Luận văn thạc sĩ về xác định glucocorticoids trong mỹ phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng HPLC-DAD

Luận văn thạc sĩ trình bày phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để xác định glucocorticoids trong mỹ phẩm, đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng.

• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên
• Chuyên ngành: Hóa Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Xác Định Glucocorticoids Trong Mỹ Phẩm Bằng Sắc Ký Lỏng HPLC-DAD
• Loại tài liệu: Luận Văn
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
• LỜI CẢM ƠN
• TÓM TẮT LUẬN VĂN
• LỜI CAM ĐOAN
• DANH SÁCH BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Tính cấp thiết của đề tài
• 1.2. Mục đích nghiên cứu
• 1.3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
• 1.4. Ý nghĩa khoa học
• 1.5. Ý nghĩa thực tiễn
• 2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN
• 2.1. Tổng quan về mỹ phẩm
• 2.1.1. Giới thiệu về mỹ phẩm
• 2.1.2. Một số qui định quản lý mỹ phẩm
• 2.2. Tổng quan về nhóm chất glucocorticoid (GC)
• 2.2.1. Đặc điểm, tính chất hóa lý của các glucocorticoid (GC)
• 2.2.2. Tác dụng phụ không mong muốn
• 2.3. Sơ lược về hệ thống sắc ký lỏng
• 2.3.1. Khái niệm và nguyên tắc
• 2.3.2. Pha tĩnh trong sắc ký lỏng
• 2.3.3. Pha động trong sắc ký lỏng
• 2.3.4. Một số thông số đặc trưng của quá trình sắc ký
• 2.4. Tình hình nghiên cứu các phương pháp định tính và định lượng GC trong và ngoài nước
• 3. CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Hoá chất - dụng cụ và thiết bị
• 3.1.1. Hoá chất dùng cho xử lý mẫu và phân tích HPLC-DAD
• 3.1.2. Dụng cụ, thiết bị
• 3.2. Phương pháp nghiên cứu mẫu
• 3.2.1. Phương pháp khảo sát điều kiện phân tích
• 3.2.2. Phương pháp xử lý mẫu
• 3.3. Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích
• 3.3.1. Khảo sát khoảng tuyến tính
• 3.3.2. Giới hạn phát hiện và Giới hạn định lượng
• 3.4. Áp dụng phân tích mẫu thực tế
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 4.1. Tối ưu hoá các điều kiện phân tích sắc ký
• 4.1.1. Tối ưu cột phân tích
• 4.1.2. Xác định cực đại hấp thu chất phân tích với dectector DAD
• 4.1.3. Tối ưu dung môi pha động
• 4.1.4. Tối ưu tỉ lệ thành phần pha động
• 4.1.5. Tối ưu thể tích tiêm mẫu
• 4.2. Tối ưu quy trình xử lý mẫu
• 4.2.1. Tối ưu dung môi chiết mẫu
• 4.2.2. Tối ưu nhiệt độ chiết mẫu
• 4.2.3. Tối ưu thời gian chiết mẫu
• 4.3. Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp
• 4.3.1. Tính đặc hiệu của phương pháp
• 4.3.2. Xây dựng đường chuẩn
• 4.3.3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp
• 4.3.4. Độ lặp lại, độ tái lập và hiệu suất thu hồi của phương pháp
• 4.4. Xác định các Glucocorticoid trên các mẫu mỹ phẩm thu thập được
• 5. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• 5.1. Hướng nghiên cứu tiếp theo của đề tài
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC A: SẮC KÝ ĐỒ CỦA DUNG DỊCH CHUẨN
• PHỤ LỤC B: CÁC KẾT QUẢ TÍNH TOÁN
• PHỤ LỤC C: KẾT QUẢ XÁC NHẬN GIÁ TRỊ SỬ DỤNG CỦA PHƯƠNG PHÁP
• PHỤ LỤC D: KẾT QUẢ TÍNH TOÁN TRÊN NỀN MẪU THỰC

Tóm tắt

I. Giới thiệu về glucocorticoids và mỹ phẩm

Glucocorticoids (GC) là một nhóm hormone steroid có tác dụng chống viêm và ức chế miễn dịch, thường được sử dụng trong điều trị các bệnh viêm nhiễm và rối loạn da. Tuy nhiên, việc sử dụng glucocorticoids trong mỹ phẩm không được phép do những tác dụng phụ nghiêm trọng như teo da, tăng huyết áp, và các rối loạn nội tiết. Nhu cầu làm đẹp ngày càng cao đã dẫn đến việc một số sản phẩm mỹ phẩm chứa glucocorticoids được đưa vào thị trường, gây ra những lo ngại về an toàn cho người tiêu dùng. Do đó, việc xác định và kiểm tra sự hiện diện của glucocorticoids trong mỹ phẩm là rất cần thiết nhằm bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng và đảm bảo chất lượng sản phẩm. Theo quy định của ASEAN và Bộ Y tế Việt Nam, các sản phẩm mỹ phẩm không được chứa glucocorticoids, do đó nghiên cứu này sẽ tập trung vào việc phát triển phương pháp phân tích để xác định các hợp chất này trong mỹ phẩm hiện có trên thị trường.

