MỞ ĐẦU Huyết thanh là một hệ protein phức tạp, chứa nhiều protein có nguồn gốc và chức năng khác nhau, tác động lên nhiều cơ quan, nhiều quá trình sinh học khác nhau trong cơ thể. Những thay đổi về hàm lượng cũng như thành phần các protein trong huyết thanh thường có mối liên hệ chặt chẽ với các quá trình bệnh lý. Vì thế việc sử dụng huyết thanh cho mục đích nghiên cứu là một trong những cách tiếp cận đuợc quan tâm nhất trong nghiên cứu proteomics hiện nay. Tuy nhiên, thách thức lớn nhất trong nghiên cứu protein huyết thanh không chỉ ở số lượng rất lớn protein có mặt (khoảng 10000 loại), mà còn là tỷ lệ rất khác nhau của chúng.
Trong khi một số protein có nồng độ cao như albumin (50%-70%), immunoglobulin (8%- 10%)…, thì ngược lại, có rất nhiều protein, peptid có nồng độ rất thấp (ng/ml) như cytokin, hormon mà tổng nồng độ của chúng chỉ chiếm 1% hàm lượng protein tổng số. Những khác biệt rất lớn về nồng độ này cùng với sự hạn chế về mặt kỹ thuật của những phương pháp proteomics truyền thống (định lượng và định tính protein) đã làm cho việc nghiên cứu một số phân đoạn protein có hàm lượng thấp trong huyết thanh trở nên khó khăn và ít được chú ý trong một thời gian dài. Song gần đây, sự phát triển mạnh mẽ của các phương pháp nghiên cứu proteomics hiện đại với độ nhạy và độ chính xác cao đã cho phép các nhà nghiên cứu phân tách, nhận diện được nhiều protein tồn tại với hàm lượng tới fg/mL. Một số thành phần protein hàm lượng thấp trong huyết thanh đã bắt đầu được quan tâm nghiên cứu nhiều hơn.
Một trong những hướng nghiên cứu mới trong lĩnh vực này là nghiên cứu phân đoạn protein bền nhiệt trong huyết thanh. Mặc dù chưa có được nhiều thành tựu lớn, nhưng những kết quả mới công bố gần đây cũng đã gợi ý những phương pháp thu nhận, phân tích và nhận dạng có hiệu quả các protein huyết thanh bền nhiệt, đồng thời cũng chứng minh được có những mối liên hệ nhất định giữa sự biến đổi tính bền nhiệt của các protein này với các quá trình bệnh lý, đặc biệt là đái tháo đường và ung thư. Các nghiên cứu trên hệ protein bền nhiệt này hiện còn rất mới, rất tiềm năng và hứa hẹn sẽ thu được nhiều thành tựu quan trọng và có ý nghĩa trong nghiên cứu sinh - y học. Trong khóa luận tốt nghiệp này, chúng tôi sử dụng phương pháp điện di hai chiều 2- DE và khảo sát một số điều kiện thực nghiệm có liên quan để thực hiện đề tài “Phân tích protein huyết thanh bền nhiệt bằng kỹ thuật điện di hai chiều” với mục tiêu thu nhận, phân tách và bước đầu nhận dạng, tiến tới xây dựng cơ sở dữ liệu về hệ protein bền nhiệt trong huyết thanh người Việt Nam, tạo tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn trên hệ protein này, đặc biệt là trên các mẫu bệnh lý nhằm phân tích, so sánh và tìm kiếm các ứng viên chỉ thị bệnh đặc hiệu.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 7 Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc 1. TỔNG QUAN VỀ HỆ PROTEIN HUYẾT THANH NGƯỜI 1. Khái niệm về huyết thanh người Huyết tương - plasma là một dịch trong, màu vàng nhạt và vị hơi mặn, thu được khi máu chống đông đã được loại bỏ toàn bộ các thành phần tế bào. Huyết tương là thành phần quan trọng của máu, là môi trường sống của các tế bào máu và tất cả các tế bào trong cơ thể, chiếm 55-60% thể tích máu[44].
