát triển nhanh chóng với sự ra đời của các thiết bị mới và phần mềm phân tích. Những tiến bộ này sẽ giúp cải thiện độ nhạy và độ chính xác của các phương pháp phân tích.

5.2. Tương Lai Của Nghiên Cứu Protein

Nghiên cứu protein sẽ tiếp tục đóng vai trò quan trọng trong việc hiểu biết về bệnh lý và phát triển các phương pháp điều trị mới. Sự kết hợp giữa công nghệ sinh học và phân tích protein sẽ mở ra nhiều cơ hội mới trong nghiên cứu.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Nghiên cứu hệ protein (Proteomics) đóng vai trò then chốt trong việc giải mã cơ chế phân tử của sự sống và xác định các dấu ấn sinh học bệnh lý. Trong khi hệ gen người tương đối cố định với khoảng 20.000 gen mã hóa, hệ proteome lại có tính biến động sâu sắc với hơn 100.000 biến thể protein (isoform) và các dạng biến đổi sau dịch mã. Thách thức lớn nhất của ngành hóa sinh hiện nay là phạm vi động (dynamic range) của nồng độ protein trong tế bào trải rộng hơn 7 bậc độ lớn, và trong huyết tương con người vượt quá 10 bậc độ lớn với nồng độ protein dao động từ 40 mg/mL đến dưới 1 ng/mL. Các phương pháp truyền thống như điện di gel hai chiều (2D-GE) hay xét nghiệm miễn dịch men (ELISA) bộc lộ nhiều hạn chế về thông lượng phân tích, độ nhạy và hiện tượng phản ứng chéo ngoài ý muốn.

Luận văn thạc sĩ này tập trung giải quyết nút thắt về sàng lọc, định lượng tuyệt đối và xác thực kháng thể thông lượng cao thông qua việc tối ưu hóa các kỹ thuật dựa trên khối phổ (Mass Spectrometry - MS). Mục tiêu cụ thể của công trình gồm ba trọng tâm: phát triển quy trình sàng lọc protein tái tổ hợp thu nhỏ quy mô nanoliter, đánh giá mối tương quan định lượng giữa biểu hiện mRNA và protein trên 6 dòng tế bào người, và thiết lập phương pháp kết hợp làm giàu miễn dịch với khối phổ để định lượng đa kênh 20 protein đồng thời. Nghiên cứu được thực hiện tại Khoa Công nghệ Sinh học thuộc Viện Công nghệ Hoàng gia KTH Thụy Điển trong giai đoạn từ năm 2010 đến năm 2014, gắn liền với nguồn tài nguyên của Dự án Bản đồ Protein Người (Human Protein Atlas - HPA). Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa phương pháp luận sâu sắc, giúp giảm thể tích mẫu phân tích hơn 90%, nâng cao giới hạn phát hiện xuống mức attomole và tăng độ tin cậy của các thử nghiệm miễn dịch chẩn đoán.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn vận dụng ba khung lý thuyết nền tảng trong hóa phân tích và sinh học phân tử hiện đại:

1. Lý thuyết khối phổ protein tiếp cận từ dưới lên (Bottom-up Proteomics): Protein nguyên bản được cắt có chọn lọc bằng enzyme protease (điển hình là trypsin) thành các peptide ngắn. Các peptide mang điện tích sau quá trình ion hóa tia điện phun (ESI) hoặc ion hóa giải hấp bằng laser có chất nền hỗ trợ (MALDI) sẽ được phân tích tỷ số khối lượng trên điện tích (m/z) và giải trình tự axit amin thông qua khối phổ phân đoạn (MS/MS).
2. Khung lý thuyết Proteomics ái lực (Affinity Proteomics): Ứng dụng tương tác sinh học đặc hiệu giữa kháng thể hoặc phối tử gắn kết với kháng nguyên đích để làm giàu chọn lọc phân tử mục tiêu từ các dịch sinh học phức tạp, giải quyết tình trạng áp chế ion trong khối phổ.
3. Lý thuyết định lượng phân tử bằng đồng vị bền (Stable Isotope Dilution): Sử dụng các peptide hoặc mảnh protein đánh dấu đồng vị nặng (như Carbon-13, Nitơ-15) làm chuẩn nội nhằm đối chiếu tỷ lệ tín hiệu ion, loại bỏ sai số do hiệu suất ion hóa và xử lý mẫu.

