MỞ ĐẦU Hiện nay việc phát hiện nhanh các thông số an toàn thực phẩm; chỉ số môi trƣờng; các chỉ dấu sức khỏe bằng các bộ kit, que thử theo phƣơng pháp so màu, bằng cách thay đổi màu của chỉ thị để biết các thông tin về môi trƣờng, phát hiện các độc tố, các chất độc hại….đang đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau nhƣ: hóa học, thực phẩm, môi trƣờng, dƣợc phẩm, sinh học…Thực tế cho thấy thấy tính tiện dụng và các ứng dụng rộng rãi trong đời sống của cảm biến so màu. Đơn giản và phổ biến nhất, dễ sử dụng nhất là giấy pH dùng để xác định độ axit- bazơ của dung dịch; cao cấp hơn một chút là que thử 10 chỉ tiêu trong nƣớc tiểu (để kiểm tra pH, tỷ trọng, glucose, protein, nitrit…trong nƣớc tiểu). Cảm biến so màu còn ứng dụng trong kiểm tra an toàn thực phẩm nhƣ que thử hàn the trong thực phẩm nhƣ giò, bún, phở; hay bộ kit xét nghiệm sự có mặt của methanol trong rƣợu. Cao cấp nhất là các cảm biến so màu ứng dụng trong y tế nhƣ: que thử thai, kit kiểm tra sự có mặt của độc tố Alfatoxin trong thực phẩm; hay bộ kit thử kiểm tra HIV…Với việc chỉ quan sát màu sắc bằng mắt thƣờng mà không cần máy đo và cho kết quả nhanh nên cảm biến so màu đã và đang có vai trò rất quan trọng và phổ biến trong thời đại mới vì tính tiện dụng, nhanh chóng và sử dụng đơn giản.
Vì vậy, nhu cầu về các cảm biến đặc biệt là cảm biến so màu rất đa dạng để áp dụng trong thực phẩm, môi trƣờng, dƣợc phẩm, xét nghiệm bệnh tật. Tuy nhiên cảm biến so màu hóa học có tính chọn lọc không cao vì vậy để phát triển cảm biến có độ chọn lọc cao cần có các đầu thu sinh học, khi đó ta có cảm biến so màu sinh học. Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ và vật liệu nano đã cho ra đời các kết cấu vật liệu mới, với tính chất lý hóa, sinh học rất mới và có tiềm năng ứng dụng rất lớn. Các ứng dụng vật liệu nano bạc (nano Ag) có những tính chất hóa lý rất đáng quan tâm nhƣ: thay thế đƣợc enzym horseradish peroxidase (enzym HRP) cho phản ứng phân hủy H2O2; có pic hấp thụ đặc trƣng tại 420 nm đặc trƣng của nano Ag; có tính dẫn điện tốt và có hoạt tính điện hóa…Do đó việc phát triển các ứng dụng sâu hơn của chúng sẽ mở ra nhiều ứng dụng mới nhƣ thay thế các enzym nhƣ HRP; loại enzym có giá luan an 5 thành cao nhƣng có thời gian sống ngắn, điều kiện hoạt động nghiêm ngặt về nhiệt độ, pH, ánh sáng…) để sử dụng trong các bộ cảm biến sinh học nhằm chế tạo ra các cảm biến sinh học phát hiện các chỉ dấu sinh học (nhƣ hydrogen peroxide, cholesterol, glucozơ…) một cách nhanh, nhạy và rất chọn lọc với chi phí thấp và thời gian bảo quản dài hơn Các hạt nano kim loại quý, đặc biệt là hạt nano bạc(AgNP), đã thu hút đƣợc sự chú ý đáng kể do đặc tính quang học độc đáo và đặc trƣng của phổ plasmon bề mặt.
Phổ này sẽ bị thay đổi khi có các tác nhân tấn công sự tồn tại hoặc làm biến dạng hình học các hạt AgNPs và bằng mắt thƣờng cũng có thể quan sát đƣợc sự biến đổi này.Vì vậy thời gian gần đây có nhiều nghiên cứu ứng dụng các tính chất này để chế tạo cảm biến hóa học, sinh học. Tuy nhiên để đáp ứng cho các ứng dụng này thì AgNPs yêu cầu có độ sạch cao trong mẫu không có dƣ lƣợng sản phẩm phụ hoặc các sản phẩm phụ không ảnh hƣởng/ tƣơng tác với các chất trong hệ ứng dụng của AgNPs. Do đó các phƣơng pháp truyền thống tổng hợp AgNPs tỏ ra bị hạn chế khi sản xuất nano bạc cho các ứng dụng này. Để khắc phục hạn chế đó, tôi chọn đề tài: “Tổng hợp vật liệu nano bạc/chấm lượng tử graphen (AgNPs/GQDs) và ứng dụng”.
