Luận văn thạc sĩ phân lập và đánh giá hoạt động của promoter chuyên biệt hạt phấn từ cây lúa oryza sativa l

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu phân lập và đánh giá hoạt động promoter chuyên biệt hạt phấn từ cây lúa Oryza sativa L, ứng dụng trong công nghệ sinh học.

• Tác giả: Trương Kim Oanh
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Tiến Dũng
• Trường học: Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Phân lập và đánh giá hoạt động của promoter chuyên biệt hạt phấn từ cây lúa (Oryza sativa L.)
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• MỞ ĐẦU
• 0.1. Mục đích nghiên cứu
• 0.2. Ý nghĩa của luận văn
• 0.2.1. Ý nghĩa khoa học
• 0.2.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Vai trò của cây lúa
• 1.2. Tổng quan về promoter
• 1.2.1. Khái niệm về promoter
• 1.2.2. Phân loại promoter
• 1.2.2.1. Promoter không đặc hiệu
• 1.2.2.2. Promoter đặc hiệu
• 1.2.2.3. Promoter cảm ứng
• 1.2.3. Điều hòa gene ở sinh vật nhân chuẩn
• 1.2.4. Ứng dụng promoter trong công nghệ gene thực vật
• 1.2.5. Vai trò của yếu tố điều hòa Cis
• 1.2.6. Vai trò hạt phấn trong nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng thích ứng với biến đổi khí hậu
• 1.2.7. Phương pháp chuyển gene ở thực vật qua Agrobacterium
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng, phạm vi nghiên cứu
• 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.1.2. Phạm vi nghiên cứu
• 2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 2.1.3.1. Địa điểm nghiên cứu
• 2.1.3.2. Thời gian nghiên cứu
• 2.2. Vật liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu
• 2.2.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.2.2. Thiết bị thí nghiệm
• 2.3. Nội dung nghiên cứu
• 2.3.1. Nội dung 1: Nghiên cứu sàng lọc gene chuyên biệt hạt phấn
• 2.3.2. Nội dung 2: Tách dòng promoter chuyên biệt hạt phấn và thiết kế vector chuyển gene
• 2.3.3. Nội dung 3: Đánh giá hoạt động của promoter trên cây mô hình Arabidopsis
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Nghiên cứu sàng lọc gene chuyên biệt hạt phấn
• 2.4.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
• 2.4.3. Phương pháp khuyếch đại DNA tổng số bằng kỹ thuật PCR
• 2.4.4. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR
• 2.4.5. Phương pháp thiết kế vector tách dòng promoter
• 2.4.6. Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến
• 2.4.7. Phương pháp sàng lọc dòng tế bào tái tổ hợp
• 2.4.8. Phương pháp tách chiết plasmid
• 2.4.9. Phương pháp định lượng DNA
• 2.4.10. Phương pháp xác định trình tự
• 2.4.11. Thiết kế vector biểu hiện GUS
• 2.4.12. Phương pháp biến nạp vào vi khuẩn Agrobacterium
• 2.4.13. Phương pháp chuyển gene trên cây Arabidopsis
• 2.4.14. Phương pháp đánh giá hoạt động của promoter
• 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Sàng lọc gene chuyên biệt hạt phấn lúa
• 3.2. Tách dòng và thiết kế vector
• 3.3. Kết quả nghiên cứu chuyển gene và phân tích biểu hiện gen GUS
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Mở đầu

Nghiên cứu về phân lập promoter và đánh giá hoạt động promoter chuyên biệt từ hạt phấn cây lúa (Oryza Sativa) có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển giống cây trồng thích ứng với biến đổi khí hậu. Hạt phấn là cơ quan sinh sản chính, ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất cây trồng. Việc hiểu rõ về hoạt động promoter sẽ giúp tối ưu hóa quá trình chọn tạo giống, nâng cao khả năng chống chịu của cây trồng trước các điều kiện môi trường khắc nghiệt.