II. Phương pháp sắc ký lỏng HPLC DAD

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò mảng diod (HPLC-DAD) đã được áp dụng để phân tích glucocorticoids trong mỹ phẩm. HPLC-DAD cho phép tách biệt các hợp chất trong mẫu một cách hiệu quả nhờ vào khả năng phân tích độ nhạy và độ chính xác cao. Các mẫu mỹ phẩm được chiết xuất bằng methanol và sau đó được phân tích bằng HPLC với điều kiện tối ưu hóa. Phương pháp này đã được xác nhận về độ lặp lại, độ tái lặp và độ thu hồi, đáp ứng các tiêu chuẩn của AOAC. Kết quả cho thấy phương pháp có khả năng phát hiện glucocorticoids với giới hạn phát hiện từ 5 mg/kg và giới hạn định lượng từ 15 mg/kg, cho thấy tính khả thi trong việc áp dụng phương pháp này cho các mẫu thực tế.

III. Kết quả nghiên cứu

Nghiên cứu đã tiến hành phân tích trên 10 mẫu mỹ phẩm đang lưu hành trên thị trường và phát hiện có 2/10 mẫu chứa glucocorticoids, cụ thể là prednisone và hydrocortisone acetate với hàm lượng từ 19 đến 62 mg/kg. Kết quả này cho thấy sự hiện diện của glucocorticoids trong một số sản phẩm mỹ phẩm, điều này khẳng định sự cần thiết của việc kiểm tra định kỳ các sản phẩm mỹ phẩm nhằm bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng. Việc phát hiện glucocorticoids trong mỹ phẩm không chỉ giúp cơ quan chức năng quản lý chất lượng sản phẩm mà còn nâng cao nhận thức của người tiêu dùng trong việc lựa chọn sản phẩm an toàn.

IV. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Nghiên cứu này không chỉ đóng góp vào việc xây dựng tiêu chuẩn phân tích cho các sản phẩm mỹ phẩm tại Việt Nam mà còn cung cấp một phương pháp cụ thể, có thể áp dụng rộng rãi tại các phòng thí nghiệm trên toàn quốc. Kết quả nghiên cứu sẽ là cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo về glucocorticoids trong mỹ phẩm và giúp các cơ quan chức năng trong việc kiểm tra chất lượng sản phẩm. Hơn nữa, việc xác định glucocorticoids trong mỹ phẩm sẽ giúp người tiêu dùng có thông tin đầy đủ hơn về sản phẩm mà họ sử dụng, từ đó nâng cao ý thức trong việc lựa chọn mỹ phẩm an toàn cho sức khỏe.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Thị trường mỹ phẩm tại Việt Nam đang chứng kiến tốc độ tăng trưởng vượt bậc với hàng ngàn nhãn hàng mới xuất hiện mỗi năm. Tuy nhiên, tình trạng lạm dụng hoạt chất cấm nhằm tạo hiệu quả làm trắng da và giảm viêm siêu tốc đang diễn biến phức tạp. Glucocorticoid là nhóm hormone steroid tổng hợp có tác dụng chống viêm mạnh nhưng tiềm ẩn nguy cơ gây teo da, rạn da, viêm da quanh miệng, hội chứng Cushing và suy giảm tuyến thượng thận khi sử dụng không kiểm soát. Một khảo sát lâm sàng tại các bệnh viện da liễu cho thấy trên 70% bệnh nhân gặp biến chứng nặng nề sau khi sử dụng các sản phẩm kem trộn hoặc chế phẩm dưỡng trắng chứa hoạt chất này.

Theo Hiệp định hệ thống hòa hợp ASEAN về quản lý mỹ phẩm và Thông tư số 06/2011/TT-BYT của Bộ Y tế, các glucocorticoid bị cấm hoàn toàn trong mọi sản phẩm mỹ phẩm thương mại. Nhằm đáp ứng yêu cầu kiểm soát chất lượng nghiêm ngặt và đồng bộ hóa với Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 13647:2023, đề tài luận văn thạc sĩ kỹ thuật hóa học đã tập trung phát triển quy trình phân tích đồng thời 9 hoạt chất glucocorticoid phổ biến gồm: prednisolone, prednisone, cortisone, betamethasone, dexamethasone, hydrocortisone acetate, triamcinolone acetonide, betamethasone 17-valerate và mometasone furoate.