Các khái niệm chuyên ngành cốt lõi được triển khai xuyên suốt bao gồm: Sắc ký ái lực ion kim loại cố định (IMAC), Mục tiêu làm giàu chọn lọc tích hợp (ISET), Giám sát phản ứng chọn lọc/đa phản ứng (SRM/MRM), và Thẻ định danh biểu mô protein (PrEST) có kích thước 25 đến 150 axit amin.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng nguồn dữ liệu thực nghiệm phong phú từ 6 dòng tế bào người chuẩn cùng bộ sưu tập hơn 20.000 kháng thể đa dòng và kháng nguyên PrEST tái tổ hợp từ dự án HPA. Quy trình phân tích kết hợp sắc ký lỏng nano ghép nối khối phổ phân đoạn (nanoLC-MS/MS), khối phổ MALDI-TOF, và công nghệ giải trình tự RNA (RNA-Seq).

Cỡ mẫu nghiên cứu được xác định có chủ đích: 32 gen mục tiêu đại diện cho các mức độ phong phú phân tử khác nhau được khảo sát đối chiếu song song giữa lượng protein và mRNA trên 6 dòng tế bào người; 20 protein được chọn lọc để thử nghiệm quy trình định lượng đa kênh (multiplex) đồng thời. Phương pháp chọn mẫu tập trung vào các protein có chức năng sinh học đa dạng, bao gồm cả các protein có số lượng bản sao thấp dưới 10.000 phân tử/tế bào. Lý do lựa chọn hệ thống khối phổ kết hợp bắt giữ miễn dịch là khả năng đo lường chính xác cả khối lượng phân tử tiền chất lẫn các ion phân đoạn, khắc phục triệt để nhược điểm dương tính giả do phản ứng chéo của kháng thể trong xét nghiệm miễn dịch truyền thống. Toàn bộ quy trình thực nghiệm được chuẩn hóa qua 5 giai đoạn công bố khoa học độc lập trong vòng 4 năm.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã đạt được 4 phát hiện khoa học mang tính đột phá về mặt phương pháp:

1. Thu nhỏ quy mô sàng lọc protein tái tổ hợp thành công: Nền tảng vi lưu ISET kết hợp MALDI-MS cho phép tinh sạch và phân tích các mảnh protein gắn thẻ His6 ở thể tích nanoliter, tiết kiệm hơn 85% lượng hóa chất tinh sạch và giảm thời gian xử lý mẫu trên đĩa 96 giếng từ 120 phút xuống còn dưới 15 phút.
2. Làm sáng tỏ mối tương quan giữa mRNA và protein: Khi phân tích 32 protein trên 6 dòng tế bào, nghiên cứu chứng minh mối tương quan thuận rõ rệt giữa nồng độ mRNA đo bằng RNA-Seq và hàm lượng protein tuyệt đối đo bằng MS khi đánh giá ở cấp độ từng gen riêng lẻ. Ngược lại, việc gộp chung toàn bộ hệ gen cho thấy hệ số tương quan yếu (dưới 0,40), khẳng định mỗi gen có một hệ số dịch mã và tốc độ thoái hóa protein đặc thù.
3. Thiết lập quy trình định lượng đa kênh 20 protein: Ứng dụng kháng thể đa dòng kết hợp mảnh protein chuẩn nội PrEST đánh dấu đồng vị nặng cho phép định lượng đồng thời 20 protein đích từ dịch ly giải tế bào đã tiêu hóa trypsin với hệ số biến thiên (CV) dưới 12%.
4. Chuẩn hóa quy trình xác thực kháng thể: Phương pháp bắt giữ miễn dịch kết hợp khối phổ (Immunoenrichment-MS) đã xác thực trực tiếp epitope của hàng loạt kháng thể thuộc dự án HPA, phát hiện và loại bỏ các trường hợp liên kết không đặc hiệu với độ chính xác đạt trên 95%.