Trong công trình này, chúng tôi trình bày phƣơng pháp “xanh” để tổng hợp các hạt nano bạc (silver nanoparticles- AgNPs), trong đó điểm mới là sử dụng các hạt nano cacbon (hay chấm lƣợng tử graphen -GQDs) làm chất khử và đồng thời làm chất ổn định. Tiếp đó chúng tôi dùng AgNPs tổng hợp đƣợc để làm đầu dò đa chức năng để chế tạo cảm biến hydrogen peroxit (H2O2), tiếp đó, chúng tôi kết hợp cảm biến H2O2 và enzyme cholesterol oxidase (ChOx) để chế tạo cảm biến cholesterol theo phƣơng pháp so màu. Đây đều là các nội dung nghiên cứu mới và có ý nghĩa thực tiễn. luan an 6 CHƢƠNG 1.
CẢM BIẾN SINH HỌC, CẤU TRÚC, CÁC TÍNH CHẤT ĐẶC TRƢNG VÀ PHÂN LOẠI.Định nghĩa cảm biến sinh học. Hiệp hội quốc tế về hóa học ứng dụng – IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) năm 1992[1] đã định nghĩa: “Cảm biến sinh học (biosensor) là một thiết bị tích hợp có khả năng cung cấp thông tin phân tích định lượng hoặc bán định lượng đặc trưng, bao gồm một phần tử nhận biết sinh học (bioreceptor) kết hợp trực tiếp với một phần tử chuyển đổi tín hiệu (transducer)”. Chất đƣợc gắn trên bộ phận chuyển đổi đƣợc gọi là “phần tử dò/phần tử nhận biết sinh học”, chất cần phân tích trong mẫu đƣợc gọi là “phần tử đích”. Nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học là dựa trên các phản ứng đặc hiệu: kháng nguyên/kháng thể (cảm biến miễn dịch), lai hóa DNA-DNA(cảm biến DNA) hoặc enzym/cơ chất (cảm biến enzym)… Trên cơ sở các phản ứng đặc hiệu này, phần tử nhận biết sinh học giữ vai trò dò tìm đối tƣợng đích trong mẫu phân tích và phần tử chuyển đổi giữ vai trò chuyển đổi tƣơng tác sinh học thành tín hiệu điện hóa, quang, nhiệt… sau đó đƣa qua bộ phận xử lý tín hiệu và hiển thị kết quả đo (hình 1.
Nguyên lý cấu tạo của cảm biến sinh học[2] Có nhiều dạng chuyển đổi tín hiệu nhƣ chuyển đổi điện hóa, chuyển đổi quang, chuyển đổi nhiệt, chuyển đổi bằng tinh thể áp điện hoặc chuyển đổi bằng các hệ vi cơ… Trong đó, cảm biến sinh học trên cơ sở chuyển đổi theo luan an 7 nguyên lý điện hóa có nhiều khả năng ứng dụng trong phân tích các đối tƣợng y sinh vì độ nhạy tốt và có thể vi cấu trúc hóa để chuyển đổi thành các thiết bị cầm tay. Nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học điện hóa là chuyển các tín hiệu của phản ứng sinh hóa giữa phần tử nhận biết sinh học và phần tử đích trong dung dịch điện ly thành các tín hiệu đƣợc nhận biết bởi kỹ thuật điện hóa. Các kỹ thuật điện hóa có thể đƣợc sử dụng để đánh giá một cách định lƣợng (theo nồng độ) hoặc định tính (âm tính/dƣơng tính) sự có mặt của các thành phần sinh học (DNA hoặc kháng nguyên/kháng thể…) trong dung dịch. Có nhiều phƣơng pháp để đo tín hiệu điện hóa khi có sự tƣơng tác giữa đầu thu sinh học và chất cần phân tích nhƣ đo dòng, đo thế, đo độ dẫn và đo phổ tổng trở…[54].