Huyết thanh - serum là phần dịch lỏng, trong suốt còn lại của máu sau khi đã loại bỏ các thành phần tế bào và các yếu tố đông máu hay là phần còn lại của huyết tương sau khi đã loại bỏ các yếu tố đông máu. Nó bao gồm nước, muối, lipid, đường, các enzyme, kháng thể và các protein hòa tan khác. Như vậy, huyết thanh rất giống huyết tương và các protein của nó thực hiện các vai trò rất đa dạng như đông máu, đáp ứng miễn dịch, cung cấp chất dinh dưỡng và nhiều hoạt động sinh lý quan trọng khác trong cơ thể. Huyết thanh không chỉ là mẫu xét nghiệm lâm sàng mà còn thể hiện rất nhiều đặc tính hữu ích cho các nghiên cứu proteomics.
Theo phương diện này, nó là mẫu phân tích tiềm năng cho việc phát hiện ra các chỉ thị sinh học [8]. Đặc điểm, thành phần của hệ protein huyết thanh người Một người trưởng thành chứa khoảng 3,5 - 5 lít huyết thanh với khoảng 200 - 250 gam protein. Người ta ước lượng có khoảng từ 10.000 protein khác nhau xuất hiện trong huyết thanh tại một thời điểm nhất định, phần lớn trong số chúng có mặt ở nồng độ rất thấp, cỡ ng/ml. Đây là mẫu rất giàu protein với hàm lượng thay đổi từ 60 - 80 mg/ml [9].
Các protein có hàm lượng cao trong huyết thanh gồm 22 loại, chiếm đến 99% lượng protein tổng số (hình 1), trong đó có albumin, immunoglobin, transferrin, haptoglobin, lipoprotein,. Ngoài ra còn có rất nhiều protein khác tồn tại với hàm lượng thấp hoặc rất thấp nhưng lại giữ những chức năng quan trọng như các protein làm nhiệm vụ truyền tín hiệu giữa các mô, cơ quan hay các protein giải phóng vào máu do kết quả của sự phá hủy mô, do nhiễm vi sinh vật,. Như vậy, các protein xuất hiện trong huyết thanh do nhiều nguyên nhân khác nhau và nó cũng gợi ý cho việc áp dụng các phương pháp nghiên cứu khác nhau để phát hiện chúng. 8 Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc Hình 1.
Biểu đồ biểu diễn thành phần 22 protein (chiếm 99%) trong huyết thanh [30] Protein trong huyết thanh được coi là một trong những hệ protein phức tạp nhất ở người. Một số protein có hàm lượng cao (mg/ml) như albumin thông thường thay đổi từ 35-50 mg/ml (chiếm từ 50- 70%), do sự tổng hợp hàng ngày ở gan (khoảng 12g) và có thời gian bán hủy là 21 ngày nên nó được coi là chỉ thị của bệnh xơ gan hay bệnh suy dinh dưỡng [9, 10]. IgG khoảng 5-7 mg/ml chiếm 10%. Các protein có hàm lượng thấp (ng/ml) chỉ chiếm khoảng 1% hàm lượng protein tổng số như interleukin 6, hormone, carbonhydrate antigen 125 (CA- 125), 2-microglobulin.
thông thường thay đổi từ 0 - 5 pg/ml và được coi là những chất chỉ thị có độ nhạy cao trong chẩn đoán nhiều quá trình bệnh lý [43]. Các nghiên cứu đã chứng minh rằng các protein huyết thanh có thể là các chỉ thị sinh học đủ tin cậy trong chẩn đoán một số bệnh như: ung thư buồng trứng (CA 15-3), ung thư tuyến tiền liệt (PSA), ung thư gan (-fetoprotein) và các bệnh về tim mạch (C-reactive protein) [3]. Tuy nhiên, trải qua nhiều thập kỷ nghiên cứu mới chỉ có một lượng nhỏ các chỉ thị sinh học này được phát hiện và sử dụng cho mục đích chẩn đoán. Chức năng của các protein trong huyết thanh Huyết thanh đóng vai trò rất quan trọng trong các hoạt động sống của cơ thể, là môi trường trao đổi chất của các mô và cơ quan, đồng thời cũng là môi trường phức tạp, chứa hàng nghìn loại protein với hàm lượng rất khác nhau.
