Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Selen (Se) là một nguyên tố khoáng vi lượng thiết yếu đối với cơ thể con người và động vật. Mặc dù chỉ cần một hàm lượng rất nhỏ trong khẩu phần hàng ngày, sự thiếu hụt Selen có thể dẫn đến nhiều rối loạn chức năng và bệnh lý nghiêm trọng, điển hình là bệnh cơ tim Keshan, suy giảm miễn dịch, lão hóa tế bào và tăng nguy cơ mắc các bệnh ung thư (đặc biệt là ung thư ruột kết, phổi, tuyến tiền liệt và da). Về mặt sinh hóa, Selen đóng vai trò trung tâm trong trung tâm hoạt động của enzyme chống oxy hóa glutathione peroxidase (GPX) cùng với vitamin E, giúp bảo vệ màng tế bào khỏi sự phá hủy của các gốc tự do và peroxyd, đồng thời tham gia đào thải, làm giảm độc tính của các kim loại nặng như thủy ngân, chì, cadmi, asen.

Tuy nhiên, Selen ở dạng muối vô cơ (như natri selenit - $\text{Na}_2\text{SeO}_3$) có độc tính rất cao và khả năng hấp thu qua đường tiêu hóa của cơ thể người rất kém. Để có thể ứng dụng an toàn và hiệu quả trong y dược, Selen vô cơ cần được chuyển hóa sinh học thành các dạng hữu cơ (như selenomethionine hoặc men bia giàu Selen) có hoạt tính sinh học cao và ít độc hại.

Nấm men thuộc chi Saccharomyces, đặc biệt là hai loài Saccharomyces cerevisiae và Saccharomyces boulardii, là những vi sinh vật được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp lên men và làm probiotic do tính an toàn cao, khả năng đề kháng tự nhiên với kháng sinh và khả năng tồn tại tốt trong môi trường acid dạ dày cũng như muối mật. Trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, nấm men có đặc tính sinh học nổi bật là tích lũy các nguyên tố vi lượng từ môi trường và chuyển hóa thành dạng hữu cơ liên kết trong sinh khối tế bào. Xuất phát từ thực tiễn trên, đề tài khóa luận được thực hiện nhằm giải quyết các nhiệm vụ khoa học cụ thể sau:

  1. Khảo sát quy trình nuôi cấy và tối ưu hóa các điều kiện môi trường nhằm thu nhận sinh khối nấm men tối đa.
  2. Khảo sát khả năng tích lũy và hấp thu Selen của hai chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae và Saccharomyces boulardii ở các nồng độ và thời gian khác nhau, định hướng tạo nguồn nguyên liệu giàu Selen hữu cơ ứng dụng trong chế phẩm chăm sóc sức khỏe.
  • Đối tượng nghiên cứu: Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae (phân lập từ men rượu truyền thống) và chủng nấm men Saccharomyces boulardii (được cung cấp từ Bộ môn Vi sinh, Khoa Dược, Đại học Y Dược TP.HCM).
  • Phạm vi nghiên cứu: Các thí nghiệm nuôi cấy, khảo sát điều kiện sinh trưởng, thử nghiệm độc tính của muối Selen và định lượng khả năng hấp thu Selen được thực hiện tại phòng thí nghiệm Bộ môn Vi Ký Sinh (Khoa Dược, Đại học Y Dược TP.HCM) và Khoa Công nghệ Sinh học (Trường Đại học Mở - Bán công TP.HCM) trong giai đoạn khóa học 2001 - 2005.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và khái niệm khoa học

