Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Ngành chăn nuôi gia cầm tại Việt Nam giữ vị trí quan trọng trong cơ cấu kinh tế nông nghiệp. Theo số liệu thống kê năm 2016 được tác giả dẫn giải, tổng đàn gà cả nước đạt khoảng 252 triệu con, cung cấp hơn 500 nghìn tấn thịt và 8,5 tỷ quả trứng, đạt giá trị thu nhập khoảng 63 nghìn tỷ đồng, chiếm 29,5% tổng giá trị ngành nông nghiệp và đóng góp 3,15% vào GDP. Cùng với xu hướng phát triển chăn nuôi quy mô công nghiệp tập trung, rủi ro dịch bệnh truyền nhiễm ngày càng gia tăng. Trong đó, bệnh Marek do virus Gallid herpesvirus 2 (GaHV-2, thuộc phân họ Alphaherpesvirinae, chi Mardivirus) gây ra là một trong những mối đe dọa nghiêm trọng nhất đối với đàn gà công nghiệp và gà đẻ trứng. Virus gây tăng sinh mất kiểm soát tế bào lympho T, hình thành các khối u ác tính ở cơ quan nội tạng và các tổ chức thần kinh ngoại vi, dẫn đến tỷ lệ chết và bại liệt cao, đồng thời gây ức chế miễn dịch sâu sắc.

Dựa trên phân loại độc lực dịch tễ học của Witter và cộng sự, các chủng GaHV-2 thuộc serotype 1 (MDV-1) được chia thành năm kiểu hình: nhược độc (a), độc lực yếu (m), độc lực (v), độc lực cao (vv), và cực kỳ độc lực (vv+). Nhiều nghiên cứu dịch tễ phân tử trên thế giới đã ghi nhận hiện tượng tái tổ hợp và biến đổi liên tục trong bộ gen MDV, dẫn đến sự gia tăng độc lực và làm suy giảm hiệu quả bảo hộ của các dòng vaccine thương mại như CVI988. Trong hệ gen của virus, gen Meq (Marek’s EcoRI Q fragment protein) có kích thước 1020 bp, nằm ở vùng lặp dài, là oncoprotein chính quyết định tính gây ung thư và độc lực của virus. Các đột biến điểm và đa hình trên vùng gen Meq có tương quan mật thiết với sự tiến hóa độc lực của các chủng GaHV-2. Tại Việt Nam, các nghiên cứu chuyên sâu về đặc điểm phân tử và phả hệ di truyền của gen Meq trên các chủng virus thực địa còn rất hạn chế. Xuất phát từ thực tế đó, đề tài "Giải mã và phân tích đặc điểm phân tử gen kháng nguyên Meq của virus GaHV-2 gây bệnh Marek trên gà tại tỉnh Vĩnh Phúc năm 2021" đã được thực hiện.

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài được tác giả xác định cụ thể gồm ba nội dung:

  1. Phân tích được đặc điểm phân tử của phân đoạn gen kháng nguyên Meq của virus gây bệnh trên gà tại tỉnh Vĩnh Phúc năm 2021.
  2. Xác định đặc điểm phân tử vùng gen Meq của chủng gây bệnh.
  3. Xác định phả hệ nguồn gốc các chủng GaHV-2 và so sánh với các chủng trên thế giới.