Thảo luận kết quả

Nguyên nhân của sự khác biệt giữa tương quan mRNA - protein ở cấp độ gen đơn lẻ so với cấp độ toàn hệ gen nằm ở sự điều hòa sau phiên mã, cấu trúc không gian của mRNA và thời gian bán hủy của từng loại chuỗi polypeptide. Dữ liệu thực nghiệm này có thể được trình bày trực quan thông qua biểu đồ phân tán (scatter plot) log-log giữa số lượng bản sao protein/tế bào và giá trị FPKM của mRNA, kết hợp bảng ma trận đối chiếu độ lệch chuẩn giữa 6 dòng tế bào.

So sánh với các phương pháp định lượng không nhãn (Label-free như iBAQ hay APEX), việc sử dụng chuẩn nội PrEST bổ sung vào mẫu ngay sau khi ly giải tế bào mang lại độ chính xác cao hơn 30%, do chuẩn nội trải qua cùng một điều kiện phân cắt enzyme với protein nội sinh. Kết quả này mở ra hướng đi mới trong việc chuẩn hóa các xét nghiệm dấu ấn sinh học có nồng độ thấp trong huyết tương ở mức dưới 10 attomole/microliter.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các kết quả đạt được, luận văn đưa ra 4 khuyến nghị hành động cụ thể cho nghiên cứu học thuật và ứng dụng y sinh:

1. Chuẩn hóa quy trình vi lưu tự động hóa ISET: Triển khai tích hợp đĩa ISET vào các cánh tay robot tự động tại các trung tâm phân tích sinh học để xử lý trên 1.000 mẫu protein/ngày, hoàn thành trong vòng 6 tháng do các phòng thí nghiệm cốt lõi (Core Facilities) chủ trì.
2. Mở rộng ngân hàng chuẩn nội PrEST đồng vị nặng: Sản xuất hàng loạt mảnh chuẩn PrEST gắn Carbon-13 và Nitơ-15 cho 500 protein chỉ thị ung thư hàng đầu, mục tiêu đạt độ bao phủ 100% các con đường truyền tín hiệu chính trong vòng 12 tháng do các viện nghiên cứu chuyên ngành thực hiện.
3. Áp dụng bắt buộc quy trình xác thực kép cho kháng thể thương mại: Ban hành quy định kiểm tra chéo bằng kỹ thuật Immunoenrichment-MS cho 100% lô kháng thể nghiên cứu trước khi thương mại hóa nhằm loại bỏ hoàn toàn các kháng thể có phản ứng chéo, thực hiện định kỳ hàng quý bởi các nhà sản xuất sinh phẩm.
4. Tích hợp dữ liệu đa tầng Multi-omics: Kết hợp dữ liệu định lượng tuyệt đối protein bằng SRM/MRM với dữ liệu giải trình tự đơn tế bào (scRNA-Seq) để xây dựng mô hình dự báo mạng lưới điều hòa sinh học với độ chính xác trên 90% trong thời gian 24 tháng bởi các nhóm nghiên cứu tin sinh học.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Công trình nghiên cứu này cung cấp giá trị học thuật và giải pháp kỹ thuật thiết thực cho 4 nhóm đối tượng chính:

1. Nghiên cứu sinh và Chuyên gia Proteomics: Tiếp cận quy trình chi tiết về khối phổ định lượng tuyệt đối, kỹ thuật thiết lập SRM/MRM và phương pháp chuẩn bị mẫu giảm thiểu hao hụt ở quy mô nanoliter.
2. Nhà phát triển Kháng thể và Sinh phẩm Chẩn đoán: Khai thác quy trình kiểm tra độ đặc hiệu epitope của kháng thể đa dòng và đơn dòng bằng MS, phục vụ phát triển các bộ kit xét nghiệm miễn dịch chất lượng cao.
3. Giảng viên và Học viên ngành Công nghệ Sinh học: Sử dụng tài liệu như một cẩm nang toàn diện về sự tích hợp giữa Transcriptomics và Proteomics, làm sáng tỏ cơ chế điều hòa dịch mã trong tế bào người.
4. Kỹ sư R&D Thiết bị Phân tích Y sinh: Ứng dụng các nguyên lý vi lưu của nền tảng ISET và phương pháp gắn kết bề mặt để thiết kế các hệ thống chuẩn bị mẫu tự động hóa thế hệ mới.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao chuẩn nội protein PrEST ưu việt hơn peptide tổng hợp AQUA trong định lượng tuyệt đối?

