HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC *** KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: GIẢI MÃ VÀ PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ GEN KHÁNG NGUYÊN Meq CỦA VIRUS GaHV-2 GÂY BỆNH MAREK TRÊN GÀ TẠI TỈNH VĨNH PHÚC NĂM 2021 HÀ NỘI, 07/2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC *** KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: GIẢI MÃ VÀ PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ GEN KHÁNG NGUYÊN Meq CỦA VIRUS GaHV-2 GÂY BỆNH MAREK TRÊN GÀ TẠI TỈNH VĨNH PHÚC NĂM 2021 Ngƣời thực hiện : NGUYỄN THỊ MAI PHƢƠNG Khoá : 63 Ngành : Công nghệ sinh học :TS. Đoàn Thị Thanh Hƣơng Ngƣời hƣớng dẫn TS. Trần Thị Bình Nguyên HÀ NỘI, 07/2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng: Đây là kết quả công trình nghiên cứu của riêng bản thân. Các số liệu, kết quả trong bài khoá luận này là trung thực và nguyên gốc, không trùng lặp với những công bố trong các luận văn, luận án hay các công trình nghiên cứu khoa học trước đây.
Tôi xin cam đoan rằng: Mọi sự giúp đỡ trong quá trình hoàn thành khoá luận này đều đã được cảm ơn và mọi trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc theo đúng quy định. Hà Nội, ngày … tháng … năm 2022 Sinh viên Nguyễn Thị Mai Phương i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận này, tôi đã nhận được nhiều sự quan tâm giúp đỡ của các thầy cô, các chị, các bạn. Tôi xin trân trọng cảm ơn tới TS. Đoàn Thị Thanh Hương – Trường phòng Miễn dịch học (Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam đã trực tiếp hướng dẫn và truyền đạt kiến thức suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện đề tài để tôi thuận lợi hoàn thành tốt khoá luận tốt nghiệp này.
Tôi xin chân thành cảm ơn tới TS. Trần Thị ình Nguyên – Trưởng Bộ môn CNSH Động vật đã giúp đỡ hết lòng với tôi trong suốt thời gian hoàn thiện khoá luận tốt nghiệp. Hoàn thành khóa luận này, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi luôn nhận được sự giúp đỡ tận tình, đầy trách nhiệm của các cán bộ làm việc tại Phòng Miễn dịch học – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam cùng với các Thầy/Cô trong Bộ môn CNSH Động vật đã luôn tạo điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này. Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và tất cả những người thân yêu đã luôn tin tưởng, giúp đỡ, động viên, hỗ trợ tôi trong suốt thời gian hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Hà Nội, ngày … tháng … năm 2022 Sinh viên Nguyễn Thị Mai Phương ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN. ii MỤC LỤC. iii DANH MỤC BẢNG .v DANH MỤC HÌNH. vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT.
Tính cấp thiết của đề tài. Mục tiêu nghiên cứu. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn. Ý nghĩa khoa học.
Ý nghĩa thực tiễn. Những đóng góp mới đề tài. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Tổng quan về bệnh Marek và Marek’s Disease Virus.
Tổng quan về bệnh Marek. Tổng quan về Marek’s Disease Virus. Tình hình trong nước và thế giới ở bệnh Marek. Tầm quan trọng của việc nghiên cứu gen Meq.
Giới thiệu về gen Meq. Cấu trúc bộ gen Meq. Các thành phần trong cấu trúc ảnh hưởng đến hoạt động và ngăn ngừa ung thư của Meq. Cơ chế gây ung thư của Meq.
Một số gen liên quan đến khả năng gây ung thư Meq. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Thời gian và địa điểm nghiên cứu. Thời gian nghiên cứu.
Địa điểm nghiên cứu. Vật liệu nghiên cứu. Đối tượng, hoá chất, thiết bị nghiên cứu. Đối tượng nghiên cứu.
Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu. Phương pháp nghiên cứu. Thu nhập mẫu bệnh phẩm. Tách chiết DNA tổng số.