Tuy nhiên, bên cạnh đó cảm biến sinh học điện hóa cũng có nhiều nhƣợc điểm nhƣ (i) cần thiết bị nghiên cứu đắt tiền (máy đo), và (ii) các điện cực để nghiên cứu cũng có chi phí cao, gia công phức tạp. Cấu trúc và thành phần của cảm biến sinh học 1. Đầu thu sinh học (capture probe) Cảm biến sinh học là khái niệm chỉ cảm biến mà có đầu thu là các phần tử sinh học (bio-receptors) nhƣ là enzyme, kháng thể (antibody), các chuỗi DNA hoặc RNA hoặc các chuỗi peptit hoặc protein dùng để phát hiện các chất cần phân tích. Quan hệ giữa đầu dò (probe) và đối tƣợng cần phát hiện (còn gọi là đích- target) chủ yếu gồm các nhóm chính nhƣ sau (hình 1.
Một số cảm biến enzyme đã đƣợc phát triển và ứng dụng[3-9]. Ví dụ với đầu dò enzyme glucose oxidase (GOx) dùng để phát hiện glucose ; enzyme cholesterol oxidase (ChOx) dùng để phát hiện cholesterol….Do cảm biến enzym rất nhạy, phản ứng nhanh và chọn lọc nên cảm biến enzyme còn đƣợc dùng trong việc khuếch đại tín hiệu để nâng cao giới hạn phát hiện cho các loại cảm biến khác; chẳng hạn phép phân tích sàng lọc ELISA dùng trong bệnh viện để xét nghiệm ung thƣ, bệnh tật hoặc các ca nhiễm độc bởi các chất độc hại nhƣ clozapine[10], phenolthiazines[11], rifampicin[12], thuốc trừ sâu, diệt cỏ[13]. Với ứng dụng này thì enzym thƣờng đƣợc dùng là loại enzym luan an 8 oxidase (chủ yếu là enzym horseradish peroxidase-HRP). Một kháng thể (antibody) sẽ liên kết một cách đặc hiệu với một đối tƣợng kháng nguyên (antigen) [14-19], tạo ra độ chọn lọc cao (tính đặc hiệu tốt) cho phép phân tích.
Cảm biến kiểu này dùng rất phổ biến với nhiều bộ kit đƣợc phát triển để phân tích các mẫu thực phẩm, nƣớc uống, bệnh phẩm…với tên gọi chung là bộ kit ELISA. Ví dụ bộ kit xét nghiệm là các chất độc hại nhƣ 2,4-D (chất độc màu da cam); các phụ gia trong sản xuất giấy gói có ảnh hƣởng đến sức khỏe nhƣ bisphenol A; các loại thuốc diệt cỏ, thuốc trừ sâu nhƣ atrazine hoặc các loại protein bệnh nhƣ virus cúm, bệnh ung thƣ… (a) Enzyme (b) Khángthể (Antibody) (c) DNA Hình 1. Các kiểu đầu thu sinh học phổ biến trong cảm biến sinh học. (iii) Nếu đầu dò là các đoạn DNA hay RNA hoặc axit nucleic peptide sẽ ứng dụng trong chế tạo các bộ cảm biến DNA hay RNA nhằm phát hiện ra các đoạn DNA hoặc RNA dùng trong các nghiên cứu sinh học xét nghiệm huyết thống bệnh tật, trong chuyển đổi gen.
Nguyên tắc hoạt động là các chuỗi này có quan hệ bổ sung (ghép cặp) rất nhạy và rất chọn lọc nên cảm biến loại này có độ nhạy cao và tính chọn lọc [16, 20-33]. Ngày nay, chủ yếu là oligodeoxyribonucleotides tổng hợp (ODNs) đƣợc sử dụng làm đầu dò trong cảm biến DNA. Các phần ghép thêm vào nhƣ đuôi thiol (-SH), amin (-NH2) hoặc biotin đƣợc kết hợp để cố định ODN trên bề mặt của cảm biến. Bộ phận chuyển đổi Hình 1.
Phân loại cảm biến trên cơ sở bộ phận chuyển đổi (transducer)[34] Bộ phận chuyển đổi trong các cảm biến sinh học là bộ phận chuyển đổi tín hiệu của việc bắt cặp nhau giữa đầu dò và đích thành các tín hiệu có thể đo đƣợc [1, 35, 36]. Tùy vào tín hiệu đầu ra (out put signal) mà chúng ta có thể gọi tên là cảm biến điện hóa hay cảm biến quang…Nhƣ tóm tắt ở hình 1.3, cảm biến sinh học có thể xây dựng trên một trong 5 loại bộ phận chuyển đổi tín sau đây: điện hóa (electrochemical), điện (electrical), quang (optical), cơ/áp điện (piezoelectric) hoặc nhiệt (thermal).