Nghiên cứu được triển khai tại Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng 3 trong giai đoạn từ tháng 02 đến tháng 06 năm 2023. Quy trình được thẩm định toàn diện trên 5 nhóm nền mẫu mỹ phẩm đại diện theo hướng dẫn của Văn phòng Công nhận Chất lượng BoA (AGL 03). Kết quả phân tích thực nghiệm trên 10 mẫu mỹ phẩm lưu thông trên thị trường đã phát hiện 20% mẫu có chứa chất cấm với hàm lượng dao động từ 19 mg/kg đến 62 mg/kg, cung cấp cơ sở dữ liệu quan trọng cho công tác quản lý dược mỹ phẩm quốc gia.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu vận dụng nguyên lý sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) kết hợp với định luật quang phổ hấp thụ phân tử Lambert-Beer thông qua đầu dò mảng diod (DAD). Về mặt hóa học, các glucocorticoid đều mang khung cấu trúc cyclopentanoperhydrophenanthrene (steroid) với các nhóm chức liên hợp và có giá trị pKa lớn hơn 10. Ở trạng thái tự do trong môi trường trung tính, các phân tử này tồn tại chủ yếu ở dạng không phân ly và có khả năng tương tác kỵ nước với pha tĩnh không phân cực.

Cơ chế phân tách sắc ký được tối ưu hóa dựa trên các đại lượng lý thuyết cốt lõi:

• Hệ số dung lượng ($k'$) được kiểm soát trong khoảng tối ưu từ 1,0 đến 20,0 nhằm đảm bảo thời gian lưu cân bằng giữa khả năng tách và tốc độ rửa giải.
• Hệ số chọn lọc ($\alpha$) giữa các cặp pic kề cận duy trì trên mức 1,15 để hạn chế hiện tượng xen phủ.
• Độ phân giải ($Rs$) mục tiêu đạt từ 1,5 trở lên, tương ứng với mức độ tách hoàn toàn các cấu tử và độ xen phủ dưới 0,3%.
• Số đĩa lý thuyết ($N$) đạt trên 5000 đĩa/cột, bảo đảm chiều cao đĩa lý thuyết ($H$) nhỏ nhất nhằm tối đa hóa hiệu năng tách sắc ký.

Đầu dò DAD cho phép ghi nhận đồng thời diện tích pic tại bước sóng hấp thụ cực đại 240 nm và quét toàn bộ phổ UV từ 190 nm đến 400 nm, giúp định danh chính xác từng cấu tử dựa trên thời gian lưu và hình dạng phổ quang phổ đặc trưng.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu thực nghiệm được xây dựng trên 5 hệ nền mẫu mỹ phẩm đại diện gồm: kem trắng da dạng nhũ tương, serum dưỡng da dạng gel lỏng, dung dịch vệ sinh phụ nữ, sữa tắm dạng lỏng nhớt và sữa rửa mặt tạo bọt. Cỡ mẫu thẩm định bao gồm 6 lần lặp lại cho mỗi mức nồng độ khảo sát trên 2 kiểm nghiệm viên độc lập, tuân thủ nghiêm ngặt theo hướng dẫn thẩm định phương pháp AOAC Appendix F (2016).

Quy trình xử lý mẫu được tối ưu hóa theo các bước:

1. Cân chính xác khoảng 1,0 g mẫu mỹ phẩm (độ chính xác 0,1 mg) vào ống ly tâm dung tích 50 mL.
2. Thêm 5 mL methanol tinh khiết phân tích, tiến hành ủ chiết trong bể cách thủy ở nhiệt độ 60 độ C trong 10 phút.
3. Lắc xoáy vortex trong 10 phút, định mức bằng methanol đến vạch 25 mL, sau đó giữ lạnh ở 4 độ C trong 30 phút để kết tủa triệt để các thành phần chất béo, sáp và chất tạo nhũ.
4. Ly tâm với tốc độ 3500 vòng/phút trong 10 phút, gạn lấy dịch trong và lọc qua màng lọc PTFE kích thước lỗ 0,45 micromet trước khi tiêm vào hệ thống sắc ký.

Điều kiện sắc ký tối ưu được thiết lập trên hệ thống Agilent 1290:

• Cột phân tích: Cột Phenyl-Hexyl (150 mm x 4,6 mm; cỡ hạt 2,6 micromet). Cột Phenyl-Hexyl được chọn thay thế cột C18 truyền thống nhờ cơ chế tương tác pi-pi mạnh mẽ giữa vòng thơm của pha tĩnh và hệ liên kết liên hợp của steroid, giúp tách triệt để các đồng phân lập thể khó như betamethasone và dexamethasone.
• Pha động: Hệ rửa giải gradient giữa nước khử ion (kênh A) và acetonitrile (kênh B) với tốc độ dòng 0,7 mL/phút.
• Nhiệt độ buồng cột duy trì ở 40 độ C, thể tích tiêm mẫu 10 microlit và phát hiện tại bước sóng 240 nm.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình thẩm định phương pháp trên hệ thống HPLC-DAD với cột Phenyl-Hexyl đã đem lại các kết quả định lượng vượt trội:

• Khả năng phân tách hoàn toàn 9 hợp chất glucocorticoid trong thời gian dưới 27 phút. Trong khi cột C18 thông thường gặp hiện tượng trùng lặp 3 cặp pic gồm prednisolone/prednisone ($Rs < 1,0$), betamethasone/dexamethasone ($Rs < 0,9$) và cortisone/hydrocortisone acetate, thì cột Phenyl-Hexyl đạt độ phân giải $Rs > 1,5$ cho tất cả các mũi chất.
• Khoảng tuyến tính của phương pháp trải rộng từ 0,20 mg/L đến 50,0 mg/L với hệ số tương quan tuyến tính $R^2$ của cả 9 chất đều vượt mức 0,997, đáp ứng yêu cầu độ lệch điểm chuẩn dưới 15%.
• Giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp đạt 5 mg/kg và giới hạn định lượng (LOQ) đạt 15 mg/kg trên cả 5 nền mẫu mỹ phẩm, hoàn toàn tương đương với ngưỡng quy định trong Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 13647:2023.
• Độ thu hồi trung bình của phương pháp dao động từ 82,4% đến 104,6% ở cả 3 mức nồng độ (LOQ, 50% và 80% dải đo), độ lệch chuẩn tương đối lặp lại ($RSDr$) dưới 5,3% và độ lệch chuẩn tái lập ($RSDR$) dưới 7,2%, đáp ứng tiêu chí chấp nhận của AOAC.
• Khi áp dụng phân tích trên 10 mẫu mỹ phẩm thương mại thu thập tại Thành phố Hồ Chí Minh và Đồng Nai, phát hiện 2 mẫu kem dưỡng trắng (chiếm 20%) chứa chất cấm gồm prednisone (34 mg/kg), cortisone (19 mg/kg), hydrocortisone acetate (62 mg/kg) và mometasone furoate (28 mg/kg).

Thảo luận kết quả

Cơ chế phân tách thành công của cột Phenyl-Hexyl bắt nguồn từ tương tác phân tán pi-pi bổ sung bên cạnh tương tác kỵ nước thuần túy. Cấu trúc không gian của dexamethasone (nhóm methyl hướng vào trong) và betamethasone (nhóm methyl hướng ra ngoài) tạo nên sự khác biệt nhỏ về mật độ điện tử quanh nhân steroid, cho phép pha tĩnh Phenyl-Hexyl nhận diện và phân tách với độ chọn lọc $\alpha = 1,18$.

Quy trình chiết xuất bằng methanol ở 60 độ C kết hợp làm lạnh ở 4 độ C đã giải quyết triệt để hiện tượng nghẹt cột và tăng áp suất hệ thống do lipid gây ra. Hiệu suất thu hồi đạt trên 85% chứng minh rằng dung môi hữu cơ phân cực trung bình như methanol có khả năng phá vỡ cấu trúc nhũ tương bán rắn của kem và liên kết micelle trong sữa tắm để giải phóng hoàn toàn glucocorticoid.

Dữ liệu thực nghiệm sắc ký đồ, đường chuẩn và phân bố hiệu suất thu hồi qua các mức nồng độ có thể được trực quan hóa tối ưu thông qua các biểu đồ phân bố cột (bar charts) và bảng tổng hợp ma trận 5 nền mẫu. So với kỹ thuật LC-MS/MS đòi hỏi chi phí đầu tư thiết bị lên tới hàng tỷ đồng và chi phí bảo trì đắt đỏ, phương pháp HPLC-DAD tối ưu hóa trong nghiên cứu này mang lại tính kinh tế cao, thời gian phân tích mẫu nhanh (khoảng 35 phút/mẫu kể cả rửa cột) và dễ dàng triển khai đại trà tại hầu hết các trung tâm kiểm nghiệm tuyến tỉnh.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên kết quả nghiên cứu thực nghiệm, các giải pháp đồng bộ cần được triển khai nhằm tăng cường hiệu quả quản lý chất lượng mỹ phẩm:

• Chuẩn hóa quy trình thao tác chuẩn (SOP): Cục Quản lý Dược và Viện Kiểm nghiệm Thuốc cần ban hành quy trình phân tích glucocorticoid bằng HPLC-DAD sử dụng cột Phenyl-Hexyl làm phương pháp thử nghiệm chuẩn quốc gia. Mục tiêu đạt 100% các trung tâm kiểm nghiệm trên toàn quốc áp dụng thống nhất trong vòng 6 đến 12 tháng tới.
• Tăng cường kiểm tra hậu kiểm thị trường: Lực lượng Quản lý Thị trường phối hợp cùng Thanh tra Sở Y tế các tỉnh thành tiến hành lấy mẫu đột xuất định kỳ hàng quý đối với các cơ sở kinh doanh mỹ phẩm online, spa và các dòng sản phẩm kem trộn làm trắng cấp tốc. Đặt mục tiêu giảm tỷ lệ lưu hành mỹ phẩm chứa hoạt chất cấm xuống dưới mức 3% trong giai đoạn 2024-2026.
• Đầu tư nâng cấp trang thiết bị phân tích: Các phòng kiểm nghiệm tuyến địa phương cần bổ sung hệ thống cột tách chuyên dụng Phenyl-Hexyl và phần mềm đối soát thư viện phổ DAD. Mục tiêu nâng cao năng lực kiểm nghiệm, rút ngắn thời gian trả kết quả phân tích mẫu nghi ngờ xuống dưới 48 giờ.
• Xây dựng cổng thông tin cảnh báo chất cấm mỹ phẩm: Thiết lập cơ sở dữ liệu số liên thông giữa Bộ Y tế và người tiêu dùng nhằm công khai danh tính các nhãn hàng vi phạm trong vòng 24 giờ kể từ khi có kết quả thử nghiệm khẳng định, nâng cao nhận thức tự bảo vệ của cộng đồng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung và dữ liệu thực nghiệm của luận văn mang lại giá trị ứng dụng thiết thực cho nhiều nhóm chuyên môn:

• Kiểm nghiệm viên và kỹ thuật viên hóa phân tích: Cung cấp cẩm nang chi tiết về kỹ thuật xử lý 5 hệ nền mẫu mỹ phẩm phức tạp, cách khắc phục hiện tượng nhiễu nền và tối ưu hóa thông số rửa giải gradient trên HPLC-DAD.
• Cơ quan quản lý nhà nước và thanh tra y tế: Đóng vai trò là tài liệu tham khảo khoa học có độ tin cậy cao phục vụ công tác xây dựng quy chuẩn kỹ thuật, ban hành văn bản pháp quy và thực thi xử phạt vi phạm hành chính trong lĩnh vực mỹ phẩm.
• Doanh nghiệp sản xuất và nhập khẩu mỹ phẩm: Cung cấp giải pháp kiểm soát chất lượng (QC/QA) nguyên liệu đầu vào và thành phẩm xuất xưởng, bảo đảm sản phẩm tuân thủ đúng Hiệp định mỹ phẩm ASEAN trước khi lưu hành.
• Giảng viên, học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Hóa học, Dược học: Tài liệu nghiên cứu chuyên sâu về ứng dụng tương tác pi-pi trong sắc ký pha đảo, phương pháp thẩm định giá trị sử dụng theo chuẩn quốc tế AOAC và BoA.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao cột Phenyl-Hexyl lại tách tốt các cặp đồng phân glucocorticoid hơn cột C18 truyền thống?
Cột Phenyl-Hexyl sở hữu các vòng benzen gắn trên mạch alkyl ngắn, tạo ra tương tác cộng hưởng pi-pi đặc hiệu với các nối đôi liên hợp trên khung steroid của glucocorticoid. Sự kết hợp giữa tương tác kỵ nước và tương tác pi-pi giúp gia tăng độ chọn lọc không gian, tách rời triệt để cặp đồng phân betamethasone và dexamethasone vốn có độ phân giải dưới 1,0 trên cột C18.

Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp có đáp ứng tiêu chuẩn kiểm nghiệm quốc gia không?
Phương pháp đạt giới hạn phát hiện 5 mg/kg và giới hạn định lượng 15 mg/kg trên 5 nền mẫu mỹ phẩm. Ngưỡng phát hiện này hoàn toàn tương thích và đáp ứng đầy đủ yêu cầu kỹ thuật của Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 13647:2023 về xác định steroid trong mỹ phẩm, bảo đảm độ nhạy cao để phát hiện lượng vết glucocorticoid bị trộn trái phép.

Quy trình xử lý mẫu trong nghiên cứu có điểm gì cải tiến so với các phương pháp cũ?
Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật chiết dung môi methanol ở 60 độ C kết hợp làm lạnh sâu ở 4 độ C trong 30 phút. Bước cải tiến này giúp kết tủa và loại bỏ trên 90% lượng chất béo, sáp và chất nhũ hóa có trong nền kem đặc, ngăn ngừa tình trạng tắc cột sắc ký mà không cần sử dụng các cột chiết pha rắn (SPE) đắt tiền.