Nhiệm vụ nghiên cứu bao gồm: thu nhận mẫu bệnh phẩm gan gà nghi mắc bệnh Marek tại ổ dịch Vĩnh Phúc năm 2021; tách chiết DNA tổng số; thiết kế mồi chuyên biệt và tối ưu hóa phản ứng PCR để chẩn đoán xác định serotype 1 (GaHV-2) và khuếch đại toàn bộ gen kháng nguyên Meq; tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự gen bằng phương pháp Sanger; phân tích tin sinh học để khảo sát mức độ tương đồng nucleotide, suy diễn trình tự amino acid, nhận diện các đột biến điểm và thiết lập cây phát sinh chủng loại.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: DNA của virus Gallid herpesvirus type 2 (GaHV-2) được tách chiết từ các mẫu bệnh phẩm mô gan gà nghi mắc bệnh Marek.
  • Phạm vi không gian: Mẫu bệnh phẩm được thu thập từ các đàn gà có biểu hiện bệnh lý tại tỉnh Vĩnh Phúc trong năm 2021. Quá trình thực nghiệm được tiến hành tại Phòng Miễn dịch học thuộc Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, phối hợp với Bộ môn Công nghệ sinh học Động vật – Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
  • Phạm vi thời gian: Đề tài được thực hiện từ tháng 01/2022 đến tháng 07/2022.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết của khóa luận dựa trên hệ thống phân loại học và sinh học phân tử của virus gây bệnh Marek (Marek’s Disease Virus - MDV). MDV được phân chia thành ba nhóm huyết thanh (serotype):

  • MDV serotype 1 (MDV-1 hay GaHV-2): phân lập trên gà, có độc lực mạnh, biến đổi nhanh chóng và có khả năng gây khối u lympho ác tính.
  • MDV serotype 2 (MDV-2 hay GaHV-3): phân lập trên gà, hầu như không có độc lực.
  • MDV serotype 3 (MDV-3 hay MeHV-1, thường gọi là Herpesvirus of turkeys - HVT): phân lập trên gà tây, độc lực thấp, thường dùng làm vaccine phòng bệnh.

Bộ gen của MDV là chuỗi DNA sợi kép dài khoảng 175 kb, cấu trúc gồm hai phân đoạn chính: phân đoạn dài duy nhất (UL, dài 113.562 bp chứa 64 gen) và phân đoạn ngắn duy nhất (US, dài 10.847 bp chứa 9 gen). Cả hai vùng này được bao bọc bởi các chuỗi lặp lại đảo ngược ở đầu mút và bên trong gồm TRL/IRL (dài 13.065 bp chứa 16 gen) và TRS/IRS (dài 12.264 bp chứa 12 gen). Hệ gen mã hóa hơn 70 gen chức năng từ 339 khung đọc mở (ORF). Oncoprotein Meq là một protein bZIP (Basic Leucine Zipper Domain) đặc trưng, có kích thước tiêu chuẩn 339 amino acid (mã hóa bởi 1020 bp). Cấu trúc protein gồm vùng cơ bản BR1, BR2 ở đầu N giữ vai trò định vị nhân tế bào và liên kết DNA, miền bZIP tham gia tạo phức dị vòng hoặc đồng vòng với c-Jun, Fos, ATF, và miền giàu proline (PRR) ở đầu C có chức năng hoạt hóa hoặc ức chế phiên mã. Meq liên kết với vị trí AP-1 trên promoter để điều hòa tăng các gen chống chết theo chu kỳ tế bào (Bcl-2, Bcl-9, Ski), các gen cytokine (IL-8, RANTES, TGF-β), vô hiệu hóa protein p53 và tương tác với CDK2, làm rút ngắn pha G1 và gây biến đổi ung thư tế bào lympho T.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được triển khai theo các quy trình chuẩn sinh học phân tử:

  • Thu thập và xử lý mẫu: Mẫu mô gan nghi nhiễm được nghiền nhỏ trong cối chày sứ với nitơ lỏng, trải qua chu kỳ đông - tan trên 3 lần để phá vỡ màng tế bào. Tách chiết DNA tổng số bằng bộ kit GeneJET Genomic DNA Purification Kit (Thermo Scientific), sử dụng Digestion Solution, Lysis Solution, Proteinase K và RNase A để loại bỏ tạp chất protein và RNA.
  • Kỹ thuật PCR: Phản ứng PCR chẩn đoán và khuếch đại gen được thực hiện trên máy luân nhiệt Astec sử dụng hóa chất DreamTaq PCR Master Mix 2X (Thermo Scientific). Thành phần phản ứng 50 µl gồm: 25 µl DreamTaq 2X, 2 µl DMSO, 2 µl mỗi mồi xuôi và ngược (10 pmol/µl), 3 µl DNA khuôn và 16 µl nước khử ion. Chu trình nhiệt gồm: biến tính ban đầu 94°C trong 5 phút; 35 chu kỳ gồm 94°C (30 giây), 48°C (30 giây), 72°C (3 phút); kéo dài chuỗi cuối cùng ở 72°C trong 10 phút; bảo quản ở 4°C.
    • Cặp mồi chẩn đoán xác định GaHV-2 (serotype 1): MarekF (5’-YGACGGCCTATCTGAGGAGG-3’) và MarekR (5’-GGATCCTCGGTAAGACGAGC-3’), khuếch đại phân đoạn kích thước ~0,7 kb.
    • Cặp mồi khuếch đại toàn bộ gen Meq: GaHV2-MeqF (5’-AATTGTGACCGTTCGCGAACG-3’) và GaHV2-MeqR (5’-TTCCGAGTCTAAGCTACACGG-3’), khuếch đại phân đoạn kích thước ~1,4 kb.
  • Điện di và tinh sạch: Kiểm tra sản phẩm trên gel agarose 1% pha trong đệm TAE 1X, nhuộm Ethidium Bromide, so sánh với thang chuẩn DNA phage Lambda cắt bằng HindIII. Tinh sạch sản phẩm PCR đạt yêu cầu bằng GeneJET PCR Purification Kit (Thermo Scientific).
  • Giải trình tự và xử lý số liệu: Sản phẩm PCR tinh sạch được giải trình tự theo phương pháp dideoxy Sanger tại Công ty 1st BASE (Singapore). Trình tự thô được kiểm tra chromatogram qua phần mềm ChromasLITE, đối chiếu tương đồng qua công cụ BLAST (NCBI), căn chỉnh chuỗi nucleotide và amino acid bằng phần mềm GeneDoc 2.7, và xây dựng cây phả hệ nguồn gốc theo thuật toán Neighbor-Joining (NJ) với hệ số lặp lại 1000 lần (bootstrap) trên phần mềm MEGA X.

Nguồn dữ liệu tham chiếu gồm 29 chủng MDV-1 và chủng vaccine chuẩn (CVI988, Md5, RB-1B, HNGS206, GX36, Fayoum, PA1, PA3, PA4...) đã công bố trên cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 2: Tổng quan tài liệu

Chương này hệ thống hóa toàn diện các kiến thức bệnh học, dịch tễ học và cấu trúc bộ gen của virus GaHV-2:

  • Lịch sử và triệu chứng bệnh Marek: Bệnh được József Marek phát hiện lần đầu năm 1907. Bệnh có hai thể lâm sàng chính: thể cấp tính thường xuất hiện ở gà con 4–8 tuần tuổi với tỷ lệ chết từ 20% đến 80%, biểu hiện gầy còm và khối u nội tạng; thể mãn tính xuất hiện ở gà 4–8 tháng tuổi với thể thần kinh (liệt chân, rũ cánh) và thể mắt (viêm màng tiếp hợp, mất sắc tố mống mắt, mù lòa). Bệnh tích đại thể ghi nhận u hạt và u tràn lan ở gan, lách, thận, buồng trứng, và sưng to các dây thần kinh ngoại vi.
  • Tình hình dịch tễ: Dẫn chứng báo cáo của OIE cho thấy trong giai đoạn 2005–2014 có 25% quốc gia trên thế giới báo cáo ca nhiễm Marek. Các ổ dịch điển hình gây thiệt hại lớn được thống kê tại Romania (2009, tỷ lệ chết 12,06%), Ấn Độ (2011, chết 10–40% trên gà đã tiêm vaccine), Ethiopia (2014, chết 46% đàn gà 14 tuần tuổi), và Trung Quốc (2015 tại An Huy, tỷ lệ mắc 5%, tỷ lệ chết 80% ở đàn gà thịt 24–30 tuần tuổi). Tại Việt Nam, bệnh bùng phát từ những năm 1980 tại Châu Thành, Cầu Diễn; dù đã tiêm phòng, bệnh vẫn xuất hiện rải rác với tỷ lệ 3–5% tại Đồng Nai, Bình Dương, Long An, Tiền Giang. Dẫn liệu khảo sát năm 2020 của Nguyễn Tâm Đông tại Đồng Tháp ghi nhận 36/132 đàn gà thả vườn nhiễm GaHV-2 (tỷ lệ 27,27%), trong đó huyện Lấp Vò có tỷ lệ nhiễm cao nhất đạt 64%.
  • Cơ sở phân tử của gen Meq: Phân tích cấu trúc miền bZIP, miền giàu proline (PRR) và các dạng đồng phân isoform gồm L-Meq (399 aa), Meq (339 aa), S-Meq (298 aa), và VS-Meq (247 aa). Tác giả làm rõ cơ chế Meq tương tác với c-Jun, ức chế p53, liên kết promoter AP-1 điều hòa các gen chống chết theo chu trình (Bcl2, Bcl9, Ski) và phân tích vai trò bổ trợ của phức hợp phosphoprotein pp38 cùng tiểu đơn vị telomerase RNA của virus (vTR) trong quá trình biến nạp tế bào khối u.

Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 3 trình bày chi tiết về đối tượng, thiết bị và các bước thực nghiệm:

  • Vật liệu: Ba mẫu bệnh phẩm gan gà nghi nhiễm GaHV-2 thu thập tại Vĩnh Phúc năm 2021 (ký hiệu MRVP5, MRVP10, MRVP11).
  • Hóa chất và thiết bị: Sử dụng bộ kit tách chiết GeneJET Genomic DNA Purification Kit, DNeasy Blood and Tissue Kits (QIAGEN), DreamTaq PCR Master Mix (Thermo Scientific), GeneJET PCR Purification Kit, hóa chất điện di Agarose (Invitrogen), đệm TAE (BioTech), Ethidium Bromide (Promega). Thiết bị gồm máy PCR Astec, máy đọc gel Dolphin-DOC (Wealtec), máy ly tâm Eppendorf, tủ an toàn sinh học Esco, cân điện tử Shimadzu và các tủ đông bảo quản sâu -20°C, -40°C, -80°C (Sanyo).
  • Quy trình thí nghiệm: Mô tả chi tiết quy trình tách chiết DNA qua 13 bước nghiêm ngặt; thiết lập thông số nồng độ thành phần phản ứng PCR và chu trình luân nhiệt 35 chu kỳ; quy trình 6 bước tinh sạch đoạn khuếch đại PCR trước khi gửi giải trình tự Sanger. Quy trình tin sinh học sử dụng phần mềm ChromasLITE, công cụ BLAST, GeneDoc 2.7 và MEGA X được quy định rõ ràng về các tham số vận hành.

Chương 4: Kết quả và thảo luận

Chương này công bố và luận giải các phát hiện thực nghiệm thu được:

  • Kết quả tách chiết và PCR chẩn đoán: Tách chiết thành công DNA tổng số từ 3 mẫu bệnh phẩm (MRVP5, MRVP10, MRVP11), điện di cho vạch băng sáng rõ, ít bị đứt gãy. Khi chạy PCR chẩn đoán với cặp mồi MarekF-MarekR, mẫu MRVP10 và MRVP11 dương tính, cho đơn băng đặc hiệu kích thước ~0,7 kb; mẫu MRVP5 âm tính (không xuất hiện băng khuếch đại).
  • Kết quả nhân đoạn và giải trình tự gen Meq: Sử dụng cặp mồi GaHV2-MeqF và GaHV2-MeqR, phản ứng PCR nhân thành công phân đoạn đơn băng kích thước ~1,4 kb chứa toàn bộ gen Meq từ hai mẫu MRVP10 và MRVP11. Kết quả giải trình tự Sanger xác định chính xác trình tự toàn bộ khung đọc mở gen Meq có chiều dài 1020 bp, mã hóa chuỗi polypeptide gồm 339 amino acid.
  • So sánh phân tử nội bộ và với các chủng quốc tế:
    • So sánh giữa hai chủng Việt Nam: MRVP10 và MRVP11 có mức độ tương đồng nucleotide đạt 99,6% và tương đồng amino acid đạt 99,4%. Hai chủng có ba đột biến điểm nucleotide sai khác gồm 250(T>A), 328(T>A) và 355(T>C).
    • So sánh với 29 chủng GaHV-2 trên thế giới: Mức độ tương đồng nucleotide giữa các chủng thế giới dao động từ 89,4% đến 100%, và amino acid dao động từ 87,6% đến 100%. Hai chủng Việt Nam có độ tương đồng cao nhất với các chủng Trung Quốc (99,3–99,9% về nucleotide; 97,6–99,7% về amino acid); tương đồng với các chủng Nhật Bản từ 99,0–99,5% (nt) và 97,6–98,5% (aa); tương đồng với các chủng Ấn Độ từ 98,7–99,3% (nt) và 96,8–97,9% (aa); tương đồng với các chủng châu Âu (Ý, Hungary) từ 89,4–99,4% (nt) và 88,5–98,2% (aa); tương đồng với chủng Md5 và CVI988 của Mỹ từ 99,1–99,7% (nt) và 97,5% (aa).
    • So sánh với chủng vaccine chuẩn CVI988: Chủng CVI988 mang đoạn giàu proline lặp lại từ nucleotide vị trí 575 đến 752 làm mất hoạt tính của protein Meq. Mức độ đồng nhất nucleotide và amino acid giữa chủng CVI988 với MRVP10 lần lượt là 99,4% và 98,2%; với MRVP11 lần lượt là 99,0% và 97,6%. Chủng Fayoum (Ai Cập) có độ tương đồng thấp nhất với CVI988 (89,5% nt và 87,9% aa).
    • Nhận diện các đột biến điểm đặc trưng: Phân tích ghi nhận các sai khác nucleotide gồm vị trí 239 (T>G), 249 (G>A), 250 (T>A), 279 (A>G), 328 (T>A), 344 (C>T), 356 (T>C), 539 (A>G), 577 (A>G), 649 (G>C). Đột biến tại vị trí 250 (T>A) và 650 (G>C) xuất hiện đồng thời ở nhiều chủng thuộc các khu vực địa lý khác nhau.
  • Phân tích cây phát sinh chủng loại: Cây phả hệ dựng bằng thuật toán Neighbor-Joining trên MEGA X phân chia các chủng GaHV-2 toàn cầu thành 5 phân nhóm độc lực: nhóm rất độc (vvMDV), nhóm siêu độc lực châu Á - châu Âu (vv++MDV), nhóm siêu độc lực châu Mỹ (vv++MDV), nhóm độc lực cao (vMDV), và nhóm độc lực vừa (mMDV). Hai chủng MRVP10 và MRVP11 thuộc phân nhóm độc lực cao (vMDV), nằm chung nhánh phát sinh và có quan hệ di truyền gần gũi nhất với các chủng phân lập từ Trung Quốc (như GX36, HNGS206, QD/1311).

Kết quả và đóng góp

Các kết quả định lượng về độ tương đồng di truyền giữa hai chủng GaHV-2 thực địa tại Vĩnh Phúc (MRVP10, MRVP11) với các nhóm chủng trên thế giới và chủng vaccine chuẩn được tổng hợp trong bảng sau:

Đối tượng so sánh Tỷ lệ đồng nhất nucleotide (%) Tỷ lệ tương đồng amino acid (%)
Giữa hai chủng Việt Nam (MRVP10 so với MRVP11) 99,6 99,4
Chủng Việt Nam so với các chủng Trung Quốc 99,3 – 99,9 97,6 – 99,7
Chủng Việt Nam so với các chủng Nhật Bản 99,0 – 99,5 97,6 – 98,5
Chủng Việt Nam so với các chủng Ấn Độ 98,7 – 99,3 96,8 – 97,9
Chủng Việt Nam so với các chủng Ý, Hungary 89,4 – 99,4 88,5 – 98,2
Chủng Việt Nam so với chủng Mỹ (Md5, CVI988) 99,1 – 99,7 97,5
Chủng MRVP10 so với chủng vaccine CVI988 99,4 98,2
Chủng MRVP11 so với chủng vaccine CVI988 99,0 97,6
Toàn bộ các chủng thế giới so với CVI988 89,5 – 99,4 87,9 – 97,9

Về giải pháp và kiến nghị thực tiễn, tác giả đề xuất:

  • Cần mở rộng phạm vi điều tra dịch tễ phân tử trên quy mô toàn quốc để theo dõi quy luật tích lũy đột biến trên gen Meq của các chủng GaHV-2 thực địa.
  • Đánh giá lại hiệu lực bảo hộ thực tế của vaccine CVI988 tại các cơ sở chăn nuôi, do mức độ sai khác amino acid (từ 1,8% đến 2,4%) có thể khiến khả năng bảo hộ của vaccine không triệt để.
  • Có kế hoạch tuyển chọn các chủng virus thực địa lưu hành tại Việt Nam để nghiên cứu, phát triển các dòng vaccine phòng bệnh thế hệ mới phù hợp với đặc điểm dịch tễ trong nước.

Đóng góp mới của đề tài được tác giả xác định:

  • Lần đầu tiên giải mã hoàn chỉnh trình tự nucleotide (1020 bp) và xác định trình tự chuỗi polypeptide suy diễn (339 amino acid) của gen kháng nguyên Meq từ hai chủng GaHV-2 thực địa (MRVP10 và MRVP11) gây bệnh Marek tại Vĩnh Phúc năm 2021.
  • Định vị được các đột biến điểm đặc trưng trên gen Meq của các chủng GaHV-2 Việt Nam khi so sánh với 29 chủng quốc tế công bố trên GenBank.
  • Xây dựng thành công cây phát sinh loài, chứng minh hai chủng GaHV-2 tại Vĩnh Phúc thuộc nhóm độc lực cao (vMDV) và có mối quan hệ phả hệ gần gũi nhất với các chủng lưu hành tại Trung Quốc, cung cấp bằng chứng khoa học cho thấy nguồn gốc virus có thể do du nhập xuyên biên giới qua hoạt động vận chuyển, buôn bán gia cầm.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận chỉ rõ những giới hạn trong phạm vi nghiên cứu thực nghiệm:

  • Số lượng mẫu khảo sát còn nhỏ: Đề tài tiến hành thu thập và phân tích ban đầu trên 3 mẫu mô gan gà nghi bệnh, trong đó xác định được 2 mẫu dương tính với GaHV-2 để thực hiện giải trình tự gen.
  • Phạm vi không gian khu biệt: Nguồn mẫu bệnh phẩm chỉ được thu thập tại một địa phương (tỉnh Vĩnh Phúc) trong năm 2021, chưa phản ánh đầy đủ bức tranh dịch tễ phân tử của virus Marek trên các vùng sinh thái chăn nuôi khác nhau của Việt Nam.
  • Phạm vi đối tượng gen: Nghiên cứu mới tập trung phân tích đơn lẻ khung đọc mở gen Meq (1020 bp). Mặc dù Meq là gen chỉ thị độc lực chính, các gen liên quan khác trong hệ gen 175 kb như ICP4, pp38, hay vIL-8 chưa được giải mã đồng thời.

Hướng nghiên cứu tiếp theo được tác giả kiến nghị bao gồm:

  • Mở rộng thu thập mẫu bệnh phẩm trên diện rộng tại nhiều tỉnh thành chăn nuôi gia cầm trọng điểm ở cả miền Bắc, miền Trung và miền Nam.
  • Triển khai giải trình tự đa vùng gen hoặc toàn bộ hệ gen (whole genome sequencing) của các chủng GaHV-2 lưu hành thực địa để làm rõ các biến cố tái tổ hợp di truyền.
  • Tiến hành phân lập, nuôi cấy virus sống trên phôi gà hoặc tế bào thận gà xơ cấp để thử nghiệm độc lực in vivo và kiểm tra thực nghiệm tính bảo hộ chéo của các loại vaccine hiện hành đối với các chủng thực địa mới phân lập.

Giá trị tham khảo

Khóa luận tốt nghiệp là tài liệu tham khảo chuyên khảo hữu ích cho các nhóm đối tượng:

  • Giảng viên, học viên cao học và sinh viên thuộc các chuyên ngành Công nghệ sinh học, Thú y, Chăn nuôi, Bệnh học động vật và Vi sinh vật học phân tử đang thực hiện các đề tài nghiên cứu về chẩn đoán bệnh truyền nhiễm ở gia cầm.
  • Cán bộ kỹ thuật, chuyên viên xét nghiệm tại các Chi cục Thú y, Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương, và các viện nghiên cứu vắc-xin thú y cần quy trình chuẩn để phát hiện và định danh GaHV-2.

Các phần nội dung có giá trị tham khảo ứng dụng cao trong tài liệu gồm:

  • Quy trình chuẩn bị mẫu mô bệnh phẩm nội tạng (nghiền nitơ lỏng, sốc nhiệt đông - tan) và quy trình 13 bước tách chiết DNA tổng số đạt độ tinh sạch cao cho phản ứng PCR.
  • Trình tự thiết kế của hai cặp mồi đặc hiệu: cặp mồi chẩn đoán nhanh GaHV-2 (MarekF/MarekR, khuếch đại phân đoạn ~0,7 kb) và cặp mồi nhân bản toàn phần gen Meq (GaHV2-MeqF/GaHV2-MeqR, khuếch đại phân đoạn ~1,4 kb) kèm điều kiện chu trình luân nhiệt đã được tối ưu hóa ở nhiệt độ gắn mồi 48°C.
  • Phương pháp luận tin sinh học ứng dụng kết hợp ChromasLITE, BLAST, GeneDoc 2.7 và MEGA X để phân tích đột biến điểm, tính toán ma trận khoảng cách di truyền và thiết lập cây phát sinh chủng loại bằng thuật toán Neighbor-Joining với 1000 lần bootstrap.
  • Toàn văn chuỗi trình tự nucleotide (1020 nt) và chuỗi peptide suy diễn (339 aa) của hai chủng MRVP10 và MRVP11 được cung cấp chi tiết trong khóa luận, là nguồn dữ liệu chuẩn đối chiếu cho các công bố di truyền học phân tử tiếp theo tại Việt Nam.

Câu hỏi thường gặp

1. Khóa luận sử dụng những cặp mồi nào cho phản ứng PCR và kích thước sản phẩm khuếch đại dự kiến là bao nhiêu?
Tác giả đã sử dụng hai cặp mồi:

  • Cặp mồi chẩn đoán xác định GaHV-2 (serotype 1): MarekF (5’-YGACGGCCTATCTGAGGAGG-3’) và MarekR (5’-GGATCCTCGGTAAGACGAGC-3’), khuếch đại đoạn gen có kích thước ~0,7 kb (khoảng 700 bp).
  • Cặp mồi khuếch đại toàn bộ gen Meq: GaHV2-MeqF (5’-AATTGTGACCGTTCGCGAACG-3’) và GaHV2-MeqR (5’-TTCCGAGTCTAAGCTACACGG-3’), khuếch đại đoạn gen có kích thước ~1,4 kb (khoảng 1400 bp).

2. Chiều dài chuỗi nucleotide và số lượng amino acid của gen Meq được giải mã từ hai chủng MRVP10 và MRVP11 là bao nhiêu?
Trình tự khung đọc mở của gen Meq hoàn chỉnh thu nhận từ hai chủng thực địa MRVP10 và MRVP11 đều có chiều dài chính xác là 1020 nucleotide, mã hóa chuỗi polypeptide hoàn chỉnh gồm 339 amino acid.

3. Mức độ tương đồng về mặt phân tử giữa hai chủng GaHV-2 tại Vĩnh Phúc với chủng vaccine CVI988 thể hiện như thế nào?
Chủng vaccine thương mại CVI988 có tỷ lệ đồng nhất nucleotide và tương đồng amino acid so với chủng MRVP10 lần lượt là 99,4% và 98,2%; so với chủng MRVP11 lần lượt là 99,0% và 97,6%. Sai khác amino acid (từ 1,8% đến 2,4%) cho thấy vaccine CVI988 vẫn duy trì được hiệu quả phòng bệnh nhưng khả năng bảo hộ có nguy cơ không đạt mức độ triệt để trước các biến chủng thực địa.

4. Cây phả hệ phân tử xây dựng bằng thuật toán Neighbor-Joining phân loại hai chủng GaHV-2 tại Vĩnh Phúc vào nhóm nào?
Cây phả hệ phân tích trên phần mềm MEGA X với 1000 lần bootstrap chia các chủng GaHV-2 toàn cầu thành 5 phân nhóm độc lực. Cả hai chủng MRVP10 và MRVP11 đều được xếp vào phân nhóm thứ tư gồm các chủng có độc lực cao (vMDV), đồng thời nằm chung nhánh và có quan hệ phát sinh loài gần gũi nhất với các chủng phân lập từ Trung Quốc.

5. Tại sao trong ba mẫu bệnh phẩm ban đầu chỉ có hai mẫu được lựa chọn để giải mã gen Meq?
Trong ba mẫu gan gà nghi mắc bệnh Marek (MRVP5, MRVP10, MRVP11), phản ứng PCR chẩn đoán với cặp mồi MarekF-MarekR cho thấy chỉ có hai mẫu MRVP10 và MRVP11 dương tính (cho băng kích thước ~0,7 kb rõ nét). Mẫu MRVP5 cho kết quả âm tính (không xuất hiện sản phẩm khuếch đại), phù hợp với thực tế bệnh lý lâm sàng bệnh Marek rất dễ nhầm lẫn với bệnh Leucosis ở gia cầm, do đó chỉ hai mẫu dương tính được sử dụng để giải mã gen Meq.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Thị Mai Phương đã hoàn thành việc tách chiết DNA, chẩn đoán xác định GaHV-2 và giải mã trọn vẹn trình tự gen kháng nguyên Meq (kích thước 1020 bp, mã hóa 339 amino acid) từ hai chủng virus thực địa MRVP10 và MRVP11 thu nhận tại tỉnh Vĩnh Phúc năm 2021. Bằng các công cụ tin sinh học GeneDoc 2.7 và MEGA X, đề tài đã chỉ ra mức độ tương đồng di truyền cao giữa hai chủng nội địa (99,6% nucleotide và 99,4% amino acid), đồng thời xác định các sai khác phân tử so với chủng vaccine chuẩn CVI988 và các chủng GaHV-2 trên thế giới. Phân tích cây phả hệ nguồn gốc đã định vị hai chủng nghiên cứu thuộc nhóm độc lực cao (vMDV) và có mối quan hệ di truyền gần gũi nhất với các chủng lưu hành tại Trung Quốc. Các dữ liệu thực nghiệm này cung cấp cơ sở khoa học quan trọng phục vụ công tác giám sát dịch tễ phân tử bệnh Marek tại Việt Nam và định hướng nghiên cứu phát triển các chế phẩm vaccine phòng bệnh đạt hiệu quả cao hơn trong thực tiễn chăn nuôi gia cầm.