  • Thực phẩm chức năng và Probiotic: Theo định nghĩa của Fuller (1989), probiotic là các vi sinh vật sống được bổ sung qua đường thức ăn nhằm mang lại tác động có lợi cho vật chủ thông qua việc cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột. Nghiên cứu tổng quan chỉ ra các tiêu chuẩn cần có của chủng probiotic: định danh chính xác, có nguồn gốc bình thường ở người, không sinh độc tố/gây bệnh, bền vững với acid dạ dày, muối mật, có khả năng đối kháng vi khuẩn gây hại và ổn định trong quá trình sản xuất đông khô.
  • Sinh lý học và độc tính của Selen: Nhu cầu Selen khuyến cáo dao động từ 15 $\mu\text{g}$/ngày (trẻ còn bú) đến 75 $\mu\text{g}$/ngày (phụ nữ cho con bú), người lớn từ 55 - 70 $\mu\text{g}$/ngày. Khoảng nồng độ an toàn và đầy đủ theo Viện Hàn lâm Khoa học Mỹ là 50 - 200 $\mu\text{g}$/ngày. Ngưỡng gây độc mạn tính xảy ra khi sử dụng trên 5 mg/ngày kéo dài, gây rụng tóc, biến đổi móng, tiêu chảy, tổn thương gan và thần kinh. Khí hydrogen selenide ($\text{H}_2\text{Se}$) có liều độc cực thấp ở mức 0,05 ppm.
  • Đặc tính sinh học của nấm men Saccharomyces: Thuộc giới Fungi, ngành Ascomycota, lớp Hemiascomycetes, bộ Saccharomycetales, họ Saccharomycetaceae. S. cerevisiae có kích thước tế bào khoảng $5\text{--}12 \times 5\text{--}10,\mu\text{m}$, sinh sản bằng cách nảy chồi hoặc tạo bào tử túi, có khả năng phát triển ở pH thấp (xuống tới 1,6 - 2,0). S. boulardii có khả năng tiết protease phân giải độc tố của Clostridium difficile và trung hòa độc tố đường ruột của Escherichia coli, Vibrio cholerae.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

  • Thiết bị sử dụng: Máy lắc ủ nhiệt, máy lắc rung, máy ly tâm, tủ ấm, tủ sấy, máy đông khô, nồi hấp vô trùng, nồi cách thủy, buret, cân kỹ thuật và cân phân tích.
  • Môi trường nuôi cấy:
    • Môi trường Sabouraud rắn: Glucose 40 g/l, Pepton 10 g/l, Agar 18 g/l, nước cất vừa đủ 1000 ml, hấp tiệt trùng 121°C trong 20 phút.
    • Môi trường Sabouraud lỏng: Tương tự môi trường rắn nhưng không bổ sung agar.
    • Môi trường phân lập: Thạch Sabouraud bổ sung kháng sinh Kanamycin ở nồng độ 5 $\mu\text{g}$/ml để ức chế tạp khuẩn.
    • Môi trường bảo vệ đông khô: Bột sữa không béo 10 g, nước cất 100 ml, hấp tiệt trùng 115°C trong 15 phút.
  • Quy trình thực nghiệm:
    • Phân lập và giữ giống: Pha loãng mẫu men rượu theo bậc 10 (từ $10^{-1}$ đến $10^{-8}$), cấy gạt nồng độ $10^{-6}, 10^{-7}, 10^{-8}$ lên đĩa thạch chứa Kanamycin, ủ 2 ngày ở nhiệt độ phòng, quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi, cấy phân lập và lưu trữ trên thạch nghiêng Sabouraud.
    • Khảo sát tối ưu hóa nuôi cấy lỏng: Nuôi cấy nấm men trong bình tam giác chứa 100 ml môi trường Sabouraud lỏng (tiếp giống 10 ml dịch men hoạt hóa 24 giờ), lắc hiếu khí ở 200 vòng/phút, 30°C. Tiến hành thay đổi lần lượt: nồng độ glucose (5, 10, 20, 30, 40 g/l), pepton (5, 10, 20, 40 g/l), pH môi trường (4,5; 5,0; 5,5; 6,0) và thời gian lên men (24, 36, 48, 72 giờ).
    • Khảo sát bổ sung Selen và thử nghiệm sức sống: Bổ sung muối vô cơ $\text{Na}_2\text{SeO}_3$ vào môi trường nuôi cấy ở các dải nồng độ 10, 20, 30, 40, 50, 60 $\mu\text{g}$/ml. Sau thời gian nuôi cấy, thu sinh khối bằng cách ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút ở 30°C.
    • Quy trình rửa loại bỏ Selen tự do: Rửa sinh khối nấm men 8 lần liên tiếp bằng nước cất vô trùng nhằm loại bỏ hoàn toàn lượng Selen vô cơ bám ngoài màng tế bào; kiểm tra nước rửa lần cuối cho đến khi không còn vết Selen mới tiến hành phân tích cắn sinh khối.
    • Phương pháp đếm tế bào sống (CFU): Pha loãng mẫu dịch men hoặc cắn men đông khô theo phương pháp pha loãng thập phân, cấy trải $100,\mu\text{l}$ lên đĩa thạch Sabouraud, ủ ở 30°C trong 48 giờ.
    • Phương pháp định lượng Selen (Chuẩn độ Iod - Thiosulfate): Vô cơ hóa 0,1 g mẫu sinh khối bằng 5 ml $\text{HNO}_3$ đậm đặc trên nồi cách thủy trong 1 giờ. Pha loãng thành 20 ml, bổ sung tiếp 20 ml nước cất và 2 g ure để khử các hợp chất oxit nitơ, đun sôi. Làm nguội, thêm 3,5 ml dung dịch $\text{KI}$ 10% để phản ứng oxy hóa giải phóng iod tự do ($\text{I}_2$). Chuẩn độ lượng iod sinh ra bằng dung dịch chuẩn natri thiosulfat ($\text{Na}_2\text{S}_2\text{O}_3$ 0,01 M) với chỉ thị hồ tinh bột 1% (1 ml dung dịch $\text{Na}_2\text{S}_2\text{O}_3$ 0,01 M tương đương với 1,974 mg Selen trong 1 g mẫu). Các thí nghiệm đều được bố trí song song với mẫu trắng và lặp lại 3 lần lấy giá trị trung bình.