1.1. Mục đích nghiên cứu

Mục đích chính của nghiên cứu này là phân lập và đánh giá hoạt động của các promoter chuyên biệt từ hạt phấn cây lúa. Thông qua việc này, nghiên cứu sẽ cung cấp thông tin cần thiết cho việc chọn tạo giống cây trồng có khả năng thích ứng tốt hơn với các điều kiện khí hậu thay đổi, từ đó góp phần vào an ninh lương thực.

1.2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Nghiên cứu này không chỉ tạo cơ sở lý luận cho việc chọn lọc giống lúa mà còn có ý nghĩa thực tiễn trong việc nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm nông nghiệp. Việc đánh giá hoạt động của promoter sẽ giúp xác định các gene có khả năng chịu hạn, từ đó phát triển các giống lúa có phẩm chất tốt hơn, phù hợp với điều kiện canh tác ở Việt Nam.

II. Tổng quan tài liệu

Cây lúa (Oryza Sativa) đóng vai trò quan trọng trong nền nông nghiệp Việt Nam. Nghiên cứu về promoter giúp hiểu rõ hơn về cơ chế điều hòa gene trong cây trồng. Các promoter có thể được phân loại thành promoter không đặc hiệu và promoter đặc hiệu. Mỗi loại có vai trò riêng trong việc điều khiển hoạt động gene, ảnh hưởng đến sự phát triển và năng suất của cây lúa.

2.1. Khái niệm về promoter

Promoter là trình tự nucleotide cần thiết để ARN polymerase bám vào và khởi động quá trình phiên mã. Trong sinh vật nhân chuẩn, promoter thường bao gồm các vị trí nhận biết bởi ARN polymerase và các yếu tố phiên mã. Việc hiểu rõ về cấu trúc và chức năng của promoter là rất cần thiết để ứng dụng trong công nghệ sinh học.

2.2. Phân loại promoter

Promoter có thể được phân loại thành hai nhóm chính: promoter không đặc hiệu và promoter đặc hiệu. Promoter không đặc hiệu điều khiển biểu hiện gene ở hầu hết các loại mô, trong khi promoter đặc hiệu chỉ hoạt động ở một số mô nhất định. Sự hiểu biết về các loại promoter này sẽ giúp tối ưu hóa quy trình chọn tạo giống cây trồng.

III. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp hiện đại để phân lập và đánh giá hoạt động của promoter từ hạt phấn cây lúa. Các phương pháp bao gồm tách chiết DNA, khuyếch đại DNA bằng kỹ thuật PCR, và thiết kế vector chuyển gene. Những phương pháp này giúp đảm bảo tính chính xác và hiệu quả trong việc xác định hoạt động của các promoter.

3.1. Tách chiết DNA

Phương pháp tách chiết DNA tổng số được thực hiện để thu nhận DNA từ mẫu hạt phấn. Quá trình này bao gồm các bước như phá vỡ tế bào, tách chiết và tinh sạch DNA. Kết quả thu được sẽ được sử dụng cho các bước tiếp theo trong nghiên cứu.

3.2. Khuyếch đại DNA bằng PCR

Kỹ thuật PCR được áp dụng để khuyếch đại các đoạn DNA mong muốn. Phương pháp này cho phép tạo ra số lượng lớn DNA từ một mẫu nhỏ, giúp dễ dàng hơn trong việc phân tích và đánh giá hoạt động của các promoter. Kết quả từ PCR sẽ được sử dụng để xác định sự hiện diện và hoạt động của các gene liên quan.

Nội dung chính

## Tổng quan nghiên cứu

Cây lúa (Oryza sativa L.) là cây lương thực chủ yếu nuôi sống khoảng 40% dân số thế giới, đặc biệt quan trọng tại khu vực Châu Á với hơn 110 quốc gia sản xuất và tiêu thụ gạo. Ở Việt Nam, diện tích trồng lúa đạt khoảng 7,8 triệu ha với sản lượng 44,84 triệu tấn năm 2014, năng suất bình quân 57,4 tạ/ha. Lúa không chỉ đảm bảo an ninh lương thực mà còn đóng góp lớn vào kinh tế quốc dân, đặc biệt trong bối cảnh biến đổi khí hậu ngày càng gay gắt ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng cây trồng.