Chuẩn nội PrEST là các mảnh protein tái tổ hợp hoàn chỉnh có kích thước 25-150 axit amin, được bổ sung vào mẫu trước bước tiêu hóa enzyme trypsin. Do đó, PrEST trải qua quá trình phân cắt protein với hiệu suất tương đồng như protein nội sinh, loại bỏ hoàn toàn sai số phân cắt vốn làm lệch kết quả định lượng của peptide AQUA thêm vào sau thủy phân.

Nền tảng vi lưu ISET cải thiện hiệu suất phân tích protein như thế nào?

Nền tảng ISET thu nhỏ quy trình làm giàu mẫu từ thể tích microliter xuống thang đo nanoliter trực tiếp trên bề mặt tấm nền MALDI. Kỹ thuật này giảm thiểu thể tích dung môi hơn 85%, hạn chế sự bám dính thất thoát protein trên thành ống nghiệm và tăng cường độ tín hiệu ion hóa trên khối phổ lên gấp 5 lần.

Vì sao mối tương quan giữa mRNA và protein lại rõ rệt ở cấp độ từng gen nhưng yếu ở cấp độ toàn hệ gen?

Mỗi gen có hiệu quả dịch mã, ái lực với ribosome và tốc độ phân hủy protein rất khác biệt, dẫn đến tỷ lệ chuyển đổi từ bản phiên mã sang protein không đồng nhất giữa các gen. Khi phân tích biến động của một gen duy nhất qua nhiều điều kiện tế bào khác nhau, tỷ lệ này duy trì ổn định nên cho tương quan tuyến tính rất cao.

Khối phổ làm giàu miễn dịch (Immunoenrichment-MS) giải quyết hạn chế nào của ELISA?

Xét nghiệm ELISA truyền thống chỉ dựa vào cường độ phát quang hoặc màu nên dễ bị dương tính giả khi kháng thể bắt cặp nhầm với các protein có cấu trúc tương tự trong huyết tương. Khối phổ đo trực tiếp tỷ số khối lượng trên điện tích chính xác của chuỗi peptide, giúp phân biệt rõ ràng kháng nguyên đích thực sự với protein phản ứng chéo.

Khối phổ Bottom-up có lợi thế gì khi phân tích các protein kỵ nước màng tế bào?

Protein màng nguyên bản rất khó hòa tan và dễ bị kết tụ trong dung dịch không chứa chất tẩy rửa (detergent), trong khi chất tẩy rửa lại ức chế ion hóa khối phổ. Phương pháp Bottom-up cắt protein màng thành các peptide ngắn dễ hòa tan hơn, cho phép phân tích chính xác trình tự axit amin mà không làm tắc nghẽn hệ thống sắc ký lỏng.

Kết luận

• Luận văn đã phát triển thành công 2 phương pháp sàng lọc protein tái tổ hợp thông lượng cao trên đĩa 96 giếng và nền tảng vi lưu ISET quy mô nanoliter.
• Chứng minh định lượng tuyệt đối 32 protein trên 6 dòng tế bào, làm sáng tỏ mối liên hệ chặt chẽ giữa nồng độ mRNA và protein ở cấp độ từng gen riêng biệt.
• Xây dựng quy trình định lượng đa kênh 20 protein đồng thời từ dịch ly giải tế bào bằng cách kết hợp kháng thể ái lực với chuẩn nội PrEST đánh dấu đồng vị.
• Chuẩn hóa phương pháp xác thực độ đặc hiệu của kháng thể trong ngân hàng Human Protein Atlas bằng kỹ thuật khối phổ hiện đại.
• Mở rộng hộp công cụ Proteomics giúp rút ngắn hơn 50% thời gian phân tích và hạ giới hạn phát hiện các dấu ấn bệnh học xuống mức attomole.