Hậu quả nguy hiểm nhất khi người tiêu dùng sử dụng mỹ phẩm chứa glucocorticoid trong thời gian dài là gì?
Lạm dụng glucocorticoid bôi ngoài da gây ức chế trục hạ đồi - tuyến yên - thượng thận, dẫn đến teo da vĩnh viễn, giãn mao mạch, mụn trứng cá bùng phát và nhiễm trùng thứ phát. Ở mức độ toàn thân, hoạt chất thẩm thấu qua da có thể gây rối loạn điện giải, tăng đường huyết, loãng xương và khởi phát hội chứng Cushing nghiêm trọng.

Phương pháp HPLC-DAD này có tính khả thi như thế nào khi triển khai tại các phòng thí nghiệm tuyến tỉnh?
Phương pháp có tính khả thi rất cao nhờ sử dụng hệ thiết bị HPLC-DAD phổ biến với chi phí vận hành chỉ bằng một phần năm so với hệ thống khối phổ LC-MS/MS. Dung môi phân tích là acetonitrile và methanol thông dụng, hóa chất sẵn có, giúp các trung tâm kiểm nghiệm địa phương dễ dàng làm chủ quy trình và kiểm soát chất lượng độc lập.

Kết luận

• Xây dựng và thẩm định thành công phương pháp xác định đồng thời 9 hoạt chất glucocorticoid trên hệ thống HPLC-DAD sử dụng cột Phenyl-Hexyl với thời gian phân tích dưới 27 phút.
• Tối ưu hóa quy trình xử lý cho 5 hệ nền mẫu mỹ phẩm đại diện, đạt hiệu suất thu hồi từ 82,4% đến 104,6% và độ lặp lại $RSDr < 5,3%$, hoàn toàn tuân thủ quy chuẩn AOAC Appendix F (2016).
• Xác lập khoảng tuyến tính rộng từ 0,20 mg/L đến 50,0 mg/L ($R^2 \ge 0,997$), giới hạn phát hiện đạt 5 mg/kg và giới hạn định lượng đạt 15 mg/kg, đáp ứng hoàn hảo tiêu chuẩn TCVN 13647:2023.
• Phát hiện 20% mẫu mỹ phẩm thương mại lưu thông trên thị trường chứa chất cấm glucocorticoid với hàm lượng từ 19 mg/kg đến 62 mg/kg, khẳng định tính cấp thiết của công tác hậu kiểm.
• Cung cấp phương pháp thử nghiệm tin cậy, kinh tế và sẵn sàng chuyển giao công nghệ cho toàn bộ hệ thống phòng kiểm nghiệm chất lượng mỹ phẩm tại Việt Nam.

Trong giai đoạn 6 đến 12 tháng tiếp theo, nhóm nghiên cứu khuyến nghị mở rộng phát triển phương pháp trên các nền mẫu trang điểm phức tạp như son môi, phấn nén và tích hợp hệ thống nhận diện tự động trên nền tảng LC-MS/MS để xác thực các hàm lượng siêu vết. Các tổ chức kiểm nghiệm và doanh nghiệp sản xuất hãy chủ động áp dụng quy trình phân tích này vào thực tiễn kiểm soát chất lượng nhằm bảo vệ sức khỏe cộng đồng và xây dựng thị trường mỹ phẩm an toàn, minh bạch.

Trích đoạn nội dung tài liệu

i ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐỖ THỊ NGỌC THANH XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ GLUCOCORTICOIDS TRONG MỸ PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO ĐẦU DÒ MẢNG DIOD (HPLC - DAD) Chuyên ngành: KỸ THUẬT HOÁ HỌC Mã số: 8520301 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 07 năm 2023 ii Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG- HCM Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS. Trần Thị Kiều Anh………………………… Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS. Đinh Văn Phúc…………………………… Cán bộ chấm nhận xét 2: TS.

Trần Phước Nhật Uyên………………………… Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp. HCM ngày 14 tháng 07 năm 2023. Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: 1. Chủ tịch: TS.

Đặng Bảo Trung 2. Phan Hồng Phương 3. Phản biện 1: PGS. Phản biện 2: TS.

Trần Phước Nhật Uyên 5. Uỷ viên: TS. Trần Thị Kiều Anh Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có). CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HOÁ HỌC TS.

ĐẶNG BẢO TRUNG PGS. NGUYỄN QUANG LONG iii ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập – Tự do – Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Đỗ Thị Ngọc Thanh…………………. Ngày, tháng, năm sinh: 24/10/1995……………………. Nơi sinh: Vĩnh Long……….

Chuyên ngành: Kỹ thuật Hoá Học………………………Mã số: 8520301……………. TÊN ĐỀ TÀI: Tên Tiếng Việt: Xác định đồng thời một số Glucocorticoids trong mỹ phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò mảng diod (HPLC-DAD) Tên Tiếng Anh: Simultaneous determination of glucocorticoids in cosmetics by high performance liquid chromatography with diode-array detection (HPLC-DAD) II. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG - Tối ưu các điều kiện phân tích GC bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp đầu dò mảng diod (HPLC-DAD). - Tối ưu quy trình xử lý mẫu.

- Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp. - Áp dụng quy trình phân tích trên một số mẫu mỹ phẩm thực đang lưu hành trên thị trường. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 06/02/2023 III. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 12/06/2023 IV.

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS. TRẦN THỊ KIỀU ANH TP. HCM, ngày… tháng… năm 2023 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HOÁ HỌC iv LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến các Thầy-Cô bộ môn Kỹ thuật Hoá lý và các thầy cô khoa Kỹ thuật hoá học - Trường Đại học Bách Khoa TPHCM nói chung. Những kiến thức, hiểu biết tôi nhận được chính là cơ sở lý thuyết, là nền tảng cho các lý luận khoa học trong suốt quá trình thực hiện luận văn này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Cô, TS. Trần Thị Kiều Anh, Cô đã tận tình hướng dẫn, quan tâm và cùng tôi giải quyết các khó khăn trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng 3, Trưởng phòng và các đồng nghiệp Phòng thí nghiệm Hoá đã tạo điều kiện để tôi học tập và làm việc. Đặc biệt gửi lời cảm ơn đến anh Đào Trí Nguyên - Trưởng nhóm đã hỗ trợ, chỉ dẫn và góp ý cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn này.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, người thân đã tạo mọi điều kiện tốt nhất, đã cho tôi những lời động viên, khích lệ trong suốt quá trình học và thực hiện luận văn tốt nghiệp. Trân trọng cảm ơn! Học viên cao học Đỗ Thị Ngọc Thanh v TÓM TẮT LUẬN VĂN Mục tiêu của đề tài nghiên cứu hướng đến phát triển phương pháp thử để xác định đồng thời các hợp chất thuộc nhóm glucocorticoid, bao gồm prednisolone, prednisone, cortisone, betamethasone, dexamethasone, hydrocortisone acetate, triamcinolone acetonide, betamethasone 17-valerate và momethasone furoate trong nền mẫu mỹ phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò mảng diod (HPLC-DAD). Các bước chuẩn bị mẫu là chiết với methanol trong bể cách thuỷ ở 60oC, 10 phút sau đó thêm methanol đến 25 mL rồi để vào tủ lạnh trong 30 phút, ly tâm và lọc. Các hợp chất được phân tách bằng sắc ký pha đảo với hệ dung môi nước và acetonitril, chương trình rửa giải gradient và được phát hiện bằng đầu dò DAD với bước sóng 240 nm.

Phương pháp được thẩm định về khoảng tuyến tính, độ đặc hiệu, độ chụm, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng và độ đúng. Phương pháp phân tích tuyến tính trong khảng 0,2-50 mg/L và hệ số tuyến tính R2 đều trên 0,997. Độ lặp lại, độ tái lập và độ thu hồi của phương pháp đạt yêu cầu theo AOAC Appendix F, 2016. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp là 5 mg/kg và 15 mg/kg, kết quả này tương đương với TCVN 13647:2023- Xác định các steroid bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) vừa mới ban hành.

Dựa trên quy trình đã tối ưu, đề tài đã tiến hành phân tích trên 10 mẫu có mặt trên thị trường, kết quả cho thấy có 2/10 mẫu có chứa glucocorticoid (cụ thể là prednisone, cortisone, hydrocortisone acetate và momethasone furoate) với hàm lượng từ 19-62 mg/kg. vi ABSTRACT The aim of this research is to develop an analytical method for simultaneous determination nine glucocorticoid compounds (prednisolone, prednisone, cortisone, betamethasone, dexamethasone, hydrocortisone acetate, triamcinolone acetonide, betamethasone 17-valerate and momethasone furoate) in cosmetic matrices by high performance liquid chromatography with diode-array detection (HPLC-DAD). Samples were extracted with methanol in a water bath for 10 min at 60oC, followed by adding methanol to 25 mL and shaking. Samples were kept in a freezer for 30 min and centrifuged.

The extracted solutions were filtrated before being injected to HPLC-DAD. The studied compounds were separated by reversed-phase chromatography with a water and acetonitrile gradient elution and detected with DAD detector at 240 nm. The method was validated in terms of linearity of working standard curve, specification, precision, limit of detection, limit of quantification and trueness. The analytical method proved to be linear in a range of 0.2-50 mg/L with determination coefficients (R2) over 0.