Dựa theo chức năng, có thể phân chia protein huyết thanh các nhóm sau [4]: Chức năng miễn dịch: Bao gồm các Ig (đó là IgA, IgG, IgM, IgD, IgE) và các bổ thể tham gia vào quá trình bảo vệ cơ thể như: tăng thực bào, phản ứng đặc hiệu với kháng nguyên (peptide, vi khuẩn, virus,…). 9 Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc Chức năng đông máu: gồm các chất đông máu và các chất chống đông (AT III, protein C, protein S.) tham gia vào quá trình đông máu và bảo vệ cơ thể. Duy trì áp suất keo, độ nhớt của máu: trong huyết thanh, protein tạo thành dung dịch keo để duy trì áp suất thẩm thấu, sức căng bề mặt và tính đệm. Chức năng xúc tác: enzyme có chức năng xúc tác cho các phản ứng của các quá trình sinh học từ đơn giản đến phức tạp nhất.
Vận chuyển các chất: vận chuyển chất dinh dưỡng, nước, muối đến các tổ chức và vận chuyển các chất thải, chất bã qua thận, phổi, mồ hôi, hệ tiêu hoá như: transferrin vận chuyển sắt; haptoglobin vận chuyển HST tự do; vận chuyển lipid, cholesterol. Vận chuyển các protein cần thiết để tổng hợp các tổ chức tế bào và mô. Chức năng điều hoà: những protein này tuy có hàm lượng rất nhỏ (ng/ml) nhưng có vai trò rất quan trọng trong mọi hoạt động của cơ thể. Chúng bao gồm các hormone, cytokine, các protein ức chế đặc hiệu enzyme.
Phân loại protein trong huyết thanh theo Putnam Dựa trên quan điểm về chức năng, Putnam (1975-1987) đã phân loại các protein trong huyết thanh thành các nhóm chính: Protein tiết từ các mô rắn, các immunoglobulin miễn dịch, các phối tử trung gian, các phối tử địa phương, các chất tạm thời, sản phẩm giải phóng từ các mô, các chất tiết bất thường và các protein ngoại lai. Hệ thống phân loại này được thừa nhận rộng rãi và trích dẫn lại trong các nghiên cứu của Anderson (2002) [9]. Ý nghĩa của việc nghiên cứu hệ protein huyết thanh Huyết thanh là một hệ protein khá toàn diện, là phiên bản lớn nhất và cũng là một mẫu nghiên cứu hấp dẫn [1, 9]. Sự hấp dẫn của huyết tương đối với việc chuẩn đoán bệnh được quyết định bởi hai đặc trưng: (i) mẫu có thể lấy dễ dàng và an toàn, (ii) mẫu không chỉ phản ánh toàn diện kiểu hình người mà còn cho biết trạng thái của cơ thể ở một thời điểm đặc biệt nào đó.
Trong khi đó, những mẫu khác như nước bọt, nước mắt, nước tiểu, da, tóc chỉ được coi là một tập con nhỏ của huyết tương hoặc mang tính địa phương và phản ánh hoạt động của tế bào [2]. Huyết thanh là một thành phần quan trọng trong máu, chứa nhiều protein có nguồn gốc và chức năng khác nhau, tác động lên nhiều cơ quan, nhiều quá trình sinh học khác nhau trong cơ thể. Chính vì thành phần protein phức tạp của huyết thanh bắt nguồn từ nhiều nguồn gốc 10 Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc mà việc nghiên cứu hệ protein huyết thanh hứa hẹn sẽ mang lại nhiều thông tin bổ ích để phát triển các công tác nghiên cứu, chẩn đoán và chữa trị nhiều bệnh khác nhau, đặc biệt là các bệnh trao đổi chất như đái tháo đường và các bệnh ung thư. Những thay đổi bất thường về thành phần protein huyết thanh chắc chắn có liên quan đến các quá trình bệnh lý (bảng 1).