Nội dung chính theo từng chương

Phần 1: Mở đầu

Trình bày tính cấp thiết của việc nghiên cứu chuyển hóa Selen vô cơ độc hại thành dạng Selen hữu cơ an toàn qua sinh khối nấm men. Đưa ra hai mục tiêu nghiên cứu cốt lõi: tối ưu hóa quy trình thu sinh khối và đánh giá hiệu suất hấp thu Selen của Saccharomyces cerevisiae và Saccharomyces boulardii.

Phần 2: Tổng quan

Cung cấp bức tranh toàn diện về lý thuyết thực phẩm chức năng, các tiêu chuẩn và cơ chế tác dụng miễn dịch, kháng viêm của probiotic đường ruột. Phân tích chi tiết vai trò sinh học của Selen, liên hệ với hội chứng đột tử trẻ sơ sinh (SIDS), bệnh cơ trắng ở động vật, bệnh Keshan và khả năng giảm 34% nguy cơ ung thư ruột kết. Đánh giá đặc tính sinh học của hai loài nấm men và tổng hợp danh mục các chế phẩm dược phẩm thương mại chứa nấm men:

Tên chế phẩm Dạng bào chế Thành phần hoạt chất chính
ACTISOUFRE Huyền dịch uống/rửa mũi Natri sulfid monohydrat, Saccharomyces cerevisiae
SOLACY ADULTE Viên nang L-cystin, Lưu huỳnh, Retinol acetat, S. cerevisiae
SPASMAG Dung dịch uống Magnesi sulfat trihydrat, Saccharomyces cerevisiae
BIOFLOR Bột đông khô pha uống Saccharomyces boulardii đông khô
ULTRA-LEVURE Viên nang Saccharomyces boulardii đông khô
KEROMAX Viên nhộng Men khô giàu Selen

Phần 3: Phương pháp nghiên cứu

Chi tiết hóa danh mục thiết bị, hóa chất tinh khiết và công thức các loại môi trường thạch, canh thang Sabouraud, môi trường đông khô sữa. Mô tả quy trình phân lập vi sinh vật bằng kháng sinh Kanamycin (5 $\mu\text{g}$/ml), kỹ thuật ly tâm tách tế bào (4000 rpm, 15 phút), quy trình rửa 8 lần loại Selen tự do, công thức tính mật độ tế bào (CFU/ml) đối với dịch nuôi cấy và bột đông khô, cùng nguyên lý phản ứng oxy hóa - khử trong định lượng Selen bằng phương pháp chuẩn độ Iod - Thiosulfate.

Phần 4: Kết quả thực nghiệm

Báo cáo toàn bộ số liệu thực nghiệm qua các bảng so sánh và biểu đồ về động thái sinh trưởng, ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng (glucose, pepton), pH, thời gian lên men, tác động ức chế sinh trưởng của $\text{Na}_2\text{SeO}_3$, và hàm lượng Selen tích lũy trong sinh khối theo nồng độ cũng như thời gian.

Phần 5: Kết luận và đề nghị

Đánh giá tổng kết các thông số kỹ thuật đã đạt được trong quy trình nuôi cấy nấm men làm giàu Selen và đưa ra các kiến nghị nghiên cứu tiếp theo về dạng liên kết hóa học của Selen trong tế bào.

Kết quả và đóng góp

1. Kết quả khảo sát các điều kiện nuôi cấy thu sinh khối

  • So sánh phương pháp nuôi cấy rắn và lỏng: Mặc dù nuôi cấy rắn thuận tiện cho việc thu hoạch cạo sinh khối, nuôi cấy lỏng lắc mang lại hiệu suất tế bào cao gần gấp đôi trên cả hai chủng nấm men sau 48 giờ.
Phương pháp nuôi cấy S. boulardii ($\times 10^8$ CFU/ml) S. cerevisiae ($\times 10^8$ CFU/ml)
Môi trường rắn 2,61 2,53
Môi trường lỏng (canh thang) 4,60 5,00

  • Khảo sát nồng độ Glucose: Mật độ tế bào tăng nhanh khi tăng nồng độ glucose từ 5 g/l lên 20 g/l. Ở nồng độ trên 20 g/l (30 - 40 g/l), mật độ tế bào không tăng thêm mà có xu hướng giảm nhẹ do hiệu ứng Crabtree (tế bào chuyển dịch sang cơ chế lên men tạo cồn thay vì hô hấp hiếu khí tạo sinh khối). Do đó, nồng độ glucose 20 g/l được lựa chọn để tối ưu chi phí và hiệu suất.

    • Glucose 5 g/l: S. bou = $1,63 \times 10^8$; S. cere = $1,30 \times 10^8$ CFU/ml.
    • Glucose 10 g/l: S. bou = $2,07 \times 10^8$; S. cere = $2,40 \times 10^8$ CFU/ml.
    • Glucose 20 g/l: S. bou = $4,57 \times 10^8$; S. cere = $5,56 \times 10^8$ CFU/ml.
    • Glucose 30 g/l: S. bou = $4,57 \times 10^8$; S. cere = $5,60 \times 10^8$ CFU/ml.
    • Glucose 40 g/l: S. bou = $4,53 \times 10^8$; S. cere = $5,30 \times 10^8$ CFU/ml.

  • Khảo sát nồng độ Pepton: Tăng nồng độ pepton từ 5 g/l lên 10 g/l làm tăng mạnh sinh khối, nhưng khi tăng tiếp lên 20 g/l và 40 g/l thì lượng sinh khối tăng không đáng kể. Vì pepton chiếm tỷ trọng chi phí cao trong môi trường, mức 10 g/l là tối ưu.

    • Pepton 5 g/l: S. bou = $2,13 \times 10^8$; S. cere = $2,20 \times 10^8$ CFU/ml.
    • Pepton 10 g/l: S. bou = $4,60 \times 10^8$; S. cere = $5,63 \times 10^8$ CFU/ml.
    • Pepton 20 g/l: S. bou = $4,57 \times 10^8$; S. cere = $5,77 \times 10^8$ CFU/ml.
    • Pepton 40 g/l: S. bou = $4,73 \times 10^8$; S. cere = $5,83 \times 10^8$ CFU/ml.

  • Khảo sát pH môi trường: Hiệu suất thu nhận tế bào đạt giá trị cực đại tại pH 5,0 ở cả hai loài.

    • pH 4,5: S. bou = $4,13 \times 10^8$; S. cere = $4,20 \times 10^8$ CFU/ml.
    • pH 5,0: S. bou = $5,60 \times 10^8$; S. cere = $5,83 \times 10^8$ CFU/ml.
    • pH 5,5: S. bou = $4,00 \times 10^8$; S. cere = $4,00 \times 10^8$ CFU/ml.
    • pH 6,0: S. bou = $3,43 \times 10^8$; S. cere = $3,00 \times 10^8$ CFU/ml.

  • Khảo sát thời gian nuôi cấy: Sinh khối nấm men tăng trưởng mạnh trong 48 giờ đầu và đạt đỉnh, sau 72 giờ lượng tế bào có dấu hiệu chững lại và suy giảm nhẹ.

    • 24 giờ: S. bou = $1,03 \times 10^8$; S. cere = $1,13 \times 10^8$ CFU/ml.
    • 36 giờ: S. bou = $2,33 \times 10^8$; S. cere = $2,00 \times 10^8$ CFU/ml.
    • 48 giờ: S. bou = $5,56 \times 10^8$; S. cere = $5,87 \times 10^8$ CFU/ml.
    • 72 giờ: S. bou = $5,43 \times 10^8$; S. cere = $5,46 \times 10^8$ CFU/ml.

2. Tác động của muối Selen ($\text{Na}_2\text{SeO}_3$) lên sức sống nấm men

Việc bổ sung Selen vô cơ vào môi trường gây ức chế sinh trưởng rõ rệt:

  • Ở nồng độ $\text{Na}_2\text{SeO}_3$ từ 10 - 30 $\mu\text{g}$/ml: Số lượng tế bào sống giảm khoảng 3 lần so với đối chứng (tỷ lệ sống sót đạt 27,94% - 31,30% đối với S. cerevisiae; 29,25% - 33,31% đối với S. boulardii).
  • Ở nồng độ $\text{Na}_2\text{SeO}_3$ từ 40 - 50 $\mu\text{g}$/ml: Số lượng tế bào giảm mạnh tới 5 lần (tỷ lệ sống sót còn 20,82% - 20,96% đối với S. cerevisiae; 19,63% - 23,45% đối với S. boulardii).

3. Kết quả tích lũy Selen trong sinh khối nấm men

  • Ở nồng độ $\text{Na}_2\text{SeO}_3 \le 10,\mu\text{g}$/ml, nấm men không hấp thu hoặc lượng hấp thu nằm dưới ngưỡng định lượng (0 $\mu\text{g}$/g). Mẫu đối chứng không bổ sung Selen cũng cho kết quả Selen trong sinh khối bằng 0.
  • Khả năng tích lũy Selen ($\mu\text{g}$ Se/g sinh khối ướt) tăng tỷ lệ thuận theo nồng độ $\text{Na}_2\text{SeO}_3$ và thời gian nuôi cấy:
Nồng độ $\text{Na}_2\text{SeO}_3$ ($\mu\text{g}$/ml) S. cerevisiae (1 ngày) S. cerevisiae (2 ngày) S. cerevisiae (3 ngày) S. boulardii (1 ngày) S. boulardii (2 ngày) S. boulardii (3 ngày)
10 0 0 0 0 0 0
20 394,80 394,80 444,15 493,50 444,15 394,80
30 444,15 789,60 641,55 542,85 690,90 789,60
40 740,25 987,00 888,30 641,55 987,00 1283,10
50 1184,40 1184,40 1974,00 1135,05 1184,40 1283,10
60 1283,10 1184,40 1825,95 1085,70 1401,54 2270,10
  • Hàm lượng hấp thu Selen đạt cực đại ở ngày thứ 3:
    • Saccharomyces cerevisiae đạt 1974,00 $\mu\text{g}$/g sinh khối ướt tại nồng độ bổ sung 50 $\mu\text{g}$/ml $\text{Na}_2\text{SeO}_3$.
    • Saccharomyces boulardii đạt 2270,10 $\mu\text{g}$/g sinh khối ướt tại nồng độ bổ sung 60 $\mu\text{g}$/ml $\text{Na}_2\text{SeO}_3$.
  • Khi khảo sát riêng ảnh hưởng của lượng đường glucose (20 g/l) trong môi trường Sabouraud nuôi cấy 2 ngày với S. cerevisiae, lượng Selen tích lũy tăng dần từ 394,8 $\mu\text{g}$/g (ở mức 20 $\mu\text{g}$/ml $\text{Na}_2\text{SeO}_3$) lên 789,6 $\mu\text{g}$/g (30 $\mu\text{g}$/ml), 888,3 $\mu\text{g}$/g (40 $\mu\text{g}$/ml), 1085,7 $\mu\text{g}$/g (50 $\mu\text{g}$/ml) và đạt 1579,2 $\mu\text{g}$/g (60 $\mu\text{g}$/ml).

Đóng góp thực tiễn

Khóa luận đã thiết lập được quy trình công nghệ lên men lỏng ở quy mô phòng thí nghiệm có khả năng sản xuất sinh khối nấm men giàu Selen hữu cơ từ nguyên liệu men rượu và chủng men vi sinh y tế. Công trình chứng minh tính khả thi của việc sử dụng hai chủng men an toàn S. cerevisiae và S. boulardii để tích lũy hàm lượng cao Selen sinh học, mở ra hướng ứng dụng sản xuất các chế phẩm bổ sung dinh dưỡng và dược phẩm probiotic nội địa.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế

  • Nghiên cứu mới dừng lại ở việc định lượng tổng hàm lượng Selen tích lũy trong sinh khối nấm men ướt bằng phương pháp chuẩn độ hóa học oxy hóa - khử, chưa định danh và phân tích định lượng tỷ lệ cụ thể của các hợp chất Selen hữu cơ chuyên biệt (như selenomethionine, selenocysteine) trong tế bào.
  • Quy mô nghiên cứu giới hạn ở bình lắc phòng thí nghiệm (thể tích 100 ml), chưa thực hiện trên hệ thống thiết bị lên men sinh học (bioreactor) có kiểm soát oxy hòa tan chủ động.
  • Chưa tiến hành các đánh giá in vivo về độc tính bán trường diễn cũng như khả năng hấp thu thực tế của chế phẩm men Selen đông khô trên mô hình động vật thí nghiệm.

Hướng nghiên cứu tiếp

  • Tác giả đề nghị tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về dạng liên kết hữu cơ của Selen tích lũy bên trong tế bào nấm men nhằm chứng minh tỷ lệ chuyển hóa Selen vô cơ thành Selen hữu cơ an toàn.
  • Hoàn thiện và nâng cấp quy trình công nghệ đông khô sinh khối nấm men quy mô lớn nhằm tối ưu hóa độ sống sót của tế bào và độ ổn định của hàm lượng Selen trong thời gian bảo quản kéo dài.

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo chuyên môn đối với:

  • Sinh viên và học viên chuyên ngành: Công nghệ Sinh học, Vi sinh học ứng dụng, Công nghệ Thực phẩm và Dược học (đặc biệt là hướng nghiên cứu công nghệ vi sinh y dược và phát triển thực phẩm chức năng).
  • Phần nội dung đáng tham khảo:
    • Quy trình phân lập chọn lọc nấm men từ men rượu bằng môi trường thạch bổ sung Kanamycin ($5,\mu\text{g}$/ml).
    • Bộ số liệu thực nghiệm tối ưu hóa 4 yếu tố môi trường nuôi cấy (đường, pepton, pH, thời gian) và ngưỡng nồng độ chịu đựng muối $\text{Na}_2\text{SeO}_3$ của hai loài nấm men.
    • Quy trình xử lý mẫu vô cơ hóa bằng $\text{HNO}_3$ đậm đặc kết hợp chuẩn độ Iod - Thiosulfate để định lượng Selen trong mẫu sinh khối sinh học.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao nuôi cấy môi trường lỏng được lựa chọn thay vì môi trường thạch rắn trong nghiên cứu này?

Theo kết quả thực nghiệm sau 48 giờ nuôi cấy, môi trường Sabouraud lỏng lắc hiếu khí cho hiệu suất thu sinh khối tế bào đạt $4,60 \times 10^8$ CFU/ml (với S. boulardii) và $5,00 \times 10^8$ CFU/ml (với S. cerevisiae), cao gần gấp đôi so với nuôi cấy trên thạch rắn ($2,61 \times 10^8$ CFU/ml và $2,53 \times 10^8$ CFU/ml). Nuôi cấy lỏng giúp tế bào tiếp xúc đồng đều với oxy và chất dinh dưỡng, tạo điều kiện thuận lợi cho việc bổ sung muối vi lượng và thu hồi sinh khối bằng ly tâm.

2. Nồng độ glucose tối ưu cho quá trình thu sinh khối là bao nhiêu và vì sao không tăng nồng độ lên 30 - 40 g/l?

Nồng độ glucose tối ưu được xác định là 20 g/l (đạt $4,57 \times 10^8$ CFU/ml với S. bou và $5,56 \times 10^8$ CFU/ml với S. cere). Khi tăng nồng độ glucose lên 30 g/l hoặc 40 g/l, số lượng tế bào không tăng thêm mà có xu hướng giảm nhẹ do hiệu ứng Crabtree: ở nồng độ đường cao, nấm men có xu hướng chuyển từ hô hấp hiếu khí sang lên men tạo cồn, làm giảm hiệu suất sinh khối và gây lãng phí cơ chất.

3. Độc tính của muối Selen vô cơ ($\text{Na}_2\text{SeO}_3$) ảnh hưởng như thế nào đến tỷ lệ sống sót của tế bào nấm men?

Muối $\text{Na}_2\text{SeO}_3$ thể hiện tính độc ức chế sinh trưởng mạnh đối với cả hai loài:

  • Ở nồng độ 10 - 30 $\mu\text{g}$/ml: Mật độ tế bào nấm men sống giảm khoảng 3 lần so với mẫu đối chứng không bổ sung Selen (tỷ lệ sống sót dao động trong khoảng 27,94% - 33,31%).
  • Ở nồng độ 40 - 50 $\mu\text{g}$/ml: Mật độ tế bào sống giảm mạnh tới 5 lần (tỷ lệ sống sót chỉ còn 19,63% - 23,45%).

4. Khả năng hấp thu Selen đạt giá trị cực đại ở điều kiện nào đối với từng loài nấm men?

Hàm lượng Selen tích lũy trong sinh khối nấm men ướt đạt giá trị cao nhất sau 3 ngày nuôi cấy:

  • Saccharomyces cerevisiae đạt cực đại 1974,00 $\mu\text{g}$ Selen/g sinh khối ướt tại nồng độ bổ sung 50 $\mu\text{g}$/ml $\text{Na}_2\text{SeO}_3$.
  • Saccharomyces boulardii đạt cực đại 2270,10 $\mu\text{g}$ Selen/g sinh khối ướt tại nồng độ bổ sung 60 $\mu\text{g}$/ml $\text{Na}_2\text{SeO}_3$.
  • Ở nồng độ $\text{Na}_2\text{SeO}_3 \le 10,\mu\text{g}$/ml hoặc mẫu không bổ sung Selen, hàm lượng Selen trong sinh khối không đo được (bằng 0).

5. Quy trình rửa sinh khối và nguyên tắc định lượng Selen được thực hiện như thế nào?

Để loại bỏ triệt để Selen vô cơ tự do bám trên bề mặt tế bào, sinh khối sau ly tâm được rửa 8 lần bằng nước cất vô trùng cho đến khi nước rửa cuối cùng có hàm lượng Selen bằng 0. Mẫu sau đó được vô cơ hóa bằng $\text{HNO}_3$ đậm đặc trên nồi cách thủy trong 1 giờ, thêm ure đun sôi để khử oxit nitơ, sau đó bổ sung dung dịch $\text{KI}$ 10% để giải phóng iod ($\text{I}_2$). Lượng iod sinh ra được chuẩn độ trực tiếp bằng dung dịch $\text{Na}_2\text{S}_2\text{O}_3$ 0,01 M với chỉ thị hồ tinh bột 1% (1 ml $\text{Na}_2\text{S}_2\text{O}_3$ 0,01 M tương đương 1,974 mg Selen trong 1 g mẫu).

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp đã hoàn thành toàn diện việc khảo sát và xác lập các thông số môi trường tối ưu cho nuôi cấy lỏng thu sinh khối nấm men Saccharomyces (glucose 20 g/l, pepton 10 g/l, pH 5,0, thời gian 48 giờ ở 30°C với tốc độ lắc 200 vòng/phút). Công trình đã chứng minh cả hai chủng Saccharomyces cerevisiae và Saccharomyces boulardii đều có khả năng chịu đựng và tích lũy hàm lượng lớn Selen vô cơ từ môi trường vào sinh khối tế bào (đạt lần lượt 1974,00 $\mu\text{g}$/g và 2270,10 $\mu\text{g}$/g sinh khối ướt sau 3 ngày lên men). Kết quả thực nghiệm này tạo tiền đề khoa học và kỹ thuật quan trọng cho việc sản xuất các chế phẩm probiotic làm giàu Selen hữu cơ phục vụ lĩnh vực y dược và thực phẩm chức năng.