The repeatability, reproduccibility and recovery of the method were satisfactory by AOAC Appendix F, 2016. The limits of detection and quantification of the method were 5 mg/kg and 15 mg/kg, respectively. This result is similar with that by TCVN 13647:2023- Identification of steroids by high performance liquid chromatography (HPLC). The method was applied to the determination of glucocorticoids in ten real samples, showing that 2/10 samples contained glucocorticoids (namely prednisone, cortisone, hydrocortisone acetate and momethasone furoate) with concentrations from 19 to 62 mg/kg.

vii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của TS. Trần Thị Kiều Anh. Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ một công trình nào khác. Tác giả Đỗ Thị Ngọc Thanh viii MỤC LỤC NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ.

iii LỜI CẢM ƠN .iv TÓM TẮT LUẬN VĂN. v LỜI CAM ĐOAN .vii MỤC LỤC. viii DANH SÁCH BẢNG .xi DANH MỤC HÌNH. Tính cấp thiết của đề tài.

Mục đích nghiên cứu. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu. Ý nghĩa khoa học. Ý nghĩa thực tiễn.

Tổng quan về mỹ phẩm. Giới thiệu về mỹ phẩm. Một số qui định quản lý mỹ phẩm. Tổng quan về nhóm chất glucocorticoid (GC).

Đặc điểm, tính chất hóa lý của các glucocorticoid (GC). Tác dụng phụ không mong muốn. Sơ lược về hệ thống sắc ký lỏng. Khái niệm và nguyên tắc.

Pha tĩnh trong sắc ký lỏng. Pha động trong sắc ký lỏng. Một số thông số đặc trưng của quá trình sắc ký. Tình hình nghiên cứu các phương pháp định tính và định lượng GC trong và ngoài nước.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Hoá chất- dụng cụ và thiết bị. Hoá chất dùng cho xử lý mẫu và phân tích HPLC-DAD. Dụng cụ ,thiết bị.

Phương pháp nghiên cứu mẫu. Phương pháp khảo sát điều kiện phân tích. Phương pháp xử lý mẫu. Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích.

Khảo sát khoảng tuyến tính. Giới hạn phát hiện và Giới hạn định lượng. Áp dụng phân tích mẫu thực tế. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.

Tối ưu hoá các điều kiện phân tích sắc ký. Tối ưu cột phân tích. Xác định cực đại hấp thu chất phân tích với dectector DAD. Tối ưu dung môi pha động.

Tối ưu tỉ lệ thành phần pha động. Tối ưu thể tích tiêm mẫu. Tối ưu quy trình xử lý mẫu. Tối ưu dung môi chiết mẫu.

Tối ưu nhiệt độ chiết mẫu. Tối ưu thời gian chiết mẫu. Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp. Tính đặc hiệu của phương pháp.

Xây dựng đường chuẩn. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp. Độ lặp lại, độ tái lập và hiệu suất thu hồi của phương pháp. Xác định các Glucocorticoid trên các mẫu mỹ phẩm thu thập được.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. Hướng nghiên cứu tiếp theo của đề tài. 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 59 PHỤ LỤC A: SẮC KÝ ĐỒ CỦA DUNG DỊCH CHUẨN.

62 PHỤ LỤC B: CÁC KẾT QUẢ TÍNH TOÁN. 70 PHỤ LỤC C: KẾT QUẢ XÁC NHẬN GIÁ TRỊ SỬ DỤNG CỦA PHƯƠNG PHÁP 72 PHỤ LỤC D: KẾT QUẢ TÍNH TOÁN TRÊN NỀN MẪU THỰC. 99 xi DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1 Một số nội dung quản lý mỹ phẩm của Mỹ, Châu Âu, Nhật và ASEAN.2 Công thức phân tử, cấu trúc hoá học và tính chất lý hóa của các GC .3 Tính chất của một số pha động trong sắc ký lỏng .4 Một số phương pháp định tính và định lượng GC .1 Thông tin chất chuẩn sử dụng trong nghiên cứu .2 Các đại lượng đo và ý nghĩa .3 Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau .4 Độ thu hồi yêu cầu với từng khoảng hàm lượng .1 Thời gian lưu của các chuẩn khảo sát trên cột C18 và cột Phenyl Hexyl .2 Các chương trình gradient pha động tối ưu .3 Ảnh hưởng của thể tích tiêm đến chiều cao pic và diện tích pic .4 Chương trình gradient pha động .5 Ảnh hưởng của dung môi chiết mẫu đến hiệu suất thu hồi .6 Hiệu suất thu hồi của các GC với các nhiệt độ chiết khác nhau.7 Hiệu suất thu hồi của các GC với các thời gian chiết khác nhau .8 Thời gian lưu của các chuẩn và trên mẫu trắng thêm chuẩn .9 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính.10 Xác định IDL, IQL của thiết bị.11 Độ lặp lại và hiệu suất thu hồi của 5 nền mẫu thêm chuẩn tại LOD .12 Độ lặp lại, độ tái lập, hiệu suất thu hồi thêm chuẩn tại LOQ .