Hạt phấn là cơ quan sinh sản quan trọng của cây lúa, rất nhạy cảm với các điều kiện môi trường như nhiệt độ cao, ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất. Quá trình phát triển hạt phấn được điều khiển bởi nhiều gene chuyên biệt. Trong đó, promoter là trình tự nucleotide nằm trước gene, đóng vai trò điều khiển hoạt động phiên mã gene, rất quan trọng trong nghiên cứu biểu hiện gene và chọn tạo giống cây trồng thích ứng với stress môi trường.

Mục tiêu nghiên cứu là phân lập và đánh giá hoạt động của promoter chuyên biệt hạt phấn từ cây lúa nhằm cung cấp thông tin phục vụ công tác chọn tạo giống lúa chịu hạn, thích ứng với biến đổi khí hậu. Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, Trường Đại học Nông Lâm – Đại học Thái Nguyên từ tháng 5/2018 đến tháng 6/2019. Kết quả nghiên cứu góp phần nâng cao hiệu quả bảo tồn và chọn tạo giống lúa có năng suất cao, phẩm chất tốt, phù hợp với điều kiện khô hạn và stress nhiệt độ cao tại Việt Nam.

---

## Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

### Khung lý thuyết áp dụng

- **Lý thuyết về promoter gene:** Promoter là trình tự DNA điều khiển sự khởi đầu phiên mã gene, gồm các yếu tố cis và trans, có thể là promoter cơ định (constitutive), promoter đặc hiệu mô (tissue-specific) hoặc promoter cảm ứng (inducible). Promoter đặc hiệu hạt phấn giúp điều khiển gene biểu hiện riêng biệt ở hạt phấn, có vai trò quan trọng trong phát triển sinh sản và khả năng chống chịu stress.

- **Mô hình điều hòa gene ở sinh vật nhân chuẩn:** Phiên mã được điều hòa bởi ARN polymerase II và các nhân tố phiên mã (transcription factors) tương tác với các yếu tố cis trong promoter và enhancer. Sự điều hòa này ảnh hưởng đến biểu hiện gene trong không gian và thời gian, đặc biệt trong điều kiện stress môi trường.

- **Ứng dụng công nghệ chuyển gene qua Agrobacterium:** Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens có khả năng chuyển đoạn T-DNA chứa gene mục tiêu vào genome thực vật, được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ sinh học thực vật để tạo cây chuyển gene biểu hiện gene mong muốn dưới sự điều khiển của promoter chuyên biệt.

- **Khái niệm và vai trò của yếu tố điều hòa cis (CRE):** Các yếu tố cis như ABRE, MYBRS, DRE, LTRE đóng vai trò nhận biết và điều hòa biểu hiện gene trong điều kiện stress như hạn, nhiệt độ cao, giúp cây thích ứng với môi trường bất lợi.

### Phương pháp nghiên cứu

- **Nguồn dữ liệu:** Sử dụng cơ sở dữ liệu microarray RiceXPro để sàng lọc 1.080 gene biểu hiện chuyên biệt ở hạt phấn lúa, trong đó 410 gene biểu hiện ở giai đoạn early-microspore và 672 gene ở late pollen. Lựa chọn 10 gene ứng viên (RMP1 đến RMP10) có biểu hiện mạnh để nghiên cứu.

- **Phương pháp phân tích:** Tách chiết DNA tổng số từ hạt phấn lúa, khuyếch đại vùng promoter của gene bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu, tinh sạch sản phẩm PCR, tách dòng promoter vào vector pDONR201 bằng phương pháp Gateway. Biến nạp vector tái tổ hợp vào E.coli DH5α, sàng lọc dòng tái tổ hợp bằng PCR, xác định trình tự promoter bằng giải trình tự gene.

- **Thiết kế vector chuyển gene:** Gắn promoter vào vector pKGWFS7 chứa gene chỉ thị GFP/GUS, biến nạp vào vi khuẩn Agrobacterium GV3101, chuyển gene vào cây mô hình Arabidopsis thaliana bằng phương pháp nhúng hoa.

- **Đánh giá hoạt động promoter:** Phân tích biểu hiện gene chỉ thị GUS trong cụm hoa cây chuyển gene bằng nhuộm X-Gluc và PCR xác định sự có mặt của gene GUS trong DNA tổng số từ hạt phấn cây chuyển gene.

- **Timeline nghiên cứu:** Thực hiện từ tháng 5/2018 đến tháng 6/2019 tại Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, Trường Đại học Nông Lâm – Đại học Thái Nguyên.

---

## Kết quả nghiên cứu và thảo luận

### Những phát hiện chính

- **Sàng lọc gene chuyên biệt hạt phấn:** Xác định 1.080 gene biểu hiện chuyên biệt ở hạt phấn lúa, trong đó 410 gene ở giai đoạn early-microspore và 672 gene ở late pollen. Lựa chọn 10 gene ứng viên RMP có biểu hiện mạnh, ví dụ RMP1 mã hóa Glycoside hydrolase 35, RMP3 mã hóa purple acid phosphatase, RMP4 mã hóa kinase protein.

- **Tách dòng promoter và thiết kế vector:** Thành công tách dòng promoter RMP1 (1.343 bp) và RMP2 (754 bp), xác nhận trình tự promoter trùng khớp với dữ liệu ngân hàng gene. Gắn promoter vào vector pKGWFS7 điều khiển gene chỉ thị GFP/GUS, xác nhận tái tổ hợp thành công qua PCR.

- **Chuyển gene và biểu hiện gene GUS:** Chuyển thành công cấu trúc RMP1::GFP/GUS và RMP2::GFP/GUS vào cây Arabidopsis, thu được 25 cây chuyển gene RMP1 và 20 cây RMP2 thế hệ T1. PCR xác nhận gene GUS có mặt trong DNA tổng số của 14 cây chuyển gene được phân tích. Nhuộm X-Gluc cho thấy biểu hiện gene GUS đặc hiệu ở cụm hoa, chứng tỏ promoter hoạt động hiệu quả và đặc hiệu mô.

### Thảo luận kết quả

- Việc xác định và phân lập promoter chuyên biệt hạt phấn từ cây lúa cung cấp công cụ quan trọng cho nghiên cứu biểu hiện gene và chọn tạo giống lúa chịu stress. Kết quả phù hợp với các nghiên cứu trước đây về vai trò của promoter đặc hiệu mô trong điều khiển biểu hiện gene.

- Biểu hiện gene chỉ thị GUS dưới sự điều khiển của promoter RMP1 và RMP2 trên cây mô hình Arabidopsis chứng minh tính đặc hiệu và hiệu quả của promoter trong điều kiện thực nghiệm, mở ra hướng ứng dụng trong công nghệ chuyển gene thực vật.

- So sánh với promoter cơ định như CaMV35S, promoter chuyên biệt hạt phấn giúp tránh biểu hiện không mong muốn ở các mô khác, giảm thiểu tác động phụ và tăng tính chính xác trong nghiên cứu gene chức năng và chọn tạo giống.

- Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ bản đồ nhiệt thể hiện mức độ biểu hiện gene RMP ở các giai đoạn phát triển hạt phấn, hình ảnh nhuộm X-Gluc biểu hiện gene GUS ở cụm hoa, và bảng so sánh kích thước promoter, số lượng cây chuyển gene thành công.

---

## Đề xuất và khuyến nghị

- **Phát triển các dòng cây chuyển gene sử dụng promoter chuyên biệt hạt phấn:** Tăng cường khả năng chống chịu stress nhiệt độ cao và hạn hán, nâng cao năng suất và chất lượng lúa, thực hiện trong vòng 3-5 năm, do các viện nghiên cứu nông nghiệp và trường đại học chủ trì.

- **Ứng dụng promoter trong công nghệ tạo giống lai:** Sử dụng promoter kết hợp với gene gây bất dục đực để sản xuất hạt lai, giảm chi phí và tăng hiệu quả sản xuất, triển khai trong 2-4 năm, do các trung tâm giống cây trồng thực hiện.

- **Mở rộng nghiên cứu promoter đặc hiệu mô khác:** Khai thác promoter đặc hiệu cho các mô khác như rễ, thân để phát triển các giống cây trồng đa dạng thích ứng với nhiều loại stress môi trường, tiến hành song song với nghiên cứu hiện tại.

- **Đào tạo và chuyển giao công nghệ:** Tổ chức các khóa đào tạo về kỹ thuật phân lập promoter, chuyển gene và đánh giá biểu hiện gene cho cán bộ nghiên cứu và kỹ thuật viên, nâng cao năng lực nghiên cứu và ứng dụng công nghệ sinh học trong nông nghiệp.

---

## Đối tượng nên tham khảo luận văn

- **Nhà nghiên cứu công nghệ sinh học thực vật:** Nắm bắt kỹ thuật phân lập promoter, chuyển gene và đánh giá biểu hiện gene, phục vụ nghiên cứu gene chức năng và phát triển giống cây trồng.

- **Chuyên gia chọn tạo giống cây trồng:** Áp dụng promoter chuyên biệt hạt phấn trong công tác tạo giống lúa chịu hạn, stress nhiệt, nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm.

- **Sinh viên và học viên cao học ngành công nghệ sinh học, nông nghiệp:** Học tập phương pháp nghiên cứu hiện đại, hiểu rõ cơ sở lý thuyết và thực nghiệm về điều hòa gene và ứng dụng promoter trong công nghệ gene.

- **Doanh nghiệp công nghệ sinh học và nông nghiệp:** Tìm hiểu công nghệ chuyển gene và ứng dụng promoter đặc hiệu để phát triển sản phẩm giống cây trồng mới, nâng cao giá trị kinh tế và cạnh tranh thị trường.

---

## Câu hỏi thường gặp

1. **Promoter chuyên biệt hạt phấn là gì?**  
Promoter chuyên biệt hạt phấn là trình tự DNA điều khiển gene chỉ biểu hiện ở hạt phấn, giúp kiểm soát chính xác biểu hiện gene trong mô sinh sản, tránh biểu hiện không mong muốn ở mô khác.

2. **Tại sao chọn cây Arabidopsis để đánh giá promoter?**  
Arabidopsis là cây mô hình có thời gian sinh trưởng ngắn, dễ chuyển gene và phân tích biểu hiện gene, giúp đánh giá hiệu quả promoter một cách nhanh chóng và chính xác.

3. **Phương pháp chuyển gene qua Agrobacterium có ưu điểm gì?**  
Phương pháp này cho phép chuyển gene ổn định vào genome thực vật, hiệu quả cao, ít gây đột biến ngoài ý muốn và được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và sản xuất giống cây trồng chuyển gene.

4. **Làm thế nào để đánh giá hoạt động của promoter?**  
Hoạt động promoter được đánh giá qua biểu hiện gene chỉ thị GUS bằng nhuộm X-Gluc tạo màu xanh đặc trưng và xác định sự có mặt của gene GUS bằng PCR trên DNA tổng số từ mô cây chuyển gene.

5. **Ứng dụng thực tiễn của promoter chuyên biệt hạt phấn là gì?**  
Promoter này giúp tạo các giống lúa có khả năng chống chịu stress môi trường, sản xuất hạt lai hiệu quả, nghiên cứu chức năng gene liên quan đến phát triển hạt phấn và nâng cao năng suất cây trồng.

---

## Kết luận

- Đã phân lập thành công promoter chuyên biệt hạt phấn RMP1 và RMP2 từ cây lúa với kích thước lần lượt 1.343 bp và 754 bp.  
- Promoter RMP1 và RMP2 được gắn vào vector chuyển gene pKGWFS7 và chuyển thành công vào cây mô hình Arabidopsis.  
- Biểu hiện gene chỉ thị GUS dưới sự điều khiển của promoter RMP1 và RMP2 được xác nhận đặc hiệu ở cụm hoa, chứng minh hiệu quả hoạt động của promoter.  
- Nghiên cứu cung cấp công cụ quan trọng cho công tác chọn tạo giống lúa chịu hạn và stress nhiệt, góp phần phát triển nông nghiệp bền vững.  
- Đề xuất tiếp tục ứng dụng promoter trong tạo giống lai, mở rộng nghiên cứu promoter đặc hiệu mô khác và đào tạo chuyển giao công nghệ trong 3-5 năm tới.

Khuyến khích các viện nghiên cứu và doanh nghiệp ứng dụng promoter chuyên biệt hạt phấn trong phát triển giống cây trồng, đồng thời mở rộng nghiên cứu để nâng cao khả năng thích ứng của cây trồng với biến đổi khí hậu.

Trích đoạn nội dung tài liệu

mở đầu và hộp TATA, các enhancer thì nằm cách xa gen đích đôi khi được gọi là vị trí hoạt hóa ngược dòng (upstream activation site). Nghiên cứu ở sinh vật nhân chuẩn bậc cao, bao gồm cả động vật có vú cho thấy rằng ARN pol hoạt động được là do sự Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.vn 12 trợ giúp của ít nhất 6 nhân tố phiên mã chung được ký hiệu là TF II A, B, D, E, F và H (TF II = TF fol pol II), trong đó TF II D đã được nghiên cứu kĩ nhất gồm nhiều tiểu phần polypeptide, trong đó quan trọng nhất là loại protein có khả năng bám vào hộp TATA, viết tắt là TBP (TATA box binding protein). TBP bám vào hộp TATA và kéo theo các phần còn lại theo nó. ARN polymerase II cùng với tất cả các nhân tố phiên mã trên tạo thành phức hệ khởi đầu phiên mã [8].

ARN pol I xúc tác cho quá trình tổng hợp rARN. Các gen rARN mang những đoạn lặp kế tiếp trên trên một hoặc nhiều nhiễm sắc thể. ARN pol I phiên mã một bản phiên mã sơ cấp, sau đó bẻ gãy thành hai tiểu đơn vị 28s và 5,8s. Phức hợp tiền khởi đầu phiên mã ở các promoter của ARN pol I đơn giản hơn nhiều so với của ARN pol II, bao gồm pol I và hai nhân tố phiên mã có tên là SL1 và UBF (upstream binding factor) có chức năng bám ở phía trước.

Bản thân pol I và SL1 không thể tự bám vào promoter được, UBF bám vào một nhân tố kiểm soát nằm ở phía trước là UCE (upstream control element) của promoter rARN. Nhờ vậy mà SL1 gắn được vào phức hệ, làm cho pol I bám được chặt hơn và tạo ra phức hệ tiền khởi đầu phiên mã. ARN pol III phiên mã các tARN và các ARN nhỏ khác (5s rARN, snARNs). Giống như promoter của ARN pol I, promoter của ARN pol III cũng không có hộp TATA [8].

Sau khi được phiên mã, phân tử tiền thân mARN ở sinh vật nhân chuẩn phải trải qua ba thay đổi cơ bản trước khi được dùng làm khuôn để tổng hợp protein. Trước tiên, mARN được gắn mũ m7G vào đầu 5’, gắn đuôi polyA vào đầu 3’ và cắt nối intron - exon thành phân tử mARN hoàn chỉnh. Phản ứng methyl hóa tạo cấu trúc mũ giúp cho ribosome nhận biết được phân tử mARN và bám vào nó. Cấu trúc mũ còn giúp bảo vệ đầu 5 ’ của mARN không bị phân cắt bởi exonuclease.

Phản ứng gắn đuôi polyA (≈200A ) vào các phân tử mARN ở sinh vật nhân chuẩn xảy ra trong nhân tế bào, khi bị chuyển ra tế bào chất thì đuôi này bị ngắn dần, tuy nhiên trong thực tế không phát hiện Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.vn 13 được đuôi polyA nào ngắn hơn 30A. Do đó đuôi polyA ngắn nhất để phân tử mARN không bị phân hủy có thể là 30A. Đặc biệt để đảm bảo độ bền vững của đuôi, các nucleotide còn được thêm vào. Nói chung việc thay đổi độ dài đuôi polyA được kiểm soát rất chặt chẽ.

Các mARN sinh vật nhân chuẩn khá bền vững. Các mARN kém bền do chúng mang các đoạn nucleotide đặc biệt tại đầu 3’ kích thích sự phân hủy mARN. Khi đoạn nucleotide giàu A và U ở vùng 3’ không dịch mã của phân tử mARN kém bền được ghép với một số phân tử mARN bền vững khác thì những phân tử này trở nên kém bền do đuôi poly A bị cắt ngắn rất nhanh. Như vậy đoạn nucleotide giàu AU kích thích sự phân hủy mARN thông qua việc giảm độ dài đuôi polyA.

Ngoài ra, một số mARN có chứa vị trí đặc hiệu ở đầu 3’ được nhận biết bởi endonuclease. Thông thường, các protein giữ vai trò chủ đạo kiểm soát quá trình phiên mã cũng như dịch mã, tuy nhiên hoạt động của một số gene lại được điều khiển bởi các ARN có kích thước nhỏ 21 - 27 nucleotide được hình thành khi số lượng mARN của gene đích tăng quá mức trong tế bào gọi là miARN sẽ tạo ra phức phân cắt mARN hoặc ức chế ribosome tổng hợp protein. Điều hòa dịch mã Ở sinh vật nhân sơ, số lần dịch mã của hầu hết các phân tử mARN đều giống nhau, chỉ có sự thay đổi nhỏ từ gene này tới gene khác. Ở sinh vật nhân chuẩn, sự dịch mã đôi khi được điều hòa gồm các kiểu kiểm soát một phân tử mARN không được dịch mã khi chưa nhận được tín hiệu, điều hòa thời gian sống của một phân tử mARN nhất định, điều hòa tốc độ tổng hợp toàn bộ protein [8].

Ứng dụng promoter trong công nghệ gene thực vật Promoter đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển gene nói chung và chuyển gene ở thực vật nói riêng. Việc chuyển gene ở các giống cây có ý nghĩa kinh tế thường rất khó, vì vậy cần phải thử nghiệm tiềm năng biểu hiện của gene chỉ thị chọn lọc với các promoter khác nhau. Nhiều promoter được Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.vn 14 dùng trong chuyển gene thực vật đã được nghiên cứu và sử dụng có hiệu quả. Promoter 35s của virus khảm CaMV hoặc PiMV và promoter NOS thường được sử dụng.

Promoter 35s có tiềm năng cao và thường được sử dụng nhiều trong các thiết kế vetor chuyển gene. Các promoter cảm ứng có vai trò đối với quá trình biểu hiện các gene chuyển nạp trong những điều kiện cảm ứng như các gene chống lại quá trình oxy hóa giúp cho cây chống lại các stress hiếu khí hay gene kháng kháng sinh tạo ra do nhiệt độ để chọn các đột biến trong việc tạo ra tín hiệu ở chu trình chuyển hóa các chất dưới tác dụng của nhiệt. Một số các promoter cảm ứng khác cũng được nghiên cứu promoter sốc nhiệt, chuỗi khởi động cảm ứng nitrate từ gen nitrite reductase [10] và các promoter cảm ứng hormone. Do các mối quan tâm ngày càng nhiều về việc sử dụng thực vật như là hệ thống mẫu để phát triển sinh học phân tử, nhiều gene và các chuỗi khởi động liên quan được mô tả.

Các gene này được biểu hiện trong các loại mô hay trong các giai đoạn phát triển khác nhau của cây như các gene biểu hiện ở hạt phấn, ở hoa [48], ở rễ và ở thân [14]. Các nghiên cứu về gen ubiquitin ở thực vật đã phát hiện ra một số lượng lớn các nhóm promoter có sự biểu hiện mạnh ở thực vật. Polybiquitin promoter được phân lập và xác định đặc tính từ cây ngô, cây thuốc lá, cây hướng dương, khoai tây, cà chua, lúa, mía đường và đậu tương. Đa số các promoter này điều khiển ở mức độ cao hơn so với promoter CaMV35s trong quá trình biểu hiện ở các loài thực vật chuyển gene.

Do gene Ubiquitin được biểu hiện ở hầu hết các mô thực vật trong điều kiện tự nhiên, nên promoter ubiquitin đã được sử dụng để biểu hiện gene trong các loại thực vật chuyển gene đặc biệt là giữa các loài gần gũi. Sự biểu hiện mạnh của promoter ubiquitin được chi phối bởi sự xuất hiện của các đoạn intron, những đoạn chủ yếu định vị trong vùng 5’ không dịch mã của gene ubiquitin [34], [44]. Các đoạn intron gần với bộ ba khởi đầu dịch mã là những nhân tố cis quan trọng, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.vn 15 là nguyên nhân gây ra sự tăng cường gián tiếp có liên quan đến intron (intron – mediate enhancement - IME) của quá trình biểu hiện gene ở thực vật…[15]. Ngày nay ubiquitin promoter và actin promoter của lúa thường được sử dụng để biểu hiện gene ở cây một lá mầm.

Trong đó ubiquitin promoter được thử nghiệm trong quá trình điều khiển biểu hiện gene ở cây ngô, lúa, đậu tương…[27], [34]. Vai trò của yếu tố điều hòa Cis Yếu tố điều hòa cis định vị trên vùng điều hòa của promoter, là vị trí nhận biết của yếu tố phiên mã, tham gia điều hòa biểu hiện của gene đáp ứng với các điều kiện bất lợi [3]. Việc phát hiện ra yếu tố điều hòa cis (cis regulatory element, CRE) nằm trong trình tự của promoter của gene được coi là một thành công trong việc giải mã toàn bộ cơ chế điều hòa phiên mã của gene. Rất nhiều kết quả thu được gần đây đã khẳng định sự tham gia của CRE trong con đường dẫn truyền tín hiệu điều khiển các quá trình sinh học diễn ra trong tế bào.

Nhiều nghiên cứu liên quan đến CRE đã cung cấp những dẫn liệu khá đầy đủ về chức năng của chúng vào sự phát triển của cây trồng. Một số yếu tố điều hòa cis quan trọng đã được tìm ra như ABRE cảm ứng với ABA, MYBRS và MYCRS đáp ứng hạn, DRE và LTRE cảm ứng với nhiệt độ… (Bảng 1. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc. Một số yếu tố điều hòa cis quan trọng đáp ứng điều kiện bất lợi [3].

Yếu tố điều hòa Trình tự bảo thủ Chức năng cis ABRE CCACGTGG Tham gia vào quá trình đáp ứng với ABA. MYBRS (A/C)ACC(A/T)A(A/C)C Tham gia vào quá trình đáp ứng hạn. Tham gia vào quá trình đáp ứng sớm với điều MYCRS CACATG kiện hạn và cảm ứng với ABA. Liên quan đến sự đáp ứng với điều kiện DRE TACCGACAT mặn, hạn và nhiệt độ thấp.

ACCGACA;CCGAAA; Yếu tố đáp ứng nhiệt độ thấp, điều hòa LTRE GTCGAC đáp ứng điều kiện lạnh. Đặc trưng của các promoter hoạt động cảm ứng stress là có mang các yếu tố hoạt hóa cis (cis-acting element) đóng vai trò là vị trí liên kết với nhân tố phiên mã (được kích hoạt bởi các tín hiệu stress) để điều hòa biểu hiện của các gen liên quan Các yếu tố hoạt hóa cis đáp ứng điều kiện stress được chia thành 3 nhóm, bao gồm (1)nhóm liên quan tới con đường điều hòa phụ thuộc hormone ABA như yếu tố cis ABRE (chứa motif –T/CACGTGG với trình tự lõi ACGT), MYCRS (trình tự nhận biết MYC - CANNTG), MYBRS (trình tự nhận biết MYB – A/TAACCA và C/TAACG/TG)…, (2) nhóm không phụ thuộc ABA như yếu tố cis DRE (có trình tự lõi A/GCCGAC)… và (3) liên quan đến cả hai con đường trên như yếu tố cis NAC (có chứa trình tự lõi CATGTG), ZFHDRS (chứa một motif bảo thủ TT/AAATT). Vai trò hạt phấn trong nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng thích ứng với biến đổi khí hậu Phần lớn chúng ta đều cho rằng các cơ quan sinh trưởng thân, lá dễ bị ảnh hưởng bởi stress nhiệt độ và cần được nghiên cứu. Tuy nhiên, những Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.