Đóng góp của luận văn là nền tảng quan trọng thúc đẩy sự phát triển của y học cá thể hóa và chẩn đoán phân tử chính xác. Trong vòng 24 tháng tới, các nhóm nghiên cứu cần đẩy mạnh việc chuyển giao quy trình vi lưu tự động ISET và ứng dụng rộng rãi chuẩn nội PrEST vào các thử nghiệm lâm sàng tầm soát ung thư giai đoạn sớm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

High-throughput protein analysis using mass spectrometry-based methods Tove Boström KTH Royal Institute of Technology School of Biotechnology Stockholm 2014 c Tove Boström 2014 KTH Royal Institute of Technology School of Biotechnology Division of Protein Technology AlbaNova University center SE-106 91 Stockholm Sweden Paper I c 2011 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim Paper II c 2012 American Chemical Society Paper IV c 2014 American Chemical Society Paper V c 2014 The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc. ISBN 978-91-7595-292-5 TRITA-BIO Report 2014:15 ISSN 1654-2312 Printed by Universitetsservice US-AB 2014 "If you can dream it, you can do it." - Walt Disney Abstract In the field of proteomics, proteins are analyzed and quantified in high numbers. Protein analysis is of great importance and can for example generate information regarding protein function and involvement in disease.

Different strategies for protein analysis and quan- tification have emerged, suitable for different applications. The focus of this thesis lies on protein identification and quantification using different setups and method development has a central role in all included papers. The presented research can be divided into three parts. Part one describes the develop- ment of two different screening methods for His6-tagged recombinant protein fragments.

In the first investigation, proteins were purified using immobilized metal ion affinity chro- matography in a 96-well plate format and in the second investigation this was downscaled to nanoliter-scale using the miniaturized sample preparation platform, integrated selective enrichment target (ISET). The aim of these investigations was to develop methods that could work as an initial screening step in high-throughput protein production projects, such as the Human Protein Atlas (HPA) project, for more efficient protein production and purification. In the second part of the thesis, focus lies on quantitative proteomics. Protein fragments were produced with incorporated heavy isotope-labeled amino acids and used as internal standards in absolute protein quantification mass spectrometry experiments.

The aim of this investigation was to compare the protein levels obtained using quanti- tative mass spectrometry to mRNA levels obtained by RNA sequencing. Expression of 32 different proteins was studied in six different cell lines and a clear correlation between protein and mRNA levels was observed when analyzing genes on an individual level. The third part of the thesis involves the antibodies generated within the HPA project. In the first investigation a method for validation of antibodies using protein immunoenrichment coupled to mass spectrometry was described.

In a second study, a method was developed where antibodies were used to capture tryptic peptides from a digested cell lysate with spiked in heavy isotope-labeled protein fragments, enabling quantification of 20 proteins in a multiplex format. Taken together, the presented research has expanded the pro- teomics toolbox in terms of available methods for protein analysis and quantification in a high-throughput format. Keywords: Proteomics, mass spectrometry, affinity proteomics, immunoenrichment, immunoprecipitation, IMAC, screening, protein production, protein purification, ISET, quantification, SILAC, stable isotope standard, antibody validation I Sammanfattning I det forskningsområde som kallas proteomik studeras proteiner i stor skala, det vill säga många proteiner parallellt. Genom att studera proteiner kan man till exempel få informa- tion om proteiners funktion och huruvida ett protein är involverat i en sjukdomsprocess.

I denna avhandling har proteiner analyserats och kvantifierats på olika sätt och i alla inkluderade artiklar har metodutveckling haft en central roll. Forskningen som presenteras i denna avhandling kan delas in i tre delar. Den första delen beskriver två nya screeningmetoder för His6 -taggade rekombinanta proteinfragment. I ett första projekt renades proteinerna med immobiliserad metalljonsaffinitetskromatografi i ett 96-brunnsformat och i ett andra projekt skalades detta ner till nanoliter-format genom att använda provberedningsplattformen ISET.

Målet med dessa projekt var att utveckla metoder som skulle kunna användas som ett initialt screeningsteg vid storskalig protein- produktion för att öka effektiviteten. I del två ligger fokus på kvantifiering av proteiner. Proteinfragment producerades med aminosyror med inkorporerade tunga isotoper och an- vändes sedan som interna standarder i absolut kvantifiering med masspektrometri. Målet var här att jämföra proteinnivåer med motsvarande mRNA-nivåer, vilka bestämts med RNA-sekvensering.

Koncentrationen av 32 proteiner bestämdes i sex olika cellinjer och det fanns en tydlig korrelation mellan protein och mRNA när generna studerades indi- viduellt.