Thiết kế mồi và thực hiện phản ứng PCR. Phương pháp điện di trên gel Agarose. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR. Phương pháp giải trình tự gen .7 Xử lý chuỗi gen và phân tích số liệu.
Nội dung nghiên cứu. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. Kết quả chiết tách DNA tổng số. Kết quả PCR chẩn đoán xác định GaHV-2 (MDV-1).
Kết quả PCR thu nhận gen MEQ. Kết quả thu nhận trình tự nucleotide và amino acid toàn bộ gen Meq. Trình tự nucleotide của chuỗi gen Meq .2 Trình tự amino acid Meq .3 Kết quả so sánh, tìm kiếm trình tự gen tương đồng trên ngân hàng gen. So sánh đặc điểm di truyền và phân tích phả hệ nguồn gốc của mẫu MDV10 phân lập tại Việt Nam với các chủng trên thế giới.
Phân tích đặc điểm di truyền cấp độ phân tử của mẫu MDV1 phân lập tại Việt Nam với các chủng thế giới .2 Phân tích phả hệ nguồn gốc của mẫu MDV1 phân lập tại Việt Nam với các chủng trên thế giới. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .38 TÀI LIỆU THAM KHẢO .39 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 2. Phân loại MDV. Danh sách các chủng MDV sử dụng trong nghiên cứu so sánh đặc điểm di truyền.
Danh sách các chủng GaHV-2 sử dụng trong nghiên cứu phả hệ nguồn gốc. Hoá chất dùng trong chất điện di. Dụng cụ dùng dùng trong nghiên cứu. Thiết bị dùng trong nghiên cứu.
Quy trình tách chiết DNA tổng số. Thành phần của phản ứng PCR. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR. Quy trình tinh sạch sản phẩm PCR.
23 v DANH MỤC HÌNH Hình 2. Một số triệu chứng bệnh Marek. Cấu tạo MDV. Cấu trúc MDV.
Vị trí gen Meq trong bộ gen MDV. Cấu trúc bộ gen Meq. GeneJET Genomic DNA Purification Kit và cột tinh sạch trong tách chiết DNA. Sơ đồ bố trí thí nghiệm.
Kết quả điện di DNA tổng số của các mẫu nghiên cứu. Kết quả điện di sản phẩm PCR chẩn đoán GaHV-2 bằng cặp mồi MarekF-MarekR. Kết quả điện di sản phẩm PCR thu nhận gen Meq bằng cặp mồi GaHV2 – MeqF và GaHV2 – MeqR. Kết quả tìm kiếm các trình tự nucleotide tương đồng với gen Meq của chủng MRVP10 bằng chương trình LAST.
Kết quả tìm kiếm các trình tự nucleotide tương đồng với gen Meq của chủng MRVP11 bằng chương trình LAST. Kết quả so sánh trình tự nucleotide gen Meq mẫu MDV1 phân lập tại Việt Nam với các chủng thế giới. Phả hệ nguồn gốc các chủng GaHV-2 của Việt Nam và thế giới dựa trên dữ liệu nucleotide gen Meq. 36 vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa của từ viết tắt MD Marek Disease MDV Marek Disease Virus MDV1 Marek Disease Virus serotype 1 GaHV 2 Gallid herpesvirus 2 DNA Deoxyribonucleotide acid RNA Ribonucleotide acid PCR Polymerase chain reaction MEQ Marek’s EcoRI Q BR basic region bZIP Basic Leucine Zipper Domain kb Kilobase bp Base pair nt nucleotide kDa Kilo Dalton DEPC Diethyl pyrocarbonate pp phosphoprotein ORF Open reading frame vii TÓM TẮT Nghiên cứu tập trung vào giải mã trình tự gen Meq của hai mẫu bệnh phẩm Marek trên gà (MRVP10 và MRVP11), thu nhận tại tỉnh Vĩnh Phúc đã xác định dương tính với virus GaHV-2.
Bằng phương pháp là thu nhận mẫu bệnh phẩm, tách chiết DNA tổng số thu được 3 mẫu cho kết quả thành công, đem chạy PCR chẩn đoán xác định 3 mẫu đó dương tính hay âm tính với virus GaHV-2 của bệnh Marek. Từ kết quả có hiện băng vạch rõ, đơn băng có kích thước 0,7 kb ta thu được 2 mẫu (MRVP10 và MRVP11 là phù hợp. Và thiết kế mồi đặc hiệu của gen Meq, sản phẩm cho chạy PCR thu nhận được vùng gen Meq. Có kết quả cho băng vạch đơn băng, rõ nét và kích thước 1,4 kb.
Sau đó đi tinh sạch, rồi giải trình tự bằng phương pháp Sager. Cuối cùng là xử lý và phân tích số liệu với 2 phần mềm (Gendoc & MegaX). Dựa vào kết quả phân tích trình tự nucleotide và amino acid của hai chủng Việt Nam với các chủng của thế giới, chúng tôi đã đánh giá được hiệu quả phòng bệnh của vaccince sản xuất từ chủng CVI988- chủng vacxin thuộc dòng MDV1 phổ biến. Đồng thời, phân tích phả hệ nguồn gốc cũng phát hiện sự hình thành các chi phân hóa theo khu vực địa lý trong đó hai chủng MRVP10 và MRVP11 có mỗi quan hệ gần gũi với các chủng phân lập từ Trung Quốc.
Từ khóa: Bệnh Marek, MDV1, Meq, Vĩnh Phúc, Việt Nam. Tính cấp thiết của đề tài Trong những năm vừa qua, chăn nuôi gà ở Việt Nam chúng ta phát triển mạnh mẽ theo hướng chăn nuôi công nghiệp tập trung, đóng góp hướng đến sự phát triển kinh tế xã hội của các địa phương. Vào năm 2016 cả nước có khoảng 252 triệu con gà với: Sản lượng trên 500 ngàn tấn thịt, 8,5 tỷ quả trứng, cho thu nhập khoảng 63 ngàn tỷ đồng, chiếm 29,5% trong tổng giá trị ngành nông nghiệp, chiếm 3,15% trong GDP (Theo báo cáo của Tổng cục Thống kê, 2016. ên cạnh đó, chăn nuôi gà còn gặp nhiều khó khăn về giá cả trên thị trường, chú ý hơn là các loại dịch bệnh luôn ẩn dấu trong cơ thể gà, ảnh hưởng nhiều tới hiệu quả sản xuất.
Trong đó thường gặp nhất ở đàn gà nuôi công nghiệp, đặc biệt là đàn gà đẻ, đó là bệnh Marek, do con virus Gallid herpesvirus gây ra (Lê Văn Nam, 2013. Dựa trên các đặc điểm huyết thanh học, virus Marek có thể được chia thành ba type/serotype. Trong đó serotype 1 được gây ra bởi GaHV-2 (Gallid herpesvirus 2 )là loại virus có độc lực mạnh, gây ức chế miễn dịch và có khả năng tạo thành các khối u, làm thiệt hại về kinh tế nặng nề ở rất nhiều quốc gia (Calnek, 2001; Lee et al. Dựa trên tỷ lệ tử vong và tỷ lệ mắc bệnh ở động vật được tiêm MDV, có năm kiểu bệnh MDV: Nhược độc (a), độc lực yếu (m , độc lực (v), độc lực cao (vv , và cực kỳ độc lực (vv+) (Witter et al.
MDV cũng được tìm thấy trong biểu mô nang lông của gia cầm (Witter, Schat, 2003). Gần đây, các nghiên cứu dịch tễ học phân tử trên thế giới đã phát hiện ra bằng chứng về sự tái tổ hợp giữa các chủng MDV (He et al. Trong bộ gen, nhiều gen đã được xác định có liên quan đến độc lực của virus, bao gồm các gen Meq, icp4 và vil-8. Gen Meq có kích thước 1020 bp, nằm ở các vùng lặp dài của bộ gen và có liên quan đến tính gây ung thư và tính gây bệnh của virus (Lee et al.
Các báo cáo trước đây cho thấy các đa hình và đột biến điểm khác nhau trong vùng gen Meq có tương quan với độc